Abstract
Vi har nylig belyst en roman funksjon for CD82 i E-cadherin-mediert homocellular vedheft; på grunn av denne funksjonen, kan det hemme kreft celle dissosiasjon fra den primære kreft reir og begrense metastasering. Effekten av CD82 på selektin ligand-mediert adhesjon heterocellular ennå ikke er klarlagt. I denne studien har vi fokusert på effektene av metastase suppressor CD82 /KAI1 på heterocellular adhesjon av kreftceller til endotelet av blodkar for å ytterligere belyse funksjon tetraspanins. Den over-ekspresjon av CD82 i kreftceller førte til inhibering av eksperimentelt indusert lungemetastaser i mus og betydelig hemmet adhesjonen av disse cellene til humane umbilikalvene epitelceller (HUVECs)
in vitro
. Forbehandling av cellene med funksjons perturbere antistoffer mot SLE
a /x signifikant hemmet adhesjonen av CD82-negative celler til HUVECs. I tillegg kan celler som over-uttrykker CD82 viste redusert ekspresjon av SLE
a /x i forhold til CD82-negative villtype-celler. Betydelig nedregulering av ST3 β-galaktosid α-2, 3-sialyltransferase 4 (ST3GAL4) ble oppdaget av cDNA microarray, real-time PCR, og western blotting analyser. Knockdown av
ST3GAL4
på CD82-negative villtype celler hemmet uttrykk for SLE
x og redusert celle adhesjon til HUVECs. Vi konkluderte med at CD82 senker SLE
a /x uttrykk via den nedregulering av
ST3GAL4
ekspresjon og derved reduserer adhesjonen av kreftceller til blodkar, noe som fører til en hemming av metastaser.
Citation: Yoshihama N, Yamaguchi K, Chigita S, gruve M, Abe M, Ishii K, et al. (2015) A Novel Funksjon CD82 /KAI1 i sialyl Lewis Antigen-mediert adhesjon av kreftceller: Bevis for en anti-metastaser Effect av nedregulering av sialyl Lewis antigener. PLoS ONE 10 (4): e0124743. doi: 10,1371 /journal.pone.0124743
Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Sør-Korea
mottatt: 24 desember 2014; Godkjent: 03.03.2015; Publisert: 29 april 2015
Copyright: © 2015 Yoshihama et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research (Kåken nr 23390465) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan (for å T. Sugiura). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
metastaser er en multistep fenomen preget av migrasjon av tumorceller fra deres primære stedet, invasjon av verts blod eller lymfekar, såing av fjerne organer, og den påfølgende utvikling av metastatiske svulster. Ekstravasasjonen av maligne celler involverer interaksjon av P- og E-selektin, som er celleadhesjonsmolekyler som finnes på overflaten av endoteliske cellene som kler blodkarene, med de tilsvarende karbohydrat ligander som forekommer på overflaten av ondartede celler [1]. Flere molekylære arter av karbohydrat ligander for selectins uttrykkes på kreftceller, inkludert sialyl Lewis X (SLE
x) og sialyl Lewis A (SLE
a). Mange kliniske studier har rapportert at uttrykket av SLE
x og SLE
en på kreftcelleslimstoffer er direkte korrelert med metastaser, tumorprogresjon og dårlig prognose [2,3], og det er kjent at uttrykket av Sle
x /a er vesentlig styrket i solide svulster. Men den molekylære mekanismen som ligger under regulering av SLE
x /a i kreftceller er ikke godt forstått.
