Abstract
Blokkering av androgen reseptor (AR) aktivitet er det viktigste målet med terapi for avansert prostatakreft (PCA). Men tilbakefall med en mer aggressiv, hormon ildfast PCa oppstår, som havner restaurert AR aktivitet. En mekanisme slik reaktive skjer gjennom kjøp av AR mutasjoner som gjør sin aktivering av ulike steroide og ikke-steroide strukturer. Således, naturlige og kjemiske forbindelser som bidrar til upassende (androgen-uavhengig) aktivering av AR blitt et område med intensiv forskning. Her viser vi at genistein, binder en soya phytoestrogen til både vill og Thr877Ala (T877A) mutante typer AR konkurransedyktig med androgen likevel utøver det en pleiotropisk effekt på PCa celleproliferasjon og AR aktivitet avhengig av mutasjonsstatus for AR. Genistein hemmet, i en doseavhengig måte, celleproliferasjon og AR nukleære lokaliserings og ekspresjon i LAPC-4-celler som har vill AR. Men i LNCaP-celler som uttrykker den muterte T877A AR, genistein induserte en bifasisk virkning hvor fysiologiske doser (0,5-5 pmol /L) stimulert cellevekst og øket AR ekspresjon og transkripsjonen aktivitet, og høyere doser induserte inhibitoriske effekter. Lignende bifasisk resultater ble oppnådd i PC-3 celler transfektert med AR mutanter; T877A, W741C og H874Y. Disse funnene tyder på at genistein, på fysiologiske konsentrasjoner, potensielt fungere som en agonist og aktivere mutant AR som kan være til stede i avansert PCa etter androgen ablasjon terapi
Citation. Mahmoud AM, Zhu T, Parray A, Siddique HR, Yang W, Saleem M, et al. (2013) Differensial Effekter av Genistein på prostata kreft celler Avhengig av mutasjonsstatus av androgen Receptor. PLoS ONE 8 (10): e78479. doi: 10,1371 /journal.pone.0078479
Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Østerrike
mottatt: 1 juli 2013; Akseptert: 12. september 2013, Publisert: 22 oktober 2013
Copyright: © 2013 Mahmoud et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. 1. Grant No. GM 842 fra det egyptiske departementet for høyere utdanning. 2. NIH Grant No. CA 116195. De bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksistere.
Innledning
Prostate Cancer (PCA) er den vanligste kreftformen og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA [1]. I asiatiske populasjoner, er forekomsten av PCa lavere sammenlignet med i USA og europeiske land [2]. De fleste epidemiologiske studier har vist en sammenheng mellom kosten inntak av soya og redusert risiko for PCa i asiater, for mange av dem soya matvarer er en primær kilde til protein [3-5]. Meta-analyser av epidemiologiske studier støtter en beskyttende effekt av soya [5,6]. Kost soya er rik på isoflavoner, inkludert rektor isoflavonforbindelser genistein og daidzein samt mindre rikelig forbindelser som glycitein [7,8]. Genistein er den mest tallrike og biologisk aktive isoflavon i soya. Steady state genistein konsentrasjoner i plasma fra japansk forbruker soyarike dietter er så høy som 2,4 umol /L som er flere ganger høyere enn den for europeere [9,10].
Det er en økende mengde bevis for at genistein har anticarcinogenic effekter på PCa [3,11]. Den modulerer ekspresjonen av noen gener som kontrollerer celleoverlevelse, cellesyklus, og apoptose [12], hemmer tyrosin-kinase-aktivitet [13], og NF-kB [14], regulerer Akt og MAPK signalveier [15], og hemmer angiogenese og metastase [16-21]. Genistein har også antioksidantegenskaper [22] og i noen
in vitro
studerer genistein redusert uttrykk og transkripsjonen aktivitet av androgen reseptor (AR) [23-29].
