Abstract
omprogrammering av energiomsetningen er avgjørende for kreft, så mitokondrier er potensielle mål for kreftbehandling. En tidligere studie har vist at anti-proliferative aktiviteten til en ny klasse av mitokondrier-målretting rosamines. Denne studien beskriver
in vitro
cytotoksisitet av andregenerasjons rosamine analoger, deres virkemåte, og deres
in vivo
efficacies i en svulst allografted musemodell. Her viste vi at disse forbindelsene viste potent cytotoksisitet (gjennomsnittlig IC
50 0,5 mm), hemmet Complex II og ATP syntase aktiviteter av mitokondrie oksidativ fosforylering sti og indusert tap av mitokondrie transmembrane potensial. En NCI-60 cellelinjer skjermen videre indikert at rosamine analoger 4 og 5 utstilt potente antiproliferative effekter med Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 mm), og var mer effektiv mot en tykktarmskreft underfelt enn andre cellelinjer. Foreløpige
in vivo
studier av 4T1 muse-brystcancer-bærende BALB /c-mus viste at behandling med analog 5 i en enkelt dosering av 5 mg /kg eller en tidsplan dosering av 3 mg /kg en gang hver 2. dag til 6 ganger (q2d x 6) oppviste bare minimal induksjon av tumorvekstforsinkelse. Våre resultater tyder på at rosamine analoger kan videreutvikles som mitokondrie målretting midler. Uten tvil riktige strategier må være utformet for å forbedre svulst opptak av rosamines, dvs. ved integrasjon til bærermolekyler for bedre terapeutisk utfall
Citation. Lim SH, Wu L, Kiew LV, Chung LY, Burgess K, Lee HB (2014) Rosamines Targeting Kreft oksidativ fosforylering Pathway. PLoS ONE 9 (3): e82934. doi: 10,1371 /journal.pone.0082934
Redaktør: Siyaram Pandey, University of Windsor, Canada
mottatt: 13. juni 2013, Godkjent: 30 oktober 2013; Publisert: 12 mars 2014
Copyright: © 2014 Lim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Cancer Research Initiatives Foundation, Malaysia Ministry of Higher Education HIR-Mohe tilskudd (UM.C /625/1 /HIR /Mohe /mED /17 og UM.C /625/1 /HIR /Mohe /mED /33), Universiti Malaya Post Graduate Research Grant (PS204 /2010b), og med tilskudd til KB fra National Institutes of Health (GM087981) og Robert A. Welch Foundation (A-1121). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Konvensjonell kjemoterapi mot kreft avhenger av legemidler som virker ved å forstyrre DNA replikasjon, dvs. ved å hemme syntesen eller funksjon av nye nucleic materialer, eller ved å forårsake uopprettelig skade på vitale nukleinsyrer gjennom innskyting, alkylering eller enzymatisk hemming. Mangel på selektivitet for neoplastiske celler utstilt ved disse stoffene begrenser vanligvis sin suksess som behandlingsmidler. Moderne kjemoterapeutiske strategier som er rettet mot signalveier eller bestemte genprodukter har en tendens til å være begrenset til kreft drevet av en dominant oncogen og er ofte utsatt for motstand via det store antall tumorgenese signalveier [1]. For eksempel, de fleste av HER-2 positive metastatisk brystkreft pasienter som initialt responderte på behandling med trastuzumab utvikle sekundær trastuzumab motstand innen et år etter behandlingen begynte [2]. Lignende observasjoner er gjort for BRAF-målrettet vemurafenib for melanom terapi [3] og EGFR-målrettet gefitinib eller erlotinib for behandling av ikke-småcellet lungekreft [4].
Et relativt nytt alternativ til målretting DNA og enzymer i raskt prolifererende celler, eller spesifikke signalveier er å fokusere på organeller som mitokondrier. Mitokondrier er energigeneratorer som opprettholder celle liv og viktige cellefunksjoner, inkludert flere signaleringskaskader som regulerer celler, for eksempel, metabolisme, cellesykluskontroll, utvikling, og celledød [5]. I kreft kjemoterapi, mitokondrier målretting narkotika forstyrre kreftcelle metabolisms av pertubing mitokondrie transmembrane potensial, hemme elektron redoks kjedekomplekser, forstyrrer mitokondriene trans permeabilitet, og målretting mitokondrie-DNA [6],. De vanligste typene av mitokondrier målretting legemidler er lipofile, kationiske legemidler; disse er selektive for kreftceller fordi de har en tendens til å ha høyere mitokondrie membran potensialene enn normale epitelceller [8], [9].