Tetraspanins, eller TM4SF proteiner, utgjør en stor gruppe transmembrane proteiner som forekommer på celleoverflaten, noe som kan danner komplekser med membranreseptorer så som integriner. Noen tetraspanin-familieproteiner har blitt rapportert å spille en spesielt viktig rolle i tumorcellemetastase [4,5]. CD82 /KAI1, et medlem av superfamilien tetraspanin, ble først identifisert som en T-celletilbehør molekyl [6] og deretter identifisert i et genetisk skjerm for cancer metastase suppressor-gener [7]. I maligne solide tumorer, uttrykket av CD82 /KAI1 korrelerer sterkt med en bedre prognose for kreftpasienter, mens dens nedregulering er ofte funnet i klinisk avansert kreft. Disse dataene tyder på at CD82 /KAI1 er en suppressor av invasjon og metastasering av ulike typer solide svulster. [8,9]. I samsvar med disse observasjonene, har det ofte blitt iakttatt at ekspresjon av CD82 er inverst korrelert med den invasive og metastatiske potensiale av kreft i bryst, blære, tykktarm, cervix, mage- og tarmkanalen, hud, lunge, prostata, pankreas, lever, og skjoldbruskkjertel [10-13]. CD82 regulerer celle aggregering, cellemotilitet, kreft metastase, og apoptose [14]. Vi har rapportert at CD82 stabiliserer E-cadherin-β-catenin komplekser ved å hemme β-catenin tyrosinfosforylering. Denne funksjonen styrker homocellular vedheft av kreftceller og hindrer kreftceller fra rømmer fra primær reir [15]. Omvendt, når tumorceller invadere blod eller lymfekar, er heterofile intercellulær adhesjon mellom tumorceller og endotelceller på fartøyene kreves som det innledende trinn av metastaser til fjerntliggende organer. Sialyl Lewis-antigener på kreftcellene er involvert i adhesjonen til selektin i endotelceller i fartøyene [16]. Effekten av CD82 på selektin ligand-mediert celleadhesjon er ennå ikke klarlagt.
Vi her undersøkte effekten av den metastase suppressor CD82 /KAI1 på prosessen med heterocellular adhesjon av tumorceller til endothelium av blodkar, for ytterligere å belyse funksjonen av tetraspanins. Vi først vist at sialyl Lewis antigen syntese er regulert av en CD82 /KAI1-mediert system, og deretter undersøkt effekten av denne mekanismen på kreftcelle metastase i en mus metastase modell.
Materialer og Metoder
antistoffer og reagenser
Mus monoklonale antistoffer (G-2) og kanin polyklonale antistoffer (C-16) mot KAI1 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA). Følgende funksjons perturbing antistoffer ble brukt: anti- SLE
x (mus, monoklonalt) og anti-SLE
a (mus, monoklonale) antistoffer, som ble hentet fra Santa Cruz Biotechnology og MILLIPORE (Temecula, CA, USA), henholdsvis, samt et mus monoklonalt antistoff mot integrin β1, som ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO, USA).
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
Den humane cellelinje h1299 (en ikke-småcellet lungekreft-cellelinje) og dens transfektant-cellelinjer, h1299 /Zeo og h1299 /CD82, ble etablert i vårt laboratorium ved hjelp av transfeksjon av en styre vektor eller CD82 cDNA, respektivt, og en celle-sortering basert klon seleksjonsteknikk, som tidligere beskrevet [14]. Cellene ble dyrket ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Sigma), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; ICN Biomedicals, Aurora, OH, USA) og 2 mM L-glutamin.
De to cellelinjene anvendt i denne studien, h1299 /Zeo og h1299 /CD82, er blitt beskrevet tidligere [10]. h1299 /Zeo er en mock transfekterte cellelinje som viser svak CD82 uttrykk, mens h1299 /CD82 celler over-express CD82 følgende cDNA transfeksjon. Immunblotting-analyse viste at nivået av CD82-protein i h1299 /CD82-celler var 20 ganger høyere enn i villtype eller h1299 /rekke spesiel celler, mens strømningscytometri viste at celleoverflatenivået av CD82 i h1299 /CD82-celler var ca. 9- ganger større enn villtype eller h1299 /rekke spesiel celler.
Dyr og metastase analysen
Åtte uker gamle kvinnelige atymiske nakne mus (BALBc cAJcl-nu) ble kjøpt fra Kyudo (Fukuoka , Japan). Musene ble plassert i laminær skap under spesifikke patogen-frie forhold og matet autoklaveres vann og dietter i anlegg som er godkjent av Kyushu University. Hvert skap inneholdt 1-4 mus for eksperimentell gruppering. Dyret eksperimentelle protokollene ble godkjent av Animal Care og bruk komité Kyushu University (Permit Number: A23-13-1).