PCa er et androgen-avhengige sykdom og ulike terapeutiske metoder er rettet mot androgen ablasjon for lokalavansert eller metastatisk PCa. De fleste pasienter som får androgen ablasjonsterapier utgangspunktet viser klinisk og biokjemisk respons (redusert serumnivå av prostataspesifikt antigen [Ptil]). Imidlertid praktisk talt alle pasienter med tilbakefall et skjema mer aggressiv, hormon ildfast (kastrering-resistent) av PCa som ikke krever sirkulerende androgen, men er fremdeles avhengig av funksjonell AR for vekst og progresjon. Det er foreslått flere mekanismer for molekylær bryter for PCa fra en androgen-avhengige til en androgen-uavhengig stat, herunder bevis som tyder på at veksten i de tilbakevendende PCa er drevet av upassende aktivering av AR [30-32]. AR-aktivitet i fravær av testikler androgener kan skje på flere måter, blant annet AR forsterkning, deregulering av vekstfaktorer eller cytokiner, endring av coactivators, og lokal produksjon av androgener i prostata [33-38]. En annen mekanisme er oppkjøpet av AR mutasjoner som forårsaker reseptoren enten å være overfølsom for lave konsentrasjoner av androgener eller å utvide sin ligand spesifisitet når de oppstår i ligandbindende domene (LBD) [39,40]. De sistnevnte typer mutasjoner aktivere reseptoren aktiveres ved et bredt spekter av steroider så som østrogener, progestiner, adrenale steroider, eller til og antiandrogener [41,42]. For eksempel, et treonin til alanin-mutasjon i kodonet AR 877 (T877A) eksistere i opptil 12,5% av hormon ildfast PCa og tillater at AR til å bli aktivert av 17β-østradiol, progesteron, og noen antiandrogener [42]. Dette upassende promiskuøs binding av ikke-androgen ligander eventuelt bidrar til behandling motstand hos pasienter med avansert PCa [43].
Genistein har en 17β-østradiol-lignende struktur og har østrogen aktivitet i brystkreftceller [44]. Selv om det i en rekke
in vitro-studier
genistein downregulated AR transkripsjon og PSA protein ekspresjon i PCA-celler og inhiberte deres vekst [24,26,27], stimulerende virkninger er også blitt rapportert [45-47]. Men de fleste av disse studiene har noen metodiske begrensninger. For det første har farmakologiske eller til og med cytotoksiske konsentrasjoner av genistein som ikke gjenspeiler hva som kan oppnås ved forbruk av mennesker soya blitt anvendt i mange av disse studiene. For det andre, i de fleste studier som undersøker effektene av genistein for PCa, LNCaP-celler er blitt benyttet. Denne cellelinje har en T877A mutasjon i LBD av AR som utvider sin bindende spesifisitet, slik at aktivering av andre steroider eller steroid lignende molekyler [48]. Vi hypotese at genistein med sin østradiol-lignende struktur kan være en potensiell ligand for denne mutant AR, noe som potensielt forklarer de stimulerende virkninger som er blitt oppnådd ved bruk av LNCaP-celler i noen studier. Likevel er det ingen studier av ulike effekter av genistein på fysiologiske
versus
farmakologiske doser på PCA celler med villtype ARS (WT-ARS) og celler med muterte ARS. I denne studien benyttet vi to PCA cellelinjer; LAPC-4-celler som har WT-ARS [49] og LNCaP celler med T877A mutant ARS [48]. Celler ble behandlet cellene med et bredt spekter av genistein doser, inkludert fysiologisk oppnåelige konsentrasjoner for å bestemme rollen til T877A AR-mutasjonen og genistein konsentrasjon på genistein virkning på celleformering, apoptose, og AR og PSA uttrykk.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Genistein og Casodex ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Methyltrienolone (R1881) ble kjøpt fra Perkin Elmer (Downers Grove, IL).
Culture of PCA cellelinjer
LAPC-4-celler ble oppnådd fra Dr. R. Reiter via Dr. Karen Knudsen (UCLA), som opprinnelig ble utviklet av Dr. Charles Sawyers [49]. LnCap og PC-3-cellelinjer ble erholdt fra ATCC (Rockville, MD). Celler ble opprettholdt i fenol rød fri RPMI media med L-glutamin tilsatt 10% FBS, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Media ble erstattet med RPMI inneholdende 10% trekull strippet føtalt bovint serum 24 timer før behandling av celler med 1 pl /ml DMSO kjøretøyet som genistein ble oppløst ved konsentrasjoner på 0,5, 1, 5, 10, 25, og 50 umol /L, med eller uten 100nmol /L Casodex (Sigma, St. Louis, MO), og /eller en nmol /L methyltrienolone (R1881) (Perkin Elmer, Downers Grove, IL).