Vi har tidligere rapportert struktur-aktivitetsforhold (SARS) for kreft egenskaper av en serie rosamines (fig. 1A) [10], [11]. Disse forbindelsene er delokaliserte lipofile kationer (DLC) med perifere sykliske aminer og ulike grupper på
meso
posisjon; de fleste av disse kationer er vesentlig mer potente enn rhodamin-123, som er en godt studert delokalisert lipofile kation. Konsistens med dette, SAR data for rosamines foreslåtte gode potenser korrelerte med hydrofobe sykliske aminer og
meso
aryl substituenter. Thiofuryl og 4-jodfenyl
meso
substitusjon tilsvarte ca. 5 gangers forbedring i styrke sammenlignet med fenyl substitusjon. I tillegg viser dataene indikerte at vesentlig lavere IC
50-verdier ble oppnådd for usymmetriske forbindelser (X
en ikke samme som X
2), men kombinasjonen av usymmetriske amin-substituenter med thiofuryl og 4-jodfenyl
meso
erstatning ble ikke utforsket. Intracellulær bildebehandling på representative eksempler indikert disse forbindelsene akkumuleres i mitokondriene. Disse forbindelser (dvs. rosamine 2 og 5) er også funnet å være mer cytotoksisk mot kreftceller sammenlignet med immortaliserte normale epitelceller i samme organ typen [10].
(A) av de rosamine fargestoffer varierende funksjonalisert ved
meso
posisjon som tidligere rapportert av Lim et al. (Kreft narkotika 2009, 20: 461-468), de som vises her med
meso Anmeldelser – thiofuran eller 4-jodfenyl hadde superior kreft aktiviteter i cellulære analyser. (B) Andre generasjon målene omtalt i dette arbeidet
Forskningen rapportert her ble gjennomført for å undersøke hvordan to molekylære endringer påvirker Cytotoksisiteten i denne serien. (I) erstatning av
para
-iodo eller thiofuran grupper med andre
para
halogenid eller furan grupper; og, (ii) kombinasjon av thiofuryl og 4-jodfenyl
meso
substitusjon med piperidin /morfolin kombinasjoner. Således rapporterer vi syntesene av andre generasjons rosamines (fig. 1B) og deres Cytotoksisiteten i forhold til et panel av faste tumorcellelinjer. Forbindelser med lovende aktivitet, ble ytterligere evaluert i NCI-60 humane tumorcellelinjer skjerm. Valgte rosamines ble også undersøkt for deres effekt på cellulære redoks systemer og for effekter i en
in vivo
tumormodell.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller gjennomgått og godkjent av Dr. Haji Azizuddin Bin Haji Kamaruddin, Forsøksdyr Centre (LAC) Animal Care og bruk komité medisinske fakultet, Universitetet i Malaya (referansenummer FAR /14/07 /2010 /LSH). BALB /c mus i alderen 6-8 uker med en minimumsvekt på 17 g ble opprettholdt i et kontrollert miljø av 12 h lys-mørk sykluser med fri tilgang til mat (standard pellet diett kjøpt fra Altromin International, Lage, Tyskland) og renset vann. Hunnmus ble brukt fordi den hormonelle miljø essensielle for utvikling av implantert 4TI mus brystkreft ville være til stede.
Material
Minimum essensielt medium med Earls salt og L-glutamin, RPMI 1640 medium med L -glutamine, føtalt bovint serum, Pen-Strep (10 000 U /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin), trypsin 10 x ble levert av GIBCO, Invitrogen (Auckland, New Zealand). JC-en ble kjøpt fra Molecular Probes, Invitrogen (Oregon, USA). Dimetylsulfoksid (DMSO), saltsyre 37%, polyetylenglykol 400 (PEG 400) og 2-propanol ble kjøpt fra Merck (Hohenbrunn, Tyskland). Etylenglykol
bis plakater (aminoethylether) –
tetra
eddiksyre (EGTA), ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 3 – (
N
-morpholino) propansulfonsyregruppe (MOPS ), kaliumklorid, kaliumdihydrogenortofosfat, natriumklorid, natriumhydrogenkarbonat, dinatriumhydrogenfosfat vannfri ortofosfat, sukrose og Tris ble kjøpt Fisher Scientific (Leicestershire, UK). Tiazoyl blå tetrazoliumbromid (MTT) ble kjøpt fra Amresco (Ohio, USA). Saltløsning (0,9% natriumklorid) ble oppnådd fra Duopharma Sdn. Bhd. (Selangor, Malaysia). Karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) ble kjøpt fra Sigma (Steinheim, Tyskland). Proteinanalyse fargereagens Konsentratet ble oppnådd fra Bio-Rad Laboratories (California, USA). Kompleks I, kompleks II, ble Complex IV og ATP syntase enzymaktivitet mikroanalysesett kjøpt fra MitoSciences (Oregon, USA).