For de eksperimentelle lungemetastase studier, 1,0 × 10
6 celler eller kjøretøy (PBS) kun ble injisert via halevenen. Mus ble tilfeldig delt inn i følgende 4 grupper: (a) ingen behandling (kontroll: injisert med PBS bare), (B) h1299, (C) h1299 /Zeo, og (D) h1299 /CD82. Hver gruppe inneholdt minst tre mus (totalt 20 mus ble anvendt). Åtte uker etter injeksjonen, ble musene avlivet ved administrasjon av pentobarbiturate (100-120 mg /kg) for å minimalisere lidelser og lungene ble høstet. Lungemetastaser ble talt om de kunne ses med det blotte øye som tidligere beskrevet [15].
immunoblotanalyse
Cellelysater for immunoblotting ble utarbeidet i cellelyse buffer (1% Triton X -100, 2 mM natrium ortovanadat, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /ml aprotinin, 1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl pH 7,2). Cellelysatene ble oppløst ved SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og inkubert med spesifikke primære antistoffer. Proteinbånd ble visualisert ved hjelp av pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer og forbedret kjemiluminescens-reagens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Båndene ble skannet av datastøttet densitometry (ChemiDoc XRS-J, Bio-Rad) og analysert ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad) som beskrevet tidligere [14, 15]
Fluorescent merking av levende celler. og celle adhesjon analysen
Levende h1299 cellene ble merket ved hjelp Vybrant Dio og gjorde celle-merkingsløsninger (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
for å kvantifisere tumorcelle adhesjon til humane umbilikalvene epitelceller (HUVECs), ble en standard statisk adhesjon analyse utført som beskrevet tidligere [17]. HUVECs (1,5 x 10
4-celler) ble plassert i 96-brønners mikrotiterplater forhåndsbelagt med 0,1% gelatin (Sigma) og dyrket i lav glukose DMEM med 20% FBS og 0,1 mikrogram /ml basic-FGF til 2 -3 dager å etablere konfluent HUVEC monolag. Fluorescensmerkede h1299 celler (4,0 × 10
4 celler /brønn) ble lagt til endothelial monolaget og lov til å følge ved 37 ° C i 30 min.
For å undersøke effekten av funksjons perturbing antistoffer på adhesjonen av kreftceller til HUVEC monolaget, h1299-celler ble forbehandlet med 5 ug /ml av de funksjons perturbere antistoffer ved 37 ° C i 30 minutter, og ble deretter brukt til HUVEC monolaget.
brønnene ble vasket 3 ganger med fosfatbufret saltvann (PBS), og cellene fiksert med metanol i 15 minutter ved romtemperatur. De adherente celler ble kvantifisert under et lysmikroskop ved hjelp av en høy effekt felt (x 200). For hver av de triplo forsøk ble antall celler i 5 tilfeldig valgte felter bestemt, og tellinger ble beregnet.
Transfeksjon av kort hårnål RNA (sh RNA)
Cultured h1299 /CD82 og h1299 /rekke spesiel celler ble transfektert hjelp Lipofectamine (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den h1299 /CD82-sh. kontroll- og h1299 /CD82-sh.CD82 cellelinjer ble generert ved transfeksjon av h1299 /CD82 celler med pLKO.1-puro kontroll Vector (Sigma) og pLKO.1-puro /sh.CD82: NM_002231 (Sigma), henholdsvis [ ,,,0],18]. Den h1299 /Zeo-sh.control og h1299 /Zeo-sh.ST3GAL4 cellelinjer ble generert av Lipofectamine transfeksjon av h1299 /rekke spesiel celler med pLKO.1-puro Kontroll Vector og pLKO.1-puro sh.ST3GAL4: NM_06081105 (Sigma), respektivt. Kolonier som utviser resistens overfor puromycin (Sigma) fra de enkelte transfeksjon forsøk ble samlet. Ekspresjonsnivået av CD82 og ST3GAL4 i shRNA transfekterte h1299 celler ble overvåket ved hjelp av RT-PCR og immunblotting. Disse cellene ble opprettholdt i DMEM inneholder 10% FBS og 2 mg /ml puromycin.