Cell Proliferation Assay
Cell overlevelse ble undersøkt ved hjelp av Cell Titer 96 AQ
ueous ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (3.000 celler /brønn). Tyve ul MTS reagens /100 ul medium ble tilsatt og deretter hensatt i 4 timer i en fuktig inkubator ved 37 ° C. Absorbansen ble målt ved 570 nm ved hjelp av mikroplateleser (Synergy 2, Biotek, Highland Park, Vermont). Celleproliferasjon og cellelevedyktigheten ble også målt ved hemocytometer telling; Cellene ble sådd ut på 24-brønners cellekulturplater ved 5000 celler /brønn i 1 ml kulturmedium med FBS. Ved 24, 48 og 72 timer etter behandling, ble cellene høstet med trypsin-løsning. Celletellinger ble utført in triplo ved bruk av et hemocytometer med trypan blått (0,2%) utelukkelse for å identifisere levedyktige celler. De totale antallet levedyktige og Fargede celler i hvert eksperiment ble sammenlignet med de tilsvarende ubehandlet kontrollceller utføres samtidig i tre uavhengige eksperimenter.
Cell Cvtotoksisitetsmålinq
Cell cytotoksisitet ble analysert bruker Vybrant Cvtotoksisitetsmålinq Kit (G6PD utgivelsen analyse) (Invitrogen, Grand Island, New York). Celler ble sådd ut i 96-brønners plater (5.000 celler /brønn) i en 50 ul medium. Etter 48 timers behandling, ble 50 ul av de forhåndspreparerte 2X resazurin /reaksjonsblandingen tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Fluorescens ble registrert ved hjelp av fluorescens mikroplateleser som ble satt opp med eksitasjon og emisjonsfiltre egnet for resorufin (eksitasjon 530-560 nm, utslipps 580-600 nm).
Transfeksjon av PC-3 celler
PC-3-celler, 5.000 celler /brønn, ble transient transfektert i 24-brønners plater med 0,5 ug av WT-AR, T877A-AR, W741C-AR, H874Y-AR, eller pSG5 tom vektor ved hjelp av Lipofectamine
TM LTX (Invitrogen Grand Island, New York). Plasmider ble sjenerøst gitt av Dr. Karen Knudsen (Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA). Åtte timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med bærer (ethanol og /eller DMSO) eller genistein.
flowcytometrisk analyse
Celler ble sådd ut i T-25 kolber i en konsentrasjon mellom 5 x 10
5 – 10
6-celler og behandlet med genistein i 48 timer. Behandlede celler ble høstet, vasket med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS) og farget for Annexin V for å vurdere apoptose ved hjelp av Alexa Fluor 488 annexin V /død celle apoptose Kit (Invitrogen). For cellesyklusanalyse, ble cellene fiksert med 70% etylalkohol i minst 15 minutter og farget med propidiumjodid-løsning (50 ug /ml propidiumjodid, 0,1 mg /ml RNase A og 0,05% Triton X-100). Cellene ble inkubert i 40 minutter ved 37 ° C og deretter analysert ved hjelp av cyan ADP tre kanal flowcytometer og Summit3 programvare (Beckman Coulter, Brea, California).
Western Blot analyse
Totalt protein ble isolert fra behandlede celler og for semikvantitativ analyse av kjernefysisk AR, ble kjernefysiske og cytoplasmatiske ekstrakter isolert ved hjelp av en Nuclear Extract Kit (Active Motif, Carlsbad, California). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved 595 nm med en mikroplateleser ved bruk av Bio-Rad Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tjuefem mikrogram protein /kjørefelt ble løst ved NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) og overført til PVDF membraner. Immunoavtrykket ble inkubert med primære antistoffer ved fortynninger på 1: 500 fortynnet kanin-polyklonalt antistoff for AR (N-20), 1: 500 geit polyklonalt antistoff for PSA (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller 1: 1000 mus monoklonalt antistoff til fosfotyrosin (4G10) (Invitrogen) over natten ved 4 ° C. Sekundære antistoffer konjugert til pepperrot peroksydase ble anvendt (Promega). ECL Western-blotting deteksjons reagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ble anvendt for å identifisere de antistoff-bundne proteinbånd. P-Tubulin og Tata Binding Protein (TBP) (Cell Signaling, Danvers, MA) ble brukt som laste kontroller for total protein og kjernefysisk protein, henholdsvis. Bilde J programvare ble benyttet til å beregne intensiteten av AR og PSA band i forhold til husholdningsgenet i tre uavhengige eksperimenter.