Syntese av Rosamine analoger
Rosamines ble syntetisert og renset som beskrevet tidligere [11]. Utgangsmaterialet av xanton ditriflate ble fremstilt i oppløsning ved triflation av fenolene, etterfulgt av animasjon av triflatet med piperidin for å gi symmetrisk sykliske aminer substitusjon (fig. 2A), eller ved trinnvis tilsetning av piperidin og morfolin for å gi usymmetrisk sykliske aminer substitusjon ( fig. 2B) [11]. Den resulterende 3,6-diamino-xanthen-9-on ble omsatt med organolitiumreagenser eller Grignard-reagenser for å gi de ønskede rosamine strukturer.
(A) Utgangsmaterialet av xanton ditriflate ble fremstilt i oppløsning ved triflation av fenoler, etterfulgt av animasjon av triflat med piperidine å gi symmetrisk sykliske aminer substitusjon eller; (B) ved trinnvis tilsetning av piperidin og morfolin for å gi usymmetrisk cykliske aminer substitusjon.
Generelt er et Grignard-reagens eller litium-reagens (1,0 mmol) ble tilsatt dråpevis i løpet av 1 minutt til en oppløsning av 0,2 mmol 3,6-diamino-xanthen-9-on i 5 ml THF ved 0 ° C. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 12 timer ved romtemperatur. Etter fullførelse av reaksjonen ble 2 ml av 2 M vandig HCl tilsatt, omrørt i 10 minutter for å stanse reaksjonen og fortynnet med 20 ml CH
2 Cl
2. Det organiske laget ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over vannfritt Na
2SO
4, og konsentrert under redusert trykk. Residuet ble renset ved flash-kromatografi (5% til 10% MeOH /CH
2 Cl
2) for å gi det rene produkt.
Spektrale data for de syntetiserte forbindelser er angitt her, bortsett fra syntesen og spektraldata for rosamines 1, 2 og 5 ble som tidligere rapportert [11]. De er oppkalt under på en måte som beskriver
meso-
substituenter og forutsetter at forbindelsen er symmetrisk med mindre annet er angitt.
4-bromobenzene Rosamine 3.
1H NMR (300 MHz, CDCh
3) δ 7,72 (d, 2H,
J
= 8.4 Hz), 7.27 til 7.21 (m, 4H), 7,09 (dd, 2H,
J
= 9,6, 2,6 Hz), 6,94 (d, 2H,
J
= 2,6 Hz), 3,74 til 3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);
13C NMR (75 MHz, CDCh
3) δ 158,1, 156,3, 155,0, 132,2, 131,6, 130,9, 130,5, 124,9, 115,0, 113,3, 97,4, 49,1, 25,9, 24,0; λ
max abs 570 nm, λ
max emiss 590 nm, ε 110800 M
-1 cm
-1, FWHM 38 nm, Φ 0,78 ± 0,02 i CH
2 Cl
2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)
+ C
29H
30BrN
2O 501,1542; funnet 501,1539.
4-klorbenzen Rosamine 4.
1 H NMR (300 MHz, CDCh
3) δ 7,56 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 7,30 (d, 2H,
J
= 8,4 Hz), 7,26 (d, 2H,
J
= 9,6 Hz), 7,09 (dd, 2H,
J
= 9,6, 2,4 Hz), 6,95 (d, 2H,
J
= 2,4 Hz), 3,74 til 3,70 (m, 8H), 1,74 (br, 12H);
13C NMR (125 MHz, CDCh
3) δ 158,1, 156,3, 155,1, 136,7, 131,6, 130,8, 130,1, 129,3, 115,0, 113,4, 97,5, 49,2, 25,9, 24,1; λ
max abs 570 nm, λ
max emiss 590 nm, ε 119100 M
-1 cm
-1, FWHM 38 nm, Φ 0,80 ± 0,02 i CH
2 Cl
2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)
+ C
29H
30ClN
2O 457,2047; funnet 457,2052.
