Abstract
Motstand mot TKI behandling er et stort hinder i effektiv behandling av NSCLC. Foruten EGFR mutasjonsstatus, hvilke mekanismer som er involvert er i stor grad ukjent. Noen bevis støtter en rolle for mikroRNA 21 i moduler narkotika følsomheten kjemoterapi, men dens rolle i NSCLC TKI motstand fremdeles uutforsket. Denne studien hadde som mål å undersøke om NSCLC MIR-21 mediert resistens mot TKI resulterer også fra PTEN målgruppe. Her viser vi MIR-21 fremmer kreft med negativt regulere PTEN uttrykk i humane NSCLC vev: høye MIR-21 uttrykk nivåer var assosiert med kortere DFS i 47 NSCLC pasienter; høye MIR-21 /lave PTEN uttrykk nivåer indikeres en dårlig TKI klinisk respons og kortere total overlevelse i en annen 46 NSCLC pasienter som gjennomgår TKI behandling.
In vitro
analyser viste at Mir-21 var oppregulert samtidig til nedregulering av PTEN i pc-9 /GR celler sammenlignet med pc-9 celler. Videre over-uttrykk for MIR-21 sunket betraktelig gefitinib følsomhet ved nedregule PTEN uttrykk og aktivering Akt og ERK stier i pc-9 celler, mens MIR-21 knockdown dramatisk restaurert gefitinib følsomheten pc-9 /GR celler ved opp- regulering av PTEN uttrykk og inaktivering av AKT og ERK stier,
in vivo Hotell og
in vitro
. Vi foreslår endring av MIR-21 /PTEN uttrykk som en ny mekanisme for TKI motstand i NSCLC kreft. Våre funn gir et nytt grunnlag for å bruke MIR 21 /PTEN-baserte terapeutiske strategier for å reversere gefitinib motstand i NSCLC
Citation. Shen H, Zhu F, Liu J, Xu T, Pei D, Wang R, et al. (2014) Endring i Mir-21 /PTEN Expression modulerer Gefitinib Resistance i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 9 (7): e103305. doi: 10,1371 /journal.pone.0103305
Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 04.03.2014; Godkjent: 27 juni 2014; Publisert: 24.07.2014
Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Data er inkludert i papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81101705 og 81272532), Jiangsuprovinsen kliniske vitenskap og teknologi prosjekter (klinisk forskningssenter, BL2012008) og Foundation Natural Science i Jiangsu-provinsen (BK2011852). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. [1] Dessverre, til tross for fremskritt i tidlig påvisning av kreft, de fleste pasienter med NSCLC er diagnostisert med avansert stadium sykdommen, noe som resulterer i dårlig prognose med en median overlevelse på bare 10-12 måneder. [2], [3] Utviklingen av legemidler som er rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), slik som EGFR-TKI (gefitinib og erlotinib) har forbedret effektiviteten av NSCLC behandling. Faktisk tilstedeværelse av aktiverende EGFR ekson mutasjoner spiller en nøkkelrolle i å forutsi den terapeutiske effekten av EGFR-TKI. [2] Disse aktiverende EGFR mutasjoner ofte betydelig korrelert med adenokarsinom-assosiert histologi, røykestatus, kjønn og etnisitet. [3] Dermed EGFR-TKI har blitt anbefalt som førstelinjebehandling for NSCLC pasienter med EGFR mutasjoner. Dessverre er deres kliniske effekten begrenset av utviklingen av ervervet resistens: de fleste pasienter som i utgangspunktet reagerer etter hvert skulle oppleve sykdomsprogresjon med kontinuerlig bruk av TKI i ca 9-11 måneder; [4] ca 50% av pasientene som i utgangspunktet svare på EGFR-TKI utvikler resistens mot EGFR-TKI, mens EGFR T790M mutasjon i exon20 står for 50% av dette ervervet resistens; [4] en annen 20% av TKI ervervet resistens resultater fra MET forsterkning. [2] Det er fortsatt uklart hvordan de resterende 30% av pasientene utvikler ervervet resistens.
mikroRNA (miRNA), kjent for egen undertrykke mRNA ved sammenkobling med 3′-utranslaterte område (UTR) av mRNA var vist seg å ha negativ modulere uttrykk for målrettede gener. [5], [6] Som gener regulatorer, miRNA regulerer om lag en tredjedel av gener og spiller viktige roller i cellulære funksjoner inkludert spredning, vekst, differensiering og apoptose. [7], [8] I de senere årene, den avgjørende rollen miRNAs i kreftutvikling er påvist. [9] Videre, noen mirnas funksjon som tumor suppressors
in vitro.