DNA microarray
Total RNA ble ekstrahert fra h1299 /Zeo og h1299 /CD82 celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNA microarray hybridisering og skanning ble utført av Affymetrix (Santa Clara, CA, USA), ved hjelp av Affymetrix genet chip HG-U133A plus2.0. GCRMA i Bioconductor (https://www.bioconductor.org) ble brukt for sonde analyse og normalisering av microarray data.
Statistisk analyse (Student
t
-test) og en fold endringer filter ( 3,0) (h1299 /CD82 vs. h1299 /Zeo) ble utført sekvensielt å velge de betydelige gener. Bruk av genet definisjonen funksjonen ble alle transferaser som regulerer sialyl Lewis antigener identifisert og er oppført i tabell 1 og 2.
Sanntids revers transkriptase (RT) -polymerase kjedereaksjon (PCR )
Total RNA ble ekstrahert fra h1299 celler ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og brukes for første tråd cDNA syntese. De mRNA nivåer ble kvantifisert i tre eksemplarer ved hjelp av en real-time PCR system med Brilliant SYBR Grønn qPCR Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) som beskrevet tidligere [18]. De spesifikke primere for glykosyltransferase var som følger: (
ST3GAL1
: 5′-GCATAACGCCCATATAGAT-3 «og 5′-AAGGCTCTGACTGCTCTGT-3»;
ST3GAL2
: 5′-CTGGATGCTGGGACCTAC-3 «og 5»-GCTACTTGGAAGGCTGAGG-3 «;
ST3GAL3
: 5′-TCCTGGACGCACAATATC-3′ og 5′-GGTCTGAAGACTCCTGTGTA-3 «;
ST3GAL4
: 5′-AGTAGAAAACAACCCAGACAC-3′ og 5′- -AGAGGTTGAGAATCCGAA-3 «, og
ST3GAL5
: 5′-TGCCTCAGTTCACCCTCA-3 «og 5′-TGGTGGTGTTTGTGTGCTG-3»
PCR sykkelforholdene var 10 min ved 95 ° C i 1. syklus etterfulgt av 45 sykluser hver på 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 72 ° C i 60 sek. amplikonene er bekreftet at signaler som er unike ved dissosiasjon kurve analyser. ekspresjonsnivåer for hver prøve, erholdt fra parallell assays, ble normalisert til de av genet som koder glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) og ble analysert ved anvendelse av LightCycler2.0 System software-pakke (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA).
Resultater
Ektopisk uttrykk for CD82 hemmer lungemetastaser hos mus
i det første forsøket, fikk vi bekreftet det metastase-hemmende effekt av CD82 som tidligere har blitt rapportert ved bruk av en dyremetastasemodell [17]. For den eksperimentelle lungemetastase studier, injiserte vi h1299 celler inn i halevenen til åtte uker gamle hunn atymiske nakne mus. Åtte uker etter injeksjon, ble eventuelle metastaser observert og telles visuelt. CD82 viste en sterk hemmende virkning på størrelsen og antallet lungemetastaser foci (figur 1). Spesielt mus transfektert med h1299 /rekke spesiel celler viste 100% lungemetastase (7/7), mens CD82 transfektanter, h1299 /CD82, viste en betydelig hemming av metastasering, med en metastase hastighet på bare 28,5% (2/7). Gitt at den metastase hastighet lunge reflekterer direkte omfanget av cellulær adhesjon til lunge blodkar, foreslo dette resultat at CD82 spiller en viktig rolle i cellulær adhesjon til blodkar.
halevenen til nakne mus ble injisert med 1,0 × 10
6 h1299 /Zeo eller h1299 /CD82 celler. Åtte uker etter injeksjon, ble musene drept og lungene utvinnes. Metastatiske foci ble talt ved øyet. Injeksjon av h1299 /rekke spesiel celler resulterte i 100% lungemetastase (7/7), mens h1299 /CD82 celler viste en betydelig lavere rate av metastaser (28,5%; 2/7).