Furan Rosamine 6.
1 H NMR (500 MHz, CDCh
3) δ 7,97 (d, 2H,
J
= 9,7 Hz), 7,92 til 7,91 (m, 1H), 7,18 (dd, 2H,
J
= 9,7, 2,6 Hz), 7.15 til 7.14 (m, 1H), 6,90 (d, 2H,
J
= 2,6 Hz), 6,82 til 6,81 (m, 1H), 3,74 til 3,72 (m, 8H), 1,76 (br, 12H);
13C NMR (125 MHz, CDCh
3) δ 158,2, 156,0, 147,3, 145,7, 142,2, 132,0, 120,5, 115,0, 113,3, 111,8, 97,5, 49,0, 25,9, 24,1; λ
max abs 592 nm, λ
max emiss 627 nm, ε 86900 M
-1 cm
-1, FWHM 105 nm, Φ 0,38 ± 0,01 i CH
2 Cl
2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)
+ C
27H
29N
2o
2 413,2229; funnet 413,2232.
usymmetrisk 4-Iodophenyl Rosamine 7.
1 H NMR (300 MHz, CDCh
3) δ 7,96 (d, 2H,
J
= 8,3 Hz), 7,35 til 7,29 (m, 2H), 7.17 til 7.9 (m, 6H), 3,88 (t, 4H,
J
= 4,7 Hz), 3,78 til 3,71 (m, 8H) , 1,77 (br, 6H);
13C NMR (75 MHz, CDCh
3) δ 158,6, 157,9, 156,9, 156,7, 155,9, 138,2, 131,9, 131,5, 131,1, 131,0, 115,5, 114,6, 114,0, 113,7, 98,6, 97,9, 97,1, 66,4, 49,5, 47,4, 26,1, 24,0; λ
max abs 565 nm, λ
max emiss 586 nm, ε 80900 M
-1 cm
-1, FWHM 39 nm, Φ 0,52 ± 0,02 i CH
2 Cl
2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)
+ C
28H
28in
2o
2 551,1195; funnet 551,1192.
usymmetrisk Thiofuryl Rosamine 8.
1 H NMR (500 MHz, CDCh
3) δ 7,69 (dd, 1H,
J
= 4,8, 1,4 Hz), 7,62 (d, 1H,
J
= 9,7 Hz), 7,59 (d, 1H,
J
= 9.7 Hz), 7.26 til 7.22 (m, 2H) , 7,19 (dd, 1H,
J
= 9,7, 2,5 Hz), 7,09 (dd, 1H,
J
= 9,7, 2,5 Hz), 7,00 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz), 6,90 (d, 1H,
J
= 2,5 Hz), 3,78 (t, 4H,
J
= 4,9 Hz), 3,68 til 3,65 (m , 8H), 1,67 (br, 6H);
13C NMR (75 MHz, CDCh
3) δ 158,1, 157,5, 156,6, 156,3, 149,8, 132,2, 132,0, 131,7, 130,6, 130,6 (to topper: 130.62, 130.56), 128,2, 115,2, 114,6, 114,3, 114,0, 97,8, 97,2, 66,2, 49,1, 47,2, 25,9, 23,9; λ
max abs 576 nm, λ
max emiss 599 nm, ε 87600 M
-1 cm
-1, FWHM 42 nm, Φ 0,30 ± 0,01 i CH
2 Cl
2; HRMS (ESI) m /z beregnet for (M-Cl)
+ C
26H
27N
2o
2S 431,1793; funnet 431,1795.
Cell Kultur og
In Vitro
celleviabilitet analysen
MCF-7 brystkreft og HCT-116 tykktarmskreft cellelinjer ble oppnådd fra American Tissue Culture Collection ( Virginia, USA) og holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS. HSC-2 munnhulen menneskelige plateepitel karsinom celler ble hentet fra Health Science Research Resources Bank (Japan). HK-en, en tidligere karakteriserte nasofaryngeale plateepitel karsinom celler [12] er en gave av professor Wong Y.C. fra Universitetet i Hong Kong. Begge cellelinjer ble dyrket i MEM-medium supplert med 10% FBS. For celleviabilitet analysen cellene ved 4000 celler /brønn i 80 ul medium ble inokulert i 96-brønners plater og fikk lov til å følge natten over. Cellene ble deretter behandlet med hver forbindelse i konsentrasjoner fra 0,001-10 mM som gir sluttvolum på 100 ul i hver brønn. Ved slutten av inkubasjonsperioden, 15 ul 5,0 mg /ml MTT i fosfatbufret saltvann (PBS) ble tilsatt og inkubert i 4 timer. Medium og overdreven MTT ble aspirert, og den resulterende formazan ble oppløst med 100 ul dimetylsulfoksyd. Absorbansen ble avlest ved 570 nm med SpectraMax M4 mikro spektrofotometer (Molecular Devices, CA).