[10], [11] Derfor, over-uttrykk for slike miRNAs kan undertrykke target proteiner som fungerer som kreftfremkallende faktorer. [7], [12] I motsetning til kort interfererende RNA, mirnas antas å regulere den samme bane på flere nivåer. [10] MiR-21 er en viktig onkogene miRNA, nært knyttet til tumorvekst og metastasering. [13], [14] faktisk ekspresjon av MIR-21 ble vist å være assosiert med dårlig prognose og kjemo-følsomhet i colon adenocarcinoma. [15], [16] I tillegg er anti-MIR-21 trykkes cellevekst av brystkreft ved nedregulering av den antiapoptotic faktor, B-celle lymfom 2 (Bcl-2). [17], [18] Disse data, tatt sammen, støtter en viktig rolle forandres MIR-21 ekspresjon i løpet av tumorutvikling. Så vi undersøkt om Mir-21 modulerer TKI følsomhet i NSCLC pasienter også.
Vi fant at oppregulering av MIR-21 og nedregulering av PTEN i 47 NSCLC tumorvev sammenlignet med sine tilstøtende normalt vev, og at deres uttrykk nivåer negativt korrelert. MIR-21 uttrykk korrelert med kortere DFS i de 47 NSCLC pasienter. I tillegg er våre data viste en god korrelasjon mellom høye MIR-21 /lave PTEN uttrykk nivåer og dårlig TKI følsomhet med kort total overlevelse på 46 NSCLC pasienter som gjennomgår TKI behandling. Derfor har vi en hypotese om at endring av MIR-21-PTEN uttrykk modulerer TKI følsomhet i lungekreftceller. Vi fant ut at Mir-21 var oppregulert concomittantly med nedregulering av PTEN i pc-9 /GR celler sammenlignet med pc-9 celler,
in vitro
. Videre er over-ekspresjon av MIR-21 avtatt betydelig gefitinib følsomhet gjennom nedregulering av PTEN ekspresjon og aktivering av Akt og ERK trasé, mens knockdown av MIR-21 dramatisk gjenopprettet gefitinib følsomheten av PC-9 /GR-celler med opp-regulering PTEN uttrykk og inaktive AKT og ERK signalveier, både
in vivo Hotell og
in vitro
.
Materialer og metoder
Material
gefitinib var en slags gave fra Astrazeneca (Tocris, Storbritannia). Antistoffer mot PTEN, fosfor-ERK1 /2, fosfor-AKT (Ser-473), og total AKT ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mot ERK2 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (CA, USA). Antistoffer mot GAPDH ble hentet fra Kangcheng Company (Shanghai, Kina). Lipofectamine og TRIzol reagenser ble kjøpt fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). MiR-21 etterligner og MIR-21 hemmer ble levert av GenePharma (Shanghai, Kina). The High Capacity RNA-til cDNA Kit og Power SYBR Grønn PCR Master Mix ble kjøpt fra Applied Biosystems (Carlsbad, California). PC-9 cellelinjer ble kjøpt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina. PC-9 gefitinib resistente cellelinje (PC-9 /GR), som ble indusert ved framstilling av PC-9 celler til økende konsentrasjoner av gefitinib som tidligere rapportert [19], [20], ble vennligst gitt av Department of Oncology, Shanghai Lunge Hospital, Tongji University, Shanghai.
kliniske prøver
Koblede menneskelige NSCLC prøver (n = 47) og matchet normale grenser vevsprøver ble samlet fra pasienter som gjennomgår standard kirurgiske prosedyrer i First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu (Kina), med skriftlig informert samtykke fra pasientene. En del av hver vevsprøve ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen, mens den andre delen ble fiksert i formalin for histologisk undersøkelse.
Parafin innleiret prøver av pasienter med NSCLC (n = 46), som var mottar EGFR TKI behandling, ble samlet inn fra patologi avdeling i First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu (Kina), med skriftlig informert samtykke fra pasientene. Alle prøver ble histologisk klassifisert og gradert etter TNM stadium av en blindet klinisk patolog. Alle forsøksprotokoller ble godkjent av Institutional Review Committee for første tilknyttet sykehuset i Nanjing Medical University, Nanjing (Kina).