Ektopisk ekspresjon av CD82 inhiberer tumorcelle adhesjon til HUVECs via sialyl Lewis-antigener
adhesjon av cancerceller til blodkarene involverer interaksjon av P- og E-selektin på epitelcellene i blodårene med den tilsvarende SLE
x og SLE
et karbohydrat ligander på overflaten av kreftceller [12]. Vi analyserte effekten av CD82 på celleadhesjon til blodårene ved hjelp av en tidligere beskrevet celleadhesjon analyse i HUVECs [11]. Det ble tidligere bekreftet at HUVECs uttrykke både P- og E-selektin [11]. Vi observerte at ca 65% av de lastede h1299 /rekke spesiel celler festet til den HUVEC monolaget. Omvendt, h1299 /CD82 celler viste signifikant mindre celle adhesjon, med bare 6,6% tilslutning til HUVEC monolaget (fig 2A og 2B). Forbehandling med funksjons perturbing antistoffer mot SLE
x, SLE
a, eller ß1 inte hemmet h1299 /Zeo vedheft til HUVECs med 9,4%, 8,4% og 30,2%, henholdsvis (figur 2C). I motsetning til funksjons perturbing antistoffer mot SLE
x /a viste ingen signifikant hemming av h1299 /CD82 celle adhesjon til HUVECs. Disse resultatene sterkt antydet en hemmende rolle for CD82 i sialyl Lewis-mediert cellulær vedheft.
fluorescensmerkede h1299 /Zeo eller h1299 /CD82 celler (4,0 × 10
4 celler /brønn) ble anvendt på en HUVEC monolagskultur og tillates å overholde ved 37 ° C. Levd celler ble kvantifisert etter 30 min. Klebet h1299 /Zeo (A) og h1299 /CD82 (B) celler og virkningen av funksjons perturbere antistoffer på celleadhesjon til HUVEC monolaget ble analysert (C). h1299 celler ble forbehandlet med 5 ug /ml av de angitte antistoffer, og deretter påført på HUVEC monolaget. Forsøk ble utført in triplo, og antallet celler ble adherert i gjennomsnitt. Linjene indikerer standardavviket.
Ektopisk uttrykk for CD82 reduserer sialyl Lewis syntese
uttrykk for sialyl Lewis antigener på h1299 celler ble analysert ved immunoblotting (fig 3). Sle
a ble påvist som band som tilsvarer ca 97, 125 og 200 kDa, og dens uttrykk nivå var 5-8 ganger høyere hos h1299 /rekke spesiel celler enn i h1299 /CD82 celler (figur 3A). Tilsvarende ble uttrykket av SLE
x proteiner oppdaget på ca 90, 125, og 200 kDa, og var 5-8 ganger høyere hos h1299 /rekke spesiel celler enn i h1299 /CD82 celler (figur 3B). Disse funnene var i samsvar med resultatene av HUVEC vedheft analysen
Hele cellelysater (200 mikrogram) av h1299 celler (h1299 /Zeo, Zeo,. H1299 /CD82, CD82, h1299 /CD82-sh.control , sh.cont, h1299 /CD82-sh.CD82, sh.CD82) ble løst med 7,5% SDS-PAGE og analysert ved immunoblotting med anti-SLE
a (A) eller anti-SLE
x (B ) antistoffer. De samme blotter ble strippet og re-analysert for β-actin som en lasting kontroll. Forsøkene ble gjentatt i tre eksemplarer, og de mest representative data er vist.
Videre transfektert vi h1299 /CD82 celler med CD82 shRNA å bekrefte om denne nedregulering av sialyl Lewis antigener er en direkte effekt av ektopisk uttrykk for CD82.
CD82
shRNA fullstendig hemmet CD82 uttrykk (Fig 3C), og samtidig produksjon av SLE
a og SLE
x gjenvinnes til uttrykket nivåer observert i h1299 /rekke spesiel celler.