NCI-60 humane tumorcellelinje Screen
NCI-60 celle panel screening ble utført av NCI /National Institutes of Health utviklings therapeutics program (Bethesda, USA). Denne plattformen muliggjør bestemmelse av veksthemmende profiler av testforbindelser på 60 forskjellige humane kreftcellelinjer, som representerer leukemi, melanom og kreft i lunge, kolon, sentralnervesystem, eggstokk, bryst, prostata, nyre og underpanelet. Sulforhodamin B-analysen ble brukt til å vurdere cytotoksisiteten til testmidlene i et panel av 60 cellelinjer [13]. I korte trekk ble humane tumorcellelinjer av kreft screening panel dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 5% FBS og 2 mM L-glutamin. For en typisk screening eksperiment ble cellene inokulert i 96-brønners mikrotiterplater i 100 mikroliter ved plette tettheter avhengig av doblingstiden i de enkelte cellelinjer. Etter inokulering celle, blir microtiter platene inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 og 100% relativ fuktighet i 24 timer. Etter inkubering ble alikvoter av 100 pl av forbindelsen ved forskjellige fortynninger tilsatt til de passende mikrotiterbrønner og ble ytterligere inkubert i 48 timer. Ved analysen endepunktet ble cellene fiksert med trikloreddiksyre, etterfulgt av Sulforhodamin B farging for cellulært protein-innhold. Sulforhodamin B Absorbansen ble avlest ved en bølgelengde på 515 nm som et mål på celletetthet.
Mitokondrier Isolering og vaskemiddel solubilisering
Funksjonelle mitokondrier ble isolert fra muselever ved differensiell sentrifugeringsmetoden [14]. I korthet ble en mus (~ 30 g) sultet over natten før de avlivet ved cervikal dislokasjon. Leveren ble høstet raskt og skyllet med iskald mitokondriene isolert buffer (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA /Tris, 0,2 M sukrose, pH 7,4) inntil blod-fri. Leveren ble deretter kuttet i små biter i et begerglass ved hjelp av saks samtidig i et isbad. Bufferen ble erstattet med 5 ml frisk buffer isolasjon og leveren ble homogenisert med en Polytron-probe (Ultra-Turrax T8, Ika-Werke, Tyskland) inntil jevn. Homogenatet ble sentrifugert ved 1000 g i 15 min ved 4 ° C. Pelleten ble kastet og supernatanten ble sentrifugert ved 12 000 g i 15 minutter ved 4 ° C for å pelletere mitokondriene. Mitokondriene ble vasket to ganger ved resuspendering i 4 volumer av isolasjonsbuffer inneholdende 1 x protease inhibitor cocktail. Konsentrasjonen av mitokondrie protein ble bestemt ved anvendelse av Bradford (Biorad proteinanalyse) -metoden. Mitokondriene ble frosset i 10 mg /ml porsjon ved -80 ° C.
vaskemiddel oppløsning av mitokondrienes proteinene ble utført før målingen av oksidativ fosforylering komplekser aktivitet. Mitokondrier ble fortynnet til 5,5 mg /ml med PBS og oppløst ved tilsetning av et 1/10-volum av vaskemiddel anordnet for å gi den endelige proteinkonsentrasjon på 5 mg /ml. Blandingen ble inkubert på is i 30 minutter og sentrifugert ved 17 000 g ved 4 ° C i 20 min. Supernatanten ble samlet og fortynnet til passende konsentrasjon for hver oksidativ fosforylering komplekser aktivitet.