Real-Time PCR
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy mini kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA-mengder og kvaliteter ble bestemt ved å måle absorbans ved 260 og 280 nm ved hjelp av spektrofotometri. Fem mikrogram av total RNA ble reverstranskribert inn i cDNA ved anvendelse av Superscript RT III (Invitrogen). AR og PSA mRNA uttrykk ble bestemt ved real-time RT-PCR med SYBR Grønn analysen standard protokoll, og trinnet en pluss Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) ble brukt. Spesifikke primere for hvert gen ble utformet. For AR, foroverprimeren var 5′-3’TTGTGTCAAAAGCGAAATGG-, og revers primer var 5′- CAATGGGCAAAACATGGTC-3′. For Ptil, frem var 5′- CTTGTAGCCTCTCGTGGCAG-3’og revers primer var 5′-GACCTTCATAGCATCCGTGAG- 3′. Glyseraldehyd-3- fosfat-dehydrogenase (GAPDH) ble benyttet som intern kontroll for å normalisere ekspresjonsdata. GAPDH frem primer var 5′- GCCTCAAGATCATCAGCAATGCCT-3’og revers primer var 5′- TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT- 3′. Threshold syklusnummer (CT) som genereres av sanntids RT-PCR ble anvendt for å beregne den normaliserte uttrykk forholdet av målgener ved å bruke 2
-ΔΔCt (Livak) -metoden. Reaksjonene ble utført i tre paralleller, og resultatene viser tre uavhengige eksperimenter.
Luciferase Assay
Celler ble sådd ut i 24 brønners plater i en tetthet på 5000 celler /brønn i standard medium uten antibiotika . Cellene ble transient ko-transfektert med PSA-promoter-ildflue luciferase plasmid og
Renilla
luciferase ekspresjonsvektor som en kontroll for transfeksjonseffektivitet ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Begge plasmider ble sjenerøst gitt av Dr. Larisa Nonn (UIC, Chicago, IL). Åtte timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med bærer (ethanol og /eller DMSO) eller genistein. Etter 24 timer ble cellene høstet, og reporter og
Renilla
luciferasepreparater aktiviteter ble bestemt ved bruk av Dual-Luciferase Assay System (Promega).
Nuclear Localization studier
Celler ble belagt i 16-brønns kammermusikk lysbilder (Lab-Tek kammer lysbilde system, Nalge Nunc, Naperville, IL). Tretti minutter – 4 timer etter behandling, ble cellene skylt med 1 x PBS, fiksert med 4% formaldehyd /1 x PBS i 20 minutter og permeabilisert med 0,1% Triton X-100/1 x PBS i 10 minutter. Celler ble inkubert først med 5% serumfritt protein blokk i 60 minutter og deretter med AR primært antistoff (N-20 fra Santa Cruz Biotechnology) ved 1: 200 fortynning over natten ved 4 ° C i et fuktet kammer. Den neste dag ble cellene vasket og inkubert med FITC-konjugert anti-kanin-sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology) i 1 time og deretter inkubert med 1: 500 Hoechst kontra i 20 minutter i mørket. Lysbilder ble undersøkt under invertert fluorescerende mikroskop (Eclipse TE 2000, Nikon, Japan) er utstyrt med et avkjølt CCD-kamera (Fotometrisk Cascade II, Tucson, AZ) under kontroll av MetaMorph bildebehandlingsprogrammer (Molecular Devices, fullt Vale, CA).
3 [H] -R1881Competitive bindingsanalyse
Denne analysen ble utført ved anvendelse av metoden beskrevet av Siddique et al. [50]. Kort sagt ble LAPC4 og LNCaP-celler sådd ut i 12-brønners plater i fenol rød-fritt medium inneholdende 5% trekull strippet FBS i 3 dager, hvoretter, media ble erstattet med serum-fritt medium inneholdende 1 nM
3 [H] -R1881 med eller uten 0,1-1.000-ganger molart overskudd av umerkede konkurrerende ligander (R1881, Casodex eller genistein) i 90 minutter ved 37 ° C. Celler ble vasket med fosfatbuffer, og den bundne
3 [H] -R1881 ble ekstrahert i etanol i 30 minutter ved romtemperatur og detektert ved hjelp av scintillasjonstelling.