Cell kultur
Menneske pc-9 og pc-9 /GR celle linjer, og HEK293T-celler ble dyrket i RPMI og DMEM, henholdsvis, supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktig miljø inneholdende 5% CO
2 .
Cell transfeksjon
Hsa-MIR-21 eller HSA-MIR-NC ligner ble transfektert inn i PC-9 celler ved hjelp av lipofektamin reagens (Life Technologies), i henhold til produsentens instruksjoner. De endelige konsentrasjoner av HSA-MIR-21 eller HSA-MIR-NC ligner for transfeksjon var 40 nM. En lignende fremgangsmåte ble brukt til å transfektere MIR-21 inhibitor (40 nM) eller NC i PC-9 /GR celler.
Celleviabilitet analysen
PC-9 og PC-9 /GR celler ble sådd på 96-brønners plater i en tetthet på 4 x 10
3 celler /brønn og tillatt å holde seg over natten. Parallelt ble Pc-9-celler utsådd i 96-brønners plater og transfektert med MIR-21 etterligne og NC i 24 timer, mens pc-9 /GR-celler ble transfektert med MIR-21-inhibitor. Etter cellulær adhesjon, ble gefitinib tilsatt ved en sluttkonsentrasjon på 2,5 til 40 umol /L. Etter 72 timers inkubering ble celle levedyktighet vurderes ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories), i henhold til produsentens instruksjoner. Hver prøve ble belagt i tre eksemplarer og tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Lentiviral emballasje og stabil cellelinje etablering
Å stabilt knockdown MIR-21 uttrykk i pc-9 /GR celler, lentiviral emballasje kit (Thermo Fisher Scientific) ble anvendt. Lentivirus bærer MIR-21-hemmer eller negativ kontroll (MIR-NC) ble pakket etter produsentens anvisninger. Grønt fluorescerende protein (GFP) genet ble satt inn i pakkesystemet og ko-uttrykt med mirnas. Lentivirus ble pakket i HEK293T cellene og utskilt i mediet. Pc-9 /GR-celler ble infisert med lentivirus bærer MIR-21-inhibitor eller MIR-NC i nærvær av polybrene (Sigma-Aldrich), og valgt av puromycin (Sigma-Aldrich) i 2 uker for å oppnå pc-9 GR /mir -21 inhibitor og pC-9 GR /mir-NC stabile cellelinjer.
Apoptose assay
Apoptose ble målt som tidligere beskrevet [21]. I korthet ble cellene trypsinert og merket med Alexa Fluor 647 Annexin V (Biolegend) og 7-AAD (BD Pharmingen), og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Celler ble ansett apoptotisk da de var annexin V-positive og 7-AAD-negative.
RNA isolering og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) analyse
Totalt RNA ble ekstrahert fra dyrket celler eller prøver menneskelig vev ved hjelp TRIzol reagens i henhold til produsentens instruksjoner. For å måle MIR-21 uttrykk nivåer, ble RNA transkribert av stilk-løkke RT primer bruker PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) som tidligere beskrevet [21], [22]. Sekvensen av RT-primere var som følger: MIR-21-RT, 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCAACATC -3 «; U6-RT, 5»-TGGTGTCGTGGAGTCG-3 «. QRT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Premiks DimerEraser (Takara) på en 7900HT system (Applied Biosystems). MIR-21 qPCR primere var: forstand, 5»-ACACTCCAGCTGGG TAGCTTATCAGACTGA -3 «; anti-sense, 5’TGGTGTCGTGGAGTCG -3 «. U6 snRNA qPCR primere var: forstand, 5»-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 «; anti-sense, 5»-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 «. Ekspresjonen av MIR-21 ble normalisert til nivåer av U6 og sammenligningssyklus terskel metode (2
-ΔΔCT) ble anvendt med U6 som kontroll.
Protein ekstraksjon og western blotting
Celler eller vev ble høstet og lysert på is i 30 minutter i RIPA-buffer (Beyotime) supplementert med 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF). Lysates ble utsatt for Western blotting-analyse som beskrevet tidligere [23] og oppdaget med antistoffer mot PTEN, fosfor-AKT (Ser-473), total AKT, fosfor-ERK, total ERK, GAPDH.