Måling av oksidativ fosforylering Komplekser aktivitet
Målinger av mitokondrier oksidativ fosforylering aktiviteter for Complex I, II, IV og ATP- syntase ble utført ved hjelp av mikro immunocapture ELISA assay kit i henhold til deres respektive produsentens protokoller [15]. Generelt plate forhåndsbelagt med passende immunocapture antistoff ble inkubert med mitokondrier ekstrakt under anbefalte konsentrasjon for å tillate immobilisering av de respektive komplekser. Kompleksene ble målt ved tilsetning av substrater oppløsning blanding levert av settet og forbindelsen ble tilsatt ved konsentrasjon i området 0,01 til 10 uM i tre eksemplarer. Kontrollbrønner ble behandlet med kun 0,1% DMSO (v /v) og brønnene uten mitokondrier ekstrakt inkubering ble inkludert som referanse bakgrunn. Den kinetiske av komplekser aktivitet ble registrert med SpectraMax M4 mikro spektrofotometer leseren ved hjelp av de foreslåtte måleparametere.
JC-1 Analyse av mitokondriemembranen potensial
mitokondriemembranen potensialet ble målt på grunnlag av mulig -avhengig opphopning av den kationiske JC-1 fargestoff som resulterer i en forskyvning av fluorescensemisjon fra grønn (~525 nm) til rød (~590 nm) på grunn av dannelsen av J-aggregater [16]. Derfor er mitokondriell depolarisering indikert ved en reduksjon i den rød /grønn fluorescens intensitet forhold. I korthet ble cellene samlet og suspendert i 1 ml varm medier ved omtrent 1 x 10
6 celle /ml. I et kontrollrør, ble 1 pl av 50 mM CCCP tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 5 minutter. Deretter ble 10 ul av 200 pM JC-1 tilsatt til cellene og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Cellene ble vasket to ganger med varm PBS, resuspendert i 500 ul PBS og analysert på et FACSCalibur strømningscytometer ved bruk av 488 nm eksitasjon med 530/30 nm og 585/42 nm båndpass emisjonsfiltre.
In Vivo
Antitumor Effekt
Kreft allografts ble initiert ved subkutan injeksjon av 5 × 10
5 4T1 mus brystkreft i 0,1 ml RPMI 1640 medium i inguinal melkefettputer av mus [17]. Tumorvekst ble overvåket og behandlinger ble igangsatt da svulster nådd volum på ca 200 mm
3. For å vurdere tumorveksthemning, ble 4T1-tumorbærende mus randomisert i grupper med minst åtte dyr pr gruppe. Forbindelse 5 ble fremstilt ved 0,3 mg /ml i normalt saltvann og behandling ble administrert intravenøst ved 5 mg /kg på dag staging eller 3 mg /kg annenhver dag i seks behandlinger (q2dx6). For kontrollgruppen, ble normalt saltvann gitt. Den dyre vekter og tumor volum ble målt tre ganger ukentlig i 14 d. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av ligningen: (lengde x bredde
2) /2 og relativt tumorvolum (RTV) ble beregnet for hver tumorvolumet til enhver tid (V
T) mot tumorvolumet ved oppsetning dag (V
0) ved hjelp av ligningen: V
T /V
0. RTV– tidsprofilen for hver gruppe ble plottet, og tumorvekstforsinkelse i å oppnå et spesifisert antall doblinger i forhold til kontrollen ble bestemt [18], [19]. Resultatene ble uttrykt som median ± 95% konfidensintervall (n = 8).
Statistical Analysis
Statistisk signifikans ble utført ved hjelp av enveis ANOVA
post hoc
med Bonferroni test (SPSS 16.0, IBM Corporation, Armonk, NY) og forskjellen ble ansett som viktig når
P
. 0,05
diskusjon
Rosamine analoger
Resultater og p > Vårt tidligere undersøkelse indikerte strukturene
meso
substituert med 4-jodbenzen og 2 thiofuran 5 ble fem ganger mer aktiv enn fenyl substituert forbindelsen 1. Forbindelser 3, 4 og 6 ble syntetisert for å teste om
meso
-replacement med 4-brombenzen 3, 4-klorbenzen 4- eller 2-furyl 6 grupper vil påvirke anticanceraktivitet. I tillegg er fire-iodobenzene 7 eller 2-thiofuran
meso
substituenter 8
og Selge usymmetriske piperidine /morfin amin substituenter ble syntetisert og undersøkt. Rosamines 1-4 og 7 var ikke nevneverdig vannløselige, slik at de ble rekonstituert i DMSO ved 10 mM som behandling lager. Rosamines 5, 6 og 8 ble lett oppløst i vandige media i samme konsentrasjoner, så ble brukt uten DMSO.