Genistein Binding med AR i silico
The X-ray krystallstrukturen av villtype androgen reseptor (PDB kode 1I37) og T877A mutant (PDB kode 1I38) i kombinasjon med dihydrotestosteron (DHT) ble fremstilt via Protein Forberedelse Wizard av Schrödinger Suite 2011. Genistein byggingen ble utarbeidet etter LigPrep [51]. OPLS2005 kraftfelt ble brukt for rime optimalisering, og mulige ionisering og tautomere former ble opprettet for genistein ved pH 7,5 ± 0,5 ved hjelp av Epik [52]. Molecular docking ble utført med GOLD versjon 5.0.1 [53]. Bindingssetet sfære ble definert med en 10 en radius rundt liganden er tilstede i krystallstrukturen, og 100 tilkoblings forsøk ble utført for hver ligand. Standardverdiene ble brukt til andre genetiske algoritmeparametre. Alle beregninger ble utført med Amber 11 pakke med programmer [https://ambermd.org/], inkludert ff99SB kraftfeltet for den AR-protein, gaff kraftfeltet for liganden, og MM /PBSA til å beregne bindings frie energier [ ,,,0],54]. Hver protein-ligand-komplekset ble oppløst i en octahedral eske TIP3P vannmolekyler som strekker seg 10 A ° utenfor protein på alle sider. De elektrostatikk ble behandlet med partikkel-mesh Ewald metoden [55]. Simuleringene brukt en rest-basert cutoff av 8 Å, en tid steg på 2 fs og en begrensning av bindingslengdene som involverer hydrogenatomer som bruker SHAKE algoritme. De oppløste komplekser ble minimert med 10000 skritt konjugat gradient minimalisering, likevekt med MD 300 K med 50ps av oppvarming og 50 ps av tetthet likevekt med to kcal mol
-1 Å
-2 begrensninger på komplekse og fulgt av 500ps med konstant trykkutligning med 0,5 kcal mol
-1 Å
-2 begrensninger på komplekset på 300K. Etter likevekt, ble 20 ns produksjon kjøre utført for å vurdere fri energi konvergens og koordinater ble hentet hver 2 ps. Effektivverdi avvik (RMSD) analyser ble utført ved hjelp av ptraj modul av Amber 11. MM /PBSA er en veletablert metode for å beregne bindende frie energier [56]. Bindingen fri energi ble beregnet ved bruk av en enkel termodynamisk syklus fra energiforskjellen mellom komplekset og de ubundne formene. Verdiene av fri energi av binding av hver forbindelse ble beregnet i henhold til ligning Δ
G
bind =
G
komplekse –
G
reseptor –
G
ligand. Den frie energien i hver av disse ble estimert som en sum av de fire vilkårene
G
=
E
MM +
G
psolv +
G
npsolv –
TS
lnmode, hvor E
MM er den molekylmekanikk energi til molekylet uttrykkes som summen av den indre energi av molekylet pluss elektrostatikk og van der Waals interaksjoner, er Gpsolv den polare bidrag til oppløsnings energi av molekylet, er Gnpsolv det ikke-polare oppløsnings energi, T er den absolutte temperatur, og S er entropien av molekylet anslått ved normal modus analyse. Øyeblikksbilder for MM /PBSA ble tatt hver 20 ps av de siste 2 ns MD produksjonsserier, noe som resulterer i en total av hundre øyeblikksbilder per løp. Normal-modus-analyse ble benyttet for å beregne vibrasjons, rotasjons, og translasjonelle entropi. På grunn av den høye beregningskostnad og avviket av entropien som er forholdsvis liten for forskjellige konformasjoner [57], vi bare utvalgte 12 regelmessig adskilte still langs de siste 2 ns produksjonsbane for entropi beregninger.
Statistical Analysis
Dataene ble analysert ved hjelp av Student t-test eller enveis ANOVA etterfulgt av en post-hoc test som passende og p-verdiene av 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Fysiologiske Konsentrasjoner av Genistein hemmet LAPC-fire cellevekst, men stimulert Vekst av LNCaP celler
For å avgjøre om T877A mutasjon av AR påvirker effekten av genistein på PCa celleproliferasjon, vi anvendt to metoder, (a) ved å bruke cellelinjer som naturlig har WT AR (LAPC-4-celler) eller T877A mutant AR (LNCaP-celler) og (b) ved hjelp av en AR-null-cellelinje (PC-3 ) transfektert transient med eksogen WT eller T877A mutant AR for å overvinne eventuelle biologiske avvik fra anvendelse av to forskjellige cellelinjer. Også, for å unngå variasjoner i nivåer av AR ekspresjon mellom PC-3-celler transfektert med forskjellige konstruksjoner AR og LNCaP-celler, ble en rekke DNA-konsentrasjoner (0.5-5μg) testet og den optimale dose som førte til en slutt AR ekspresjonsnivå nær som i LNCaP-celler ble anvendt (0,5 ug).