Ektopisk uttrykk for CD82 reduserer mRNA nivåer av glykosyltransferase gener relatert til sialyl Lewis syntese
for å undersøke mekanismer for nedregulering av sialyl Lewis antigener av CD82, utførte vi en global DNA microarray analyse av mulige regulatorer av sialyl Lewis antigener (alle transferaser). Som vist i tabell 1, CD82 markert nedregulert (0,05 ganger endring) uttrykk for
ST3GAL4 product: (understreket i tabell 1). I kontrast, ble uttrykket av gener som koder for andre grupper av glycosyltransferases og sukker transporter grupper ikke markert forandret.
Vi neste undersøkte effekten av CD82 på mRNA og proteinnivåer ST3GALs ved hjelp av real time PCR (fig 4) og immunoblotting (fig 5), henholdsvis. Ektopisk uttrykk for CD82 hadde ingen effekt på uttrykk for ST3GALs, bortsett fra en markant nedgang i
ST3GAL4
mRNA og proteinnivåer.
Total RNA ble isolert fra h1299 celler og analysert ved real -Tid RT-PCR. mRNA-nivåene av glykosyltransferase-kodende gener
(ST3GALs)
ble korrigert i forhold til nivåene av
GAPDH mRNA
, med h1299 /Zeo satt til 1. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM.
Hele cellelysater (300 mikrogram) av h1299 celler (h1299 /Zeo, Zeo, h1299 /CD82, CD82, h1299 /CD82-sh.control, sh.cont, h1299 /CD82-sh.CD82 , sh.CD82) ble oppløst ved 10% SDS-PAGE og analysert ved immunblotting med anti-ST3Gal primære antistoffer. De samme blotter ble strippet og re-analysert for β-aktin og CD82. Forsøkene ble gjentatt i tre eksemplarer, og de mest representative data er vist.
Vi har også vurdert om reduksjon av
ST3GAL4
i h1299 /CD82 celler var en CD82-spesifikk hendelse ved hjelp CD82 knockdown. Etter knockdown av CD82, proteinnivået ST3GAL4 restituert til nivået som ble observert i h1299 /rekke spesiel celler.
ST3GAL4
shRNA reduserer SLEX produksjon
For å undersøke om ned- regulering av ST3GAL4 reduserer produksjonen av SLEX, vi slått ned
ST3GAL4
av stabil transfeksjon av
ST3GAL4
shRNA. Uttrykket av
ST3GAL4
ble spesielt redusert med shRNA både mRNA og proteinnivåer (Fig 6A og 6B). Proteininnholdet av SLE
x ble betydelig redusert i h1299 /rekke spesiel shST3GAL4 celler (0,3-fold av h1299 /Zeo sh.cont). I kontrast, proteinnivået SLE
a viste ingen signifikant forskjell mellom h1299 /rekke spesiel-sh.cont celler og h1299 /Zeo-sh.ST3GAL4 celler. Oppdagelsen av at ST3GAL4 reduserer spesielt SLE
x proteinproduksjon antydet at SLE
x produksjonen ble nedregulert av CD82 uttrykk via
ST3GAL4
nedregulering (Fig 7A og 7B).
A. Total RNA ble isolert fra h1299 celler og analysert ved hjelp av sanntids-RT-PCR. mRNA-nivåene av
ST3GALs
ble korrigert i forhold til nivåene av β-aktin mRNA, med de av h1299 /Zeo satt til 1. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM. B. Hele cellelysater (300 mikrogram) av h1299 celler (h1299 /Zeo, Zeo, h1299 /CD82, CD82, h1299 /Zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4, h1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) var oppløses ved 10% SDS-PAGE og analysert ved immunblotting med anti-ST3GAL4 primære antistoffer. De samme Blottene ble strippet og re-probet for β-aktin. Forsøkene ble gjentatt i tre eksemplarer, og de mest representative data er vist
(A) Hele cellelysater (300 mikrogram) av h1299 celler (h1299 /Zeo, Zeo,. H1299 /CD82, CD82, h1299 /zeo-sh.ST3GAL4, sh.ST3GAL4, h1299 /Zeo-sh.control, sh.cont) ble løst ved 10% SDS-PAGE og analysert ved immunoblotting med anti-SLE
en eller anti-SLE
x antistoffer. De samme blotter ble strippet og re-analysert for β-actin som en lasting kontroll. Forsøkene ble gjentatt 3 ganger, og de mest representative data er vist. (B) Densitometrisk analyse ble utført på (A), etterfulgt av normalisering til den densitometriske verdien av β-actin og angitt som «Relativ ekspresjon verdi (β-catenin /β-aktin)». Relative uttrykk verdier fra 3 individuelle eksperimenter ble i gjennomsnitt. Linjene indikerer standardavviket.