In Vitro
Antitumor Effekt av Rosamine og NCI-60 Screen
in vitro
antitumoraktivitet av rosamines ble vurdert ved anvendelse av en 48 h-endepunkt cellenes levedyktighet methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse mot et panel av faste humane tumorcellelinjer inkludert bryst karsinom (MCF-7), tykktarm karsinom (HCT-116), muntlig plateepitelkarsinom (HSC-2) og nasofaryngeal karsinom (HK-1). IC
50 Verdiene for disse rosamines på tvers av panelet av kreftcellelinjer testet varierte 0,07 til 1,2 pM som oppsummert i tabell 1. Fra denne studien, rosamines bærer fenyl halogenid- eller heterocykliske grupper var signifikant (
P
0,05) mer potent enn fenylsubstituerte rosamine 1. Halogen substitusjon resulterte i forbedring av cytotoksisitet; dette var ventet fordi substitusjon av
H
av halogen er vanlig å øke sammensatte lipofilitet som forbedrer lipid-dobbeltmembranen permeabilitet [20]. Innenfor halogenid serie, Cytotoksisiteten øker i følgende rekkefølge: 4 3 2 (Cl Br I), selv om det ikke er statistisk signifikant (
P
0,05). Forbindelsene med
meso
-heterocykliske substituenter 5 og 6 var mer potent enn de aromatiske halogenider 2-4. Av de to forbindelsene med
meso
-heterocycles den thiofuran-substituert 5 var litt mer aktiv enn 6, furan-substituerte en.
Forbindelser 7 og 8 har en mer polar kombinasjon av amin-substituenter enn den symmetriske
bis
piperidin 2, og de viste seg å være mer cytotoksisk (tabell 1). Dette er i overensstemmelse med våre tidligere data for 2-methylbenzenes usymmetrisk substituert med piperidin og morfolin som viste nesten to ganger lavere IC
50-verdier, sammenlignet med den symmetriske hydrofobe struktur som inneholder bare piperidin [10]. I mellomtiden for
meso
-thiofuran 5, substitusjon av en av de piperidingrupper med morfolin gir 8, som har en litt
redusert
aktivitet, i motsetning til våre forventninger.
Rosamines kan fremvise fototoksisitet på grunn av generering av reaktive oksygenarter i nærvær av lys. For å teste for dette, ble en duplikat plate bestråles med 5,3 J /cm
2 av bredspektret lys i 2 timer etter behandling med forbindelsen i parallell med en plate holdt i mørket. Det var ingen signifikante forskjeller i IC
50 verdiene oppnådd mellom begge bestrålte og ikke-bestrålte eksperimenter (data ikke vist) indikerer fototoksisitet ble ikke et problem.
På bakgrunn av funnene ovenfor, rosamines 4 ( NSC751819) og 5 (NSC751817) ble sendt inn for NCI-60 humane tumorcellelinjer skjermen for å gi mer informasjon om veksthemmende profiler mot 60 forskjellige humane kreftcellelinjer, som representerer leukemi, melanom og kreft i lunge, tykktarm, sentralnervesystem , eggstokk, bryst, prostata, og renal underpanelet. Denne plattformen gjør at virknings å utledes ved å sammenligne med narkotika-aktivitet mønstre av standard midler med kjente rettet mot egenskaper ved hjelp Sammenlign (datastyrt mønstergjenkjenning algoritme) analyser [21]. GI
50-verdier generert fra NCI-60 cellelinjer skjermen indikerte at både rosamine 4 og 5 viste potente antiproliferative effekter med Log
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 mm) og var spesielt mer effektive mot et underfelt kolorektale cancercellelinjer (fig. 3). SAMMENLIGN analyser indikerte at begge disse rosamines hadde lignende mønstre av aktivitet med metyl fiolett (NSC271967), en kationisk triarylmethane fargestoff som er tidligere brukt i medisin for sin antimikrobielle, soppdrepende og antihelminitiske egenskaper. Denne klassen av fargestoffer som hadde blitt vist å fremme mitokondrielle åndedrettshemming ved å inhibere ATP-syntese, avgimitokondriemembranpotensialet og indusering av mitokondriell permeabilitet overgang [22], [23]. Dermed NCI-60 cellelinjer skjermen angitte forbindelser testet, hadde en signatur som er unik for energiomsetningen målretting cytostatika.