PCA-celler ble behandlet med et utvalg av genistein konsentrasjoner (0,5-50 umol /L) i 24 til 72 timer, hvoretter cellevekst og levedyktighet ble evaluert av både en MTS-celle proliferasjonsanalyse og hemocytometer telling med celle trypan blå eksklusjon. Genistein hemmet LAPC-4 celle-proliferasjon i betydelig grad ved alle konsentrasjoner som ble testet i en doseavhengig måte (figur 1A). I motsetning til dette, fysiologiske konsentrasjoner på 0,5, 1,0 og 5,0 umol /l genistein stimulert LNCaP celleproliferasjon med 13%, 35% og 27% sammenlignet med kontroller, henholdsvis, mens høyere konsentrasjoner av genistein (25 og 50 pmol /L) forårsaket inhibering av proliferasjon med 38% og 50% (figur 1B). I LAPC-4-celler, behandling med 1nmol /L R1881 opphevet de inhiberende virkninger av genistein, bortsett fra ved en høy konsentrasjon (50μmol /L) (figur 1C). Mens i LNCaP celler, kombinert behandling med lav dose genistein (1 mikromol /l) og syntetisk androgen (1 nmol /L R1881) additivt økt celleproliferasjon med 134%, noe som var mer enn det som forårsakes av enten genistein eller androgen alene (35% og 90% i forhold til kontroll, henholdsvis) (figur 1D). Hemocytometer telling med trypan-blått fargestoff utelukkelse viste en sammenlignbar mønster til det som oppnås ved MTS-proliferasjonsanalyse og en mangel på cytotoksisitet (data ikke vist).
Dataene representerer middelverdi ± SD (standardavvik) av tre forsøk hver i triplikat. A og B: Grafisk presentasjon av effektene av ulike konsentrasjoner av genistein på LAPC-4 (A) og LNCaP (B) cellevekst. C og D: Effekten av kombinert behandling med genistein og R1881 på LAPC-4 (C) og LNCaP (D) celleproliferasjon. E: Effekten av genistein 24-timers behandling på veksten av ikke-transfekterte PC-3-celler eller PC-3-celler transfektert med enten WT-AR eller AR T877A mutant. OD; optisk tetthet. * P 0,05, ** p. 0,01 for sammenligninger med kontrollgruppene
Ved 10 mikromol /l eller mer, genistein behandling i 48 timer induserte en signifikant hemming av spredning av PC-3 celler mangler AR uttrykk (figur 1E). Interessant nok de samme konsentrasjoner av genistein induserte en signifikant stimulering av proliferasjon av PC-3-celler som uttrykker den T877A-mutant AR (figur 1E), i samsvar med våre funn i LNCaP-celler som endogent uttrykker de samme mutant AR. Spredning av PC-3-celler transfektert med WT-AR ble betydelig inhibert ved konsentrasjoner på 10 umol /L eller mer (figur 1E).
I sammendraget (se tabell 1), PCA celler som uttrykker WT-AR enten endogent (LAPC-4-celler) eller eksogent (WT-AR transfektert PC-3 celler) ikke viser noen vekst stimulerende respons på genistein . Imidlertid PCA-celler som uttrykker den muterte AR, enten endogent (LNCaP-celler) eller eksogent (transfektert PC-3-celler), viste en signifikant forbedring i celleproliferasjon som respons på lavere mikromolare konsentrasjoner av genistein.