ST3GAL4
shRNA hemmer celle adhesjon til HUVECs
Til slutt undersøkte vi effekten av shRNA-mediert nedregulering av
ST3GAL4
på celle adhesjon til HUVECs. Cellen vedheft til HUVECs viste ca 50% hemming av vill type h1299 /rekke spesiel celler etter
ST3GAL4
knockdown. Men den hemming nivå av h1299 /rekke spesiel shST3GAL4 celler ikke nå at av h1299 /CD82 (90% hemming av h1299 /Zeo, fig 8).
fluorescensmerkede h1299 /Zeo, h1299 /CD82, h1299 /Zeo-sh.ST3GAL4 og h1299 /rekke spesiel-sh.control celler (4,0 × 10
4 celler /brønn) ble anvendt på en HUVEC enlagskultur og lov til å følge ved 37 ° C. Levd celler ble kvantifisert etter 30 min. h1299 celler festet til den HUVEC monolaget ble analysert. Forsøk ble utført in triplo, og antallet celler ble adherert i gjennomsnitt. Linjene indikerer standardavviket.
Diskusjoner
CD82 /KAI1 har blitt rapportert å ha anti-metastatiske egenskaper og har tidligere blitt bekreftet å være en suppressor av metastasering. Vi har tidligere vist en roman funksjon av CD82 i E-cadherin-mediert homofilist intercellulær adhesjon [15]. I denne studien undersøkte vi effekten av CD82 på heterofile cellulær adhesjon til blod eller lymfekar, som er det første trinnet av metastaser til fjerntliggende organer; og demonstrerte romanen regulerende rolle CD82 i sialyl Lewis avhengig cellulær vedheft. I
in vivo
metastase-analyse viste CD82 en sterk hemmende virkning på størrelsen og antallet lungemetastaser foci (figur 1) som følge av direkte injeksjon av kreftceller i musehalevenen. Således våre resultater at sterkt hemmende rolle for CD82 i adhesjonen av kreftceller til vaskulære endotelceller.
sialyl Lewis-antigener som er involvert i det første trinn av kreft celleadhesjon til blodkar [16]. Mange kliniske studier har rapportert at uttrykket av SLE
x og SLE
en på kreftcelleslimstoffer korrelerer direkte med metastaser, tumorprogresjon og dårlig prognose [2,3]. Når den første adhesjon via sialyl Lewis-antigener er etablert, oppstår integrin-mediert adhesjon [19]. Vi har vist at tilsetning av et anti-integrin-antistoff bare delvis hemmet adhesjonen av kreftceller til HUVECs, noe som tyder på at den initielle sialyl Lewis-antigen-mediert adhesjon er essensiell for kreftcelle adhesjon til blodkar (figur 2). Ektopisk uttrykk for CD82 nedregulert syntesen av SLE
a /x (fig 3), som støtter resultatene av HUVEC vedheft analysen.
biosyntesebanen av SLE
a og SLE
x er avhengig av en rekke forskjellige enzymer, som katalyserer overføringen av sialinsyre og fucose til oligosakkarid-sidekjeder av glykokonjugater. Kort,
N
-acetyllactosamine (GlcNAc) β1 oligosakkarid er syntetisert av GlcNAc transferaser. Basert på GlcNAc β1 oligo underlag, β1, 3-galactosyltransferases (β3Gal-Ts) syntetisere a1 → 3 disakkarider (type 1-kjeder) og β1, 4-galactosyltransferases (β4Gal-Ts) syntetisere a1 → 4 disakkarider (type 2 kjeder). Sialyltransferase (ST) som hører til
ST3Gal
familien inneholder 6 underfamilier av enzymer. Blant disse, til ST3Gal3 sialylates type 1-kjedene produsere SLE
a, mens ST3Gal4 og -6 er pålagt å sialylate type 2 kjettinger for SLE
x produksjon.