GI
50 (50% veksthemming) gjennomsnitts grafer som viser aktivitetsmønstre 4, 5 og metyl fiolett (NSC271967) i NCI-60 cellelinje skjermer. Både rosamines utstilt potente antiproliferative effekter Logg
10GI
50 = -7 (GI
50 = 0,1 mm) og var spesielt mer effektiv mot tykktarmskreft panel. SAMMENLIGN analyser indikerte 4 og 5 har lignende mønster av aktivitet som metyl fiolett med Pearson korrelasjonskoeffisient verdier av 0,767 og 0,72 hhv.
Rosamines forstyrret Energy Redox
Vi har tidligere demonstrert at rosamines hovedsakelig lokalisere i mitokondriene [10], og at akkumulering av cytotoksiske DLC er kjent for å endre mitokondrielle transmembranpotensialer [24], [25]. Således ble forandringer av mitokondriemembranpotensialet som skyldes rosamines 2 og 5 overvåkes basert på akkumulering av potensiell avhengig JC-1 fargestoff som resulterte i en forskyvning av fluorescensemisjon fra grønn (~525 nm) til rød (~590 nm) på grunn til dannelse av J-aggregater. Fra studien, HSC-2-celler som ble behandlet med 2 ved 0,1 uM, 9% av cellepopulasjonen viste utbruddet av mitokondriell transmembrane mulig tap innen 1 time etter behandling og gradvis økt til 19% (
P
0,05) i 8 h (fig. 4). I mellomtiden, mitokondrie trans potensielle tapet var mer fremtredende i HSC-2 celler behandlet med 5 til 0,1 mikrometer. Omtrent 21% (
P
0,05) av cellepopulasjonen var påvirket i den første timen og den prosentvise økt drastisk til 34% i 8 timer. For de ubehandlede kontrollceller, befolkningen i depolariserte celler 8 h holdt seg på ca 8%. I mellomtiden ble cellene behandlet med 5 uM av CCCP i 5 minutter resulterte i tap av membranpotensialet i 70% (
P
0,05) av cellepopulasjon. CCCP er en oksydativ fosforylering dekopling middel som virker som en positiv kontroll til eksperimentet.
Representative tilfelle av mitokondriell transmembrane mulig tap HSC-2-celler som ble behandlet med 2 og 5 ved 0,1 uM. Etter 8 h av behandling med 2 og 5, prosentandel av cellepopulasjonen med mitokondriell transmembrane potensielle tap øket til 19% og 34%, respektivt. Prosentandelen depolarisert celle av ubehandlet kontroll til 8 timer forblir på 8%, mens for en positiv kontroll, celler behandlet med 5 uM av karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) i 5 minutter resulterer i 70% depolarisert celle-populasjon. * Forskjellen med
P
-verdi. 0,05 sammenlignet med kontrollen ved 0 h
For ytterligere å forstå mitokondriene hemming kjennetegnet av rosamines, deres effekt på oksidativ fosforylering veien ble undersøkt . Bruke immunocapture ELISA mikro analysen, ble enzymkinetikk av mitokondrie redoks bærere Complex I, Complex II, Kompleks IV og ATP-syntase overvåkes ved behandling med 2 eller 5. Aktiviteten Complex II (Fig. 5B) ble delvis hemmet av fem med IC
50 verdi på 9,6 ± 0,1 uM, mens for 2, ble det observert hemming men nådde ikke 50% opp til maksimale konsentrasjoner studert. I mellomtiden, både 2 og 5 viste inhibisjon av ATP-syntase-aktivitet (fig. 5D) med IC henholdsvis 50 verdier på 3,9 ± 0,3 uM og 3,0 ± 0,8 uM
. Aktiviteten av komplekset I og IV-komplekset (Fig. 5A og 5C) ble ikke påvirket av rosamines ved konsentrasjoner opp til det maksimale som brukes, 10 uM. Disse dataene antyder at rosamines 2 eller 5 kompromiss mitokondrielle bioenergi primært ved å hemme ATP syntase, et proton-drevet enzym som produserer ATP fra ADP og uorganisk fosfat. Lignende biokjemiske interaksjon ble observert i rhodamin-123, og denne effekten er forventet som forbindelsen har nær strukturell likhet med de rosamines [26].
Dose-respons-inhibering av mitokondriell oksidativ fosforylering kompleks 1 (A), Integrert