Genistein (umol /L )
cellevekst
apoptose
AR kjernefysiske lokalisering
AR protein og mRNA uttrykk
PSA protein og mRNA uttrykk
PSA luciferase activity
LAPC-40.5↓↑↓↓↓↓1↓↑↓↓↓↓↓↓↓↓5↓↓N/AN/A↓↓↓↓↓↓↓↓10↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓25↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓LNCaP0.5↑↔↑↑↑↑1↑↑↔↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑↑5↑↑N/AN/A↑↑↑10↔↔↔↔↓↓↓25↓↓↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓50↓↓↓↑↑↑↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓Table . 1. Oppsummering av de samlede effektene av genistein på LAPC-4 og LNCaP celler
Forkortelser er som følger: ↑ noe økt; ↑ ↑ moderat økt; ↑ ↑ ↑ markert økt; ↔ ingen endring, ↓ litt hemmet; ↓ ↓ moderat hemmet; ↓ ↓ ↓ markert hemmet. CSV Last ned CSV
lave doser av Genistein apoptose og cellesyklus arrest i LAPC-4 celler, men ikke i LNCaP celler
Vi har sammenlignet LAPC-4 og LNCaP celler for effekten av økende konsentrasjoner av genistein behandling i 48 timer på apoptose og cellesyklusprogresjon, begge bestemt ved strømningscytometri. Apoptose ble utvidet i en konsentrasjonsavhengig måte i LAPC-4-celler, fra en dose så lav som 0,5 umol /L (figurene 2A). I motsetning til dette, genistein konsentrasjoner mellom 0,5 og 10 pmol /L forårsaket ingen signifikant endring i apoptose i LNCaP-celler; apoptose ble økt bare på genistein konsentrasjoner av 25 mikromol /L eller høyere (figur 2B). I samsvar med disse funn genistein har medført en økning av LAPC-4-celler i sub-G1 ved konsentrasjoner lik eller høyere enn 10 umol /L, mens dette ble observert i LNCaP-celler bare på eller over 25 umol /L (tabell 2).
celler ble behandlet med genistein (0,5- 50 umol /L) i 48 timer, deretter apoptose ble undersøkt i LAPC-4 (A) og LNCaP-celler (B) ved hjelp av strømningscytometri etter farging med Annexin V-apoptose deteksjon kit. Celler behandlet med genistein i 72 timer ble undersøkt for tegn på cytotoksisitet ved hjelp av laktatdehydrogenase frigjøringsanalyse. Resultatene i diagrammet representerer gjennomsnittet ± SD for tre eksperimenter. * P 0,05, ** p 0,01, for sammenligninger med kontrollgruppene.
LAPC-fire celler
LNCaP celler
Genistein dose
Sub G
G0 /G1
S
G2 /M
Sub G
G0 /G1
S
G2 /M
Control9.46 (3,8) 71,98 (5,1) 6,38 (3,3) 12,25 (2,8) 7,06 (1,5) 73,85 (2,5) 8,04 (2,1) 11,05 ( 2,8) 0,5 umol /l 13,63 (1,5) 62,69 (9,4) 6,12 (4,9) 17,66 (2,6) 7,00 (1,5) 74,96 (5,4) 8,02 (2,9) 10,02 (4,6) 1,0 umol /L18.37 (6,2) 59,58 * ( 4,1) 4,18 (0,8) 17,78 (5,6) 4,44 (0,9) * 82,12 (4,3) 9,09 (2,4) 4,42 (2,4) 10 umol /L25.1 ** (2,6) 52,3 ** (2,9) 3,30 (0,9) * 19,31 (2,8) 7,08 (1,5) 72,81 (4,8) 7,80 (1,8) 12,31 (2,6) 25 umol /L34.2 ** (4,2) 40,8 ** (4,3) 3,84 (4,1) 21,19 * (3,5) 13,0 ** (2.5) 61.78 ** (3,2) 5,84 (2,1) 19,4 (3,6) 50 umol /L40.4 ** (0,8) 31,2 ** (3,0) 2,30 (0,9) 26,1 ** (2,0) 9,37 ** (1.6 ) 43.03 ** (3,4) 3,30 (1,1) 34,3 ** (3,9) Tabell 2. effekten av genistein på cellesyklusfordelingen av LAPC-4 og LNCaP-celler.