Immunohistochemistry (IHC )
formalinfiksert, parafininnstøpte vev som er samlet fra pasienter med NSCLC (n = 46), ble delt i fem mikrometer, og inkubert med antistoffer mot PTEN (Cell Signaling Technology). Vurderingen av IHC signaler ble utført av to erfarne patologer i en blindet måte. Fem høy effekt felt (200 ×) ble tilfeldig valgt i hver prøve. Prosenter av tumorceller ble ordnet i fem semi-kvantitative klasser: 0 (≤5% positive celler), 1 (6% -25% positive celler), 2 (26% -50% positive celler), 3 (51% -75 % positive celler), og 4 ( 76% positive celler). Intensiteten av fargingen ble også semi-kvantitativt bestemt på en skala fra 0-3 på følgende måte: 0 (negativ), 1 (svakt positiv), 2 (moderat positiv), og 3 (sterkt positive). Produktene av prosent poeng ved intensiteten i farging ga endelige IHC score: 0 (negativ), + (1-4), ++ (5-8), og +++ (9-12) som tidligere beskrevet [24]
.
In situ hybridisering
ISH ble gjennomført på parafin innebygging prøver av NSCLC å undersøke klinisk respons på TKI og MIR-21 uttrykk. I korthet, ble objektglassene behandlet og hybridisert med 10 pmol probe (LNA-modifisert og DIG merket oligonukleotid; Exiqon) komplementært til MIR-21, i henhold til produsentens instruksjoner. Etter inkubasjon med anti-DIG-HRP Fab-fragmenter konjugert med pepperrot-peroksidase, ble den hybridiserte prober detektert ved inkubasjon med 3’3-diaminobenzidin løsning med kjerner motfarget med Carazzi haematoksylin. Fargemønstre ble analysert ved 3 eksperter og andelen av positivt fargede tumorceller ble gradert som følger: 0 (ingen positive celler), 1 ( 10% positive celler), 2 (10% -50% positive celler), 3 ( 50% positive celler). Celler ved hvert intensiteten av fargingen ble registrert på en skala fra 0 (ingen farging), 1 (svak farging, lys blå eller gul), 2 (moderat farging, blått eller gult), og 3 (sterk farging, mørk blå eller gul) . For svulster som viste heterogen flekker, ble den dominerende mønster anses for scoring. Fargingen indeks (SI) ble beregnet som andel av positivt fargede tumorceller x fargeintensitet. Ved hjelp av denne metoden, ble uttrykket av MIR-21 scoret som 0, 1, 2, 3, 4, 6 eller 9. Ved uenighet (poengsum avvik 1), lysbilder ble reexamined og en enighet ble nådd av eksperter .
Xenotransplantat tumormodell i nakne mus
For tumorvekst analyser, 6-ukers gammel mann naken mus (BALB /cA-v (nu /nu) ble kjøpt fra SLAC Animal Senter ( Shanghai, Kina), og holdes i spesielle patogenfrie (SPF) betingelser. Protokoller for dyreforsøk ble godkjent av Animal Welfare Committee of Nanjing Medical University. Porsjoner av celler (4 × 10
6) ble suspendert i 150 ul FBS-fritt RPMI DMEM medium og injisert subkutant inn i bakre flanke av nakne mus (n = 6). tumor~~POS=TRUNC størrelsen~~POS=HEADCOMP ble målt ved anvendelse av en verniercaliper hver syv dager før de ble avlivet på dag 35 etter implantasjon og tumorvolum ble avledet som 0,5 x lengde × bredde
2.