Sekvensiell tillegg av α1, 4-tilknyttet fucose til type 1 kjeder og α1, 3-tilknyttet fucose til type 2 kjeder av fucosyltransferase (FUTs) sluttfører biosyntesen av SLE
a og SLE
x, henholdsvis. Uttrykket av SLE
a og SLE
x er assosiert med kreftutvikling og tumorprogresjon. Uttrykk for
ST Hotell og
FUT
gener som koder for enzymer som er nødvendige for biosyntesen av disse antigenene er også korrelert med disse ondartede tegn. Økt mRNA nivåer av
ST Hotell og
Fut
finnes i flere typer ondartede svulster.
ST3GAL3
uttrykk hos pasienter med brystkreft var sterkt assosiert med dårlig prognose og redusert total overlevelse [20]. Tilsvarende økt uttrykk av
ST3GAL4 Hotell og
FUT4
ble rapportert i kolorektal karsinom [21]. Derimot er nedregulering av
ST3GAL4
har blitt observert i kolorektal kreft vev og human nyrecellekreft [22,23]. I magekreft, uttrykket nivåer av
ST3GAL3 Hotell og
FUT4
mRNA ble betydelig forbedret i carcinoma vev [24]. Videre uttrykk for
FUT4 Hotell og
FUT7
mRNA var relatert til dårlig prognose i lungekreftpasienter [25], og den økte aktiviteten til α1,3 /4-FUTs ble observert i eggstokkene carcinoma sammenlignet med friskt vev [26] Chandrasekaran et al., 1992 EV Chandrasekaran, R.K. Jain og K.L. Matta, Eggstokkreft alfa 1,3-L-fucosyltransferase. Differensiering av forskjellige katalytiske forbindelser med den unike substratet, 3′-sulfo-N-acetyllactosamine i kombinasjon med andre syntetiske akseptorer,
J Biol Chem
267 (1992), s. 23806-23814. Vis Record i Scopus Sitert av i Scopus (26). Disse rapportene tyder på at rollene som
ST Hotell og
FUT
forskjellig i ulike krefttyper
in vivo
.
I vår modell CD82 ned- betydelig regulert (0,05 ganger endring) uttrykk for
ST3GAL4
. I motsetning til dette ble ekspresjonen av andre grupper av glycosyltransferases og sukker transportørgrupper ikke merkbart endret seg. Knockdown av
CD82
mRNA ved shRNA i h1299 /CD82 celler resulterte i utvinningen av
ST3GAL4
uttrykk og syntese av SLE
a /x, noe som tyder på at CD82 har spesifikke effekter på
ST3GAL4
uttrykk.
Som nevnt ovenfor,
ST3GAL4
syntetiserer vanligvis bare SLE
x og vår
ST3GAL4
knockdown studien viste resultatene indikerer en bestemt ned -regulation SLE
x i h1299 /Zeo shST3GAL4 celler. I kontrast, ektopisk uttrykk av CD82 redusert syntese av SLE
a og SLE
x, samtidig. Denne type avvik har blitt rapportert tidligere. Den enzymatiske aktiviteten til ST3GAL4 rekombinant protein var effektive for både type 1 og type 2 disakkarider
in vitro
, mens
in vivo
, var det eneste effektive for type 2-substrater [27] Sasaki et al ., 1993 K. Sasaki, E. Watanabe, K. Kawashima, S. Sekine, T. Dohi og M. Oshima
et al
., Expression kloning av en roman Gal beta (1-3 /1- 4) GlcNAc alpha 2,3-sialyltransferase hjelp lektin motstand utvalg,
J Biol Chem
268 (1993), s. 22782-22787. Vis Record i Scopus