propidiumjodid-fargede celler ble analysert ved hjelp av en strømnings cytometer. Resultatene i tabellen representerer gjennomsnittet ± SD fra tre eksperimenter * p. 0,05, ** p 0,01, sammenlignet med bærerkontrollgruppen. Tall i parentes er for standardavvik. CSV ned CSV
Når det gjelder cellesyklusprogresjon, 1μmol /L av genistein betydelig redusert LNCaP-celler i sub-G1 og G2 /M og økte celler i G0 /G1-fasen av cellesyklusen (tabell 2). I motsetning til dette, i LAPC-4-celler, lave doser av genistein indusert veksthemming tydelig ved reduksjon av antallet celler i G0 /G1 og akkumulering av celler i G2 /M som er karakteristisk for et S-fase blokk eller S /G
2-faseovergang blokk (tabell 2). Men på suprafysiologiske konsentrasjoner (25μmol /L og høyere), fører genistein en G2 /M arrest og apoptose i begge cellelinjene, LAPC-4-celler blir mer følsomme enn LNCaP celler. Disse funn er i overensstemmelse med hva vi rapportert ovenfor i MTS-celleproliferasjonsanalyse. For å eliminere effekten av direkte cytotoksisitet av genistein, og deretter utførte vi den laktatdehydrogenase frigjøringstest hos både LAPC-4 og LNCaP-celler tvers over hele bredden av genistein doser som har blitt brukt. Det var ingen påvisbar cytotoksisitet til en hvilken som helst dose av genistein opp til 50 pmol /l i 72 timer i enten cellelinjer (figur 2C).
Den stimulerende effekt av genistein på LNCaP-celler ble formidlet ved Mutant AR
Vi undersøkte hvorvidt den mutante AR-T877A er nødvendig for genistein for å forbedre LNCaP-celleproliferasjon i fravær av androgen (figur 3A). LNCaP-celler ble inkubert med enten en umol genistein eller en nmol /L R1881 i fravær eller nærvær av 100 nM av AR antagonist, Casodex. Som vist i figur 3A, Casodex alene påvirket ikke LNCaP cellevekst, men det avskaffet den stimulerende effekt av 1 nmol /L R1881 på celleproliferasjon, i overensstemmelse med ideen om at AR aktivering medierer PCa celleformering (36,38). Legge 1μmol /L av genistein til media forbedret LNCaP celleproliferasjon med 49%, og denne effekten ble også eliminert ved 100nM Casodex. Disse funnene tyder på at den stimulerende effekten av genistein på LNCaP celleproliferasjon medieres primært av T877A mutant AR.
A: Grafisk presentasjon av effekten av kombinert behandling med R1881 (1nmol /L) og Casodex (100nmol /L) eller genistein (1μmol /L) og Casodex (100nmol /L) på LNCaP cellevekst målt ved hjelp MTS analysen. Resultatene i diagrammet representerer gjennomsnittet ± SD for tre forsøk hver i triplikat. * P 0,05, ** p 0,01, for sammenligninger med de gruppene som ble behandlet med R1881 eller genistein, bare. B: Evaluering av genistein-AR bindende
i
silico
. Representant figuren viser konformasjonsforandringer endringer av WT-AR og T877A mutant AR etter molekylær docking med genistein
i
silico
bruker GOLD versjon 5.0.1 modellering program. Forskjellige domener av AR er presentert i ulike farger. Innfelt, genistein bundet til ligand-bindende domene (LBD) av AR-reseptoren. Pilene peker på forskjellige konformasjonsendringer og sløyfe bevegelser i WT-AR og T877A mutant AR som reaksjon på genistein dokking. C: Geometriske optimalisering, og tautomere former av genistein opprettet ved pH 7,5 ± 0,5 ved hjelp av Epik. Den gule er for WT-AR, og den grønne er for T877A mutant AR. D og E: Evaluering av genistein-AR bindende bruker
3 [R1881] konkurrerende bindingsanalyse. Histogrammet viser bindingen av genistein med AR i LAPC4 (WT-AR) og LNCaP (mutant AR) celler som vurdert ved radioaktivt merkede cellebasert konkurrerende bindingsbestemmelse som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene i diagrammet representerer gjennomsnittet ± SD for tre eksperimenter. * P 0,05, ** p. 0,01, sammenlignet med kontroll
Muligheten av genistein for å forbedre spredning i LNCaP-celler, men ikke i LAPC-4-celler, kan skyldes forskjellig affinitet ved hvilken genistein binder seg til mutanten AR og WT-AR. For å undersøke denne antakelsen ble to tilnærminger næringsdrivende,
i silico
molekylær modellering og
3 [H] -R1881 konkurrerende bindingsanalyse.
I silico
modellering viste at genistein binder seg til AR bindende lommen uten overlappende med DHT bindingssetet (Tall 3B og 3C).