Statistisk analyse
Verdier ble oppnådd fra minst tre uavhengige eksperimenter og presentert som betyr ± SE. Elevens uparet
t
testen ble utført, og verdiene ble ansett som signifikant forskjellige når
P
. 0,05
Resultater
Up-regulering av MIR-21 og nedregulering av PTEN negativt korrelert med kortere DSF i tumorvev fra humane NSCLC
for å bestemme uttrykket nivåer av MIR-21 og PTEN proteiner i tumorvev fra humane NSCLC pasienter, vurderes vi 47 par av kreft vevsprøver og tilstøtende normale vev (tabell S1) med QRT-PCR og funnet en signifikant høyere ekspresjon av MIR-21 i 37/47 (78,7%) i tumorvev sammenlignet med tilstøtende normale vev (fig. 1A). Siden PTEN er en av de viktige målene for MIR-21, [25], [26] vi har undersøkt forholdet mellom ekspresjonen av MIR-21 og PTEN i human NSCLC eksemplarer både av immunblot og immunhistokjemi (IHC). Vi fant ut at PTEN protein nivåene ble betydelig redusert i 34/47 (72,3%) tumorvev sammenlignet med tilstøtende normale (Fig. 1B). I tillegg ble de relative ekspresjonsnivå av PTEN evaluert av to erfarne patologer på en blindet måte, og som er merket med endelig IHC score til 0 (negativ), + (svak), ++ (moderat) og +++ (sterk) (Fig. 1C ). Nivåer av MIR-21 ble redusert ved høy PTEN intensitet (Fig. 1 D). I tillegg spredningsplott analyse viste en invers korrelasjon mellom MIR-21 uttrykk nivåer og IHC score av PTEN-signaler (Fig. 1E). Disse resultatene viste at MIR-21-ekspresjonsnivåer ble inverst korrelert med PTEN-nivåer i NSCLC vev. For ytterligere å vurdere sammenhengen mellom MIR-21 /PTEN uttrykk nivåer og prognose hos NSCLC pasienter, brukte vi Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank test for å vurdere de normaliserte MIR-21 uttrykk nivåer (tumor /normal) og Sykdomsfri overlevelse ( DFS). Resultatene viste at pasienter med høye MIR-21 ekspresjonsnivåer hadde en kortere sykdomsfri overlevelse (DFS) sammenlignet med pasienter med lav MIR-21 ekspresjon (fig. 1F).
(A) ekspresjonsnivåer av speil 21 ble oppregulert i 37/47 par av NSCLC vev relativt til tilstøtende normale prøver. MiR-21 ble analysert ved hjelp av stammesløyfe QRT-PCR, og normalisert til nivåene av U6. Fold endringer ble oppnådd ved forholdet mellom MIR-21 overflod i kreftvevet til at i tilstøtende normale vev. *
p
0,05 indikerer signifikant forskjell sammenlikne MIR-21 uttrykk i tumorvev med tilstøtende normalt vev. (B) Representative PTEN proteinnivåer i NSCLC vev (T) og tilstøtende normale prøver (N) vurdert av immunblot, GAPDH ble anvendt som kontroll lasting. (C) PTEN Immunohistochemistry (IHC) resultatene av NSCLC seksjoner, 0 (negativ), + (svakt positiv), ++ (moderat positiv), og +++ (sterkt positiv). (D) korrelasjonsanalyse mellom PTEN protein nivåer og MIR-21 uttrykk nivåer i NSCLC vev. IHC score ble brukt for å beskrive PTEN protein nivåer i tumorvev, evaluert av erfarne patologer i en blindet måte. (E) lineær regresjon kurver av MIR-21 uttrykk og PTEN proteinnivåer. (F) Kaplan-Meier-kurver som viser Sykdomsfri overlevelse i henhold til uttrykk av MIR-21. Cutoff verdi av undergruppene (høye og lave) av MIR-21 uttrykk nivået var 50-persentil verdien.
Up-regulering av MIR-21 og nedregulering av PTEN protein er assosiert med dårlig TKI følsomhet og kortere total overlevelse i tumorvev på menneske NSCLC pasienter som gjennomgår TKI behandling
Tidligere studier har vist at Mir-21 induserer cisplatin motstand i NSCLC [27]. I tillegg, Wang et al. fant at MIR-214 regulerer ervervet resistens mot gefitinib via PTEN /AKT Pathway i EGFR-mutant cellelinjer [28]. Gitt den potensielle effekten av miRNA i modulerende medikament følsomhet, undersøkte vi om endring av MIR-21 /PTEN uttrykk korrelerer med TKI følsomhet. Etter oppfølging av klinisk behandling av de 47 NSCLC pasienter, fant vi bare fem pasienter som brukte TKI behandling. En pasient som viser en delvis respons (PR) viste MIR-21 uttrykk nivå (tumor /normal) på bare 0,16; tre pasienter med stabil sykdom (SD) vises gjennomsnitts MIR-21 uttrykk nivåer av 2,57; en pasient med en progressiv sykdom (PD) viste høy MIR-21 ekspresjon ved 33,15 (Fig. 2A). IHC analyser på vev oppnådd fra disse fem pasientene viste at PTEN ekspresjonsnivåer negativt korrelert med kliniske respons TKI: en PD pasient vev viste PTEN ekspresjon av (-); PTEN uttrykk i de gjenværende fire pasientene med PR og SD varierte fra (++) til (+++) (Fig. 2B). For ytterligere å bekrefte funnene våre, vi vurdert MIR-21 uttrykk nivåer ved hjelp av ISH analyser (Fig. 2D) og PTEN uttrykk nivåer av IHC på parafin innebygd prøver fra 46 NSCLC pasienter behandlet med TKI (gefitinib eller erlotinib) som behandling og oppfølging deres kliniske respons og overlevelse status (tabell S2). Som forventet, MIR-21 uttrykk nivåer i PD pasienter var betydelig høyere enn i PR og SD-grupper (Fig. 2C). Høyere MIR-21 uttrykk nivåer også indikert kortere total overlevelse i TKI behandlede pasienter (fig. 2E). I tillegg, PTEN uttrykk nivåer i PD-pasienter som var betydelig lavere enn i PR og SD pasientgrupper (fig. 2F), og høyere PTEN ekspresjon korrelerte med lengre total overlevelse i TKI behandlede pasienter (fig. 2G). Disse funnene er alle enige og foreslår involvering av høy MIR-21 /lav PTEN uttrykk i modulering av TKI følsomhet i NSCLC.
(A) Klinisk respons av TKI og MIR-21 uttrykk nivåer i 5 NSCLC pasienter evaluert av q-RT PCR. (B) Klinisk respons av TKI og PTEN uttrykk nivåer i 5 NSCLC pasienter testet av Immunohistochemistry. PR (delvis respons) og SD (stabil sykdom) pasienter hadde relativt lavere Mir-21 uttrykk nivåer og høyere PTEN uttrykk nivåer sammenlignet med PD (progressiv sykdom) pasienter. (*
p
0,05). (C) korrelasjonsanalyse utført mellom MIR-21 uttrykk nivåer og klinisk respons på TKI. (D) Representative MIR-21 nivåer og score i NSCLC vev gjennomgår TKI behandling evaluert ved in situ hybridisering. (E) Kaplan-Meier-kurver som viser total overlevelse i henhold til uttrykk av MIR-21 i 46 NSCLC pasienter som gjennomgår TKI behandling. (F) korrelasjonsanalyse utført mellom PTEN uttrykk nivåer og klinisk respons på TKI. (E) Kaplan-Meier-kurver som viser total overlevelse i henhold til uttrykk av PTEN i 46 NSCLC pasienter som gjennomgår TKI behandling.
PC9 /GR cellene vise betydelig motstand mot gefitinib, oppregulering av MIR-21, nedregulering av PTEN og aktivering av AKT, ERK sammenlignet med PC9 celler
for å teste om effekten av høy MIR-21 /lav PTEN uttrykk på modulering av TKI følsomhet, vi valgte pc-9, en TKI sensitive cellelinje, og gefitinib resistente cellelinje PC-9 /GR (vennlig levert av Department of Oncology, Shanghai Pulmonary Hospital, Tongji University, Shanghai) ble indusert ved framstilling av PC-9 cellers til økende konsentrasjoner av gefitinib som rapportert tidligere . [19], [20] Vi brukte CCK-8 analyse for å påvise gefitinib følsomhet i pc-9 og pc-9 GR celler og funnet ut at pc-9 GR celler var resistente mot gefitinib sammenlignet med pc-9 celler (Fig. 3A fig. 3B). IC50 for gefitinib i PC9 /GR cellene var omtrent 2,54 mikromol /L, 200times høyere enn i PC9 celler (0,0127 mikromol /L, P 0,001) (Fig. 3C). Etter 72 timer med en mikromol /L gefitinib behandling, brukte vi Flowcytometri å vurdere gefitinib indusert apoptose priser. Våre data viste apoptose prisene betydelig høyere i PC9 celler sammenlignet med PC9 /GR (15.04% vs 3,08%) (Fig. 3D). QRT-PCR data viste at Mir-21 var 3,70 ganger oppregulert i PC9 /GR celler sammenlignet med PC9 celler (Fig. 3E). Ved hjelp av western-blot analyser viste vi PTEN tap og aktivering av AKT og ERK i PC-9 GR celler sammenlignet med PC-9 celler, men ikke vise total AKT og total ERK uttrykk forskjell mellom de to cellelinjer (Fig. 3F, 3G).
(A, B) pc-9 og pc-9 /GR-celler ble behandlet med gefitinib i 72 timer i 0,1% serum-inneholdende RPMI. Celleveksten ble målt ved hjelp av CCK-8-analyse i tre eksemplarer. Cellevekst på 72 timer er plottet mot gefitinib konsentrasjon. (C) gefitinib IC 50 i pc-9 og pc-9 /GR celler med tredoble analyser utført. ** Indikerer p 0,01. (D) apoptose priser av pc-9 /GR og pc-9 celler indusert av gefitinib ble evaluert av flowcytometri. pc-9 /GR og pc-9 celler ble behandlet med 1 mikromol /L gefitinib i 72 timer før apoptose evaluering. (E) Relative uttrykk nivåer av MIR-21 i pc-9 og pc-9 /GR celler vurderes av stilk-løkke QRT-PCR, og normalisert til U6 nivåer. Triplikate bestemmelser ble utført for hver RNA-prøve. Signifikante forskjeller er angitt med * (P 0,05). (F) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, ERK proteiner i pc-9 og pc-9 /GR celler analysert ved Western blot. (G) Kvantifisering av western blot analyse viste at PTEN protein uttrykk ble redusert i PC-9 /GR celle sammenlignet med PC-9 celler ** P 0,01; p-AKT og p-ERK proteiner uttrykk var oppregulert i PC-9 GR celler sammenlignet med PC-9 celler ** P 0,01; Det var ingen signifikante forskjeller i total AKT og totale ERK proteiner mellom PC-9 og PC-9 /GR celler.
Forhøyet uttrykk for MIR-21 redusert gefitinib sensitivitet, forsterket invasiv evne og redusert gefitinib indusert apoptose i pc-9 celler ved å nedregulere PTEN og aktivere AKT og ERK trasé
Våre resultater er beskrevet ovenfor viste at Mir-21 ble oppregulert og PTEN ble nedregulert i PC-9 GR celler sammenlignet med PC-9 celler. Derfor hypotese vi at MIR-21 /PTEN uttrykk endring spiller en viktig rolle i moduler gefitinib følsomhet i pc-9 celler og pc-9 /GR celler. Vi transfektert pc-9 celler med MIR-21 etterligner og deretter co-transfekterte disse cellene med PTEN plasmid å observere om PTEN kunne redde MIR-21 induserte biologiske endringer i pc-9 celler. qPCR data bekreftet at Mir-21 uttrykk ble økt betydelig i Mir-21 ligne transfekterte celler sammenlignet med NC transfekterte celler, ** p 0,01 (Fig. 4A). Da vi brukte CCK-8 analysesett for å påvise følsomhet gefitinib 24 timer etter transfeksjon. Som forventet, MIR-21 gjorde redusere gefitinib følsomhet i pc-9 celler og over-uttrykk PTEN kan redde denne gefitinib følsomhet endringen. ** P 0,01 (Fig. 4B, 4C). Å observere andre parameter endringer etter MIR-21 transfeksjon, utførte vi en transwell analyse for å bestemme påvirkning av MIR-21 på invasiv evne. Vi fant ut at Mir-21 transfektert pc-9 celler var mer invasive enn NC gruppen og over-uttrykk PTEN kunne redde dette invasive evne ** p 0,01 (Fig. 4D, 4E). For å påvise virkningen av MIR-21 på gefitinib indusert apoptose, ble cellene som er beskrevet ovenfor, behandlet med 1 pmol /l gefitinib i 72 timer. Ved hjelp av flowcytometri, fant vi at i pc-9 celler, ble en markert nedgang i apoptose observert i Mir-21 ligne transfekterte celler sammenlignet med NC transfekterte celler og MIR-21 etterligne og PTEN plasmid co-transfekterte celler etter gefitinib behandling (fig. 4F). For bedre å forstå de molekylære mekanismene som er involvert i MIR-21 indusert gefitinib motstand i pc-9 celler, ble western-blot analyser brukes til å vurdere uttrykket av relaterte proteiner. I pc-9-celler, forhøyet ekspresjon av MIR-21 førte til undertrykkelse av PTEN ekspresjon og aktivering av p-AKT og p-ERK i sammenligning med NC-gruppen, men ikke endre totalt protein ekspresjon av AKT og EKR. Over-ekspresjon av PTEN uttrykk kunne berge opp-regulering av MIR-21 indusert aktivering av p-AKT og p-ERK. (Fig. 4G, 4H).
(A) Relative uttrykk nivåer av MIR-21 i pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler, pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfekterte celler ble vurdert av stilk-løkke QRT-PCR, og normalisert til U6 nivåer. Triplikate bestemmelser ble utført for hver RNA-prøve. Signifikante forskjeller er indikert med ** (P 0,01). (B) gefitinib følsomheten av pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler, pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfekterte celler ble evaluert av CCK-8 analyse. (C) IC50 for gefitinib i pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler, pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfektert celler. ** P 0,001, # P 0,01. (D) pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler, pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfekterte celler ble brukt for celle invasjon analyser. Invasion celler farget med 0,1% krystallfiolett ble talt 24 timer etter plating. Øvre paneler: representative bilder av invasive celler (× 200). (E) Antall invaderende celler pr felt ble oppnådd fra minst tre replikere brønner og representert ved gjennomsnitt ± SD (nederst graf). ** Indikerer signifikant forskjell mellom pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler (P 0,01). ## Indikerer signifikant forskjell mellom pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfektert celler (P 0,01). (F) apoptose priser av pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler, pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfekterte celler indusert av gefitinib ble evaluert av flowcytometri. Alle celler ble behandlet med 1 pmol /l gefitinib i 72 timer før apoptose evaluering. (G) PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK, og ERK proteiner av pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler, pc-9 /MIR-21 ligne + pCMV 6 transfekterte celler og pc-9 /speil 21 ligne + PTEN plasmid transfekterte celler ble analysert ved Western blot. (H) Kvantifisering av western blot analyse viste nedregulering av PTEN protein i PC-9/21 ligner + pCMV 6 transfekterte celler sammenlignet med PC-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler (* P 0,05) og pc-9 /MIR-21 ligne + PTEN plasmid transfektert celler (# P 0,05); p-AKT og p-ERK proteiner uttrykk var oppregulert i PC-9/21 ligner + pCMV 6 transfekterte celler sammenlignet med pc-9 /NC + pCMV 6 transfekterte celler (* P 0,05) og pc-9 /speil 21 ligne + PTEN plasmid transfektert celler (# P 0,05). Det var ingen signifikante forskjeller i total AKT og totale ERK proteiner blant de tre cellene.
knockdown av MIR-21 restaurert gefitinib følsomhet, redusert invasiv evne og forbedret gefitinib indusert apoptose i pc-9 /GR celler ved opp-regulerer PTEN og inaktivere AKK og ERK trasé
for ytterligere å bekrefte funksjonen av MIR-21 på gefitinib følsomhet regulering i pc-9 /GR celler, pc-9 /GR celler ble transfektert med Mir -21 inhibitor for å redusere MIR-21 uttrykk og deretter kotransfiserte disse cellene med PTEN siRNA. Vi testet først effekten av PTEN siRNA, transfektert vi pc-9 /GR celler med to PTEN sirnas og rykke siRNA (siSCR). Både WB og QRT-PCR-analyser viste at siPTEN # 1 kan redusere PTEN protein (fig. S1 A), og mRNA (Fig. S1B) uttrykk nivå mer effektivt enn siPTEN 2 #. Så vi valgte siPTEN # 1 til å gjøre ytterligere forsøk. qPCR resultatene bekreftet at Mir-21 uttrykk ble redusert betydelig i Mir-21 hemmer transfektert celler sammenlignet med NC celler, ** p 0,01 (Fig. 5A). CCK-8 assay data viste at Mir-21 knockdown betydelig redusert gefitinib følsomheten pc-9 /GR og redusert PTEN uttrykk nivå kan gjenopprette gefitinib følsomheten pc-9 /GR ** p 0,01 (Fig. 5B, 5C). Yang et al.
