Abstract
Blærekreft (BCA) er en vanlig kreft over hele verden og har en høy sannsynlighet for tilbakefall etter innledende diagnose og behandling. Som et resultat av tilbakevendende overvåking, primært involverer gjentatte cystoskopier, er en kritisk komponent i innlegget diagnose pasientbehandling. Siden cystoskopi er invasiv, dyre og en mulig avskrekkende for pasientens etterlevelse med regelmessig oppfølging screening, til nye ikke-invasive teknologier hjelp i deteksjon av tilbakevendende og /eller primær blærekreft er sterkt nødvendig. I denne studien ble massespektrometri basert metabolomikk anvendes for å identifisere biokjemiske signaturene i human urin som skiller blærekreft fra ikke-kreft-kontroller. Over 1000 forskjellige forbindelser ble målt inkludert 587 navngitte forbindelser med kjent kjemisk identitet. Initial biomarkør identifikasjon ble utført ved hjelp av en 332 lagt prøve sett retrospektive urinprøver (kohort 1), som omfattet 66 BCA positive prøver. Et sett av 25 kandidat biomarkører ble valgt basert på statistisk signifikans, ganger forskjell og metabolismeveien dekning. De 25 kandidat biomarkører ble testet mot en uavhengig urinprøve sett (kohort 2) med tilfeldig skogen analyse, med palmitoyl sphingomyelin, laktat, adenosin og succinate gi den sterkeste prediktiv kraft for å differensiere kohort 2 kreft fra ikke-kreft urin. Cohort 2 metabolittprofilering avdekket flere metabolitter, inkludert arachidonat, som var høyere i kohorten to kreft kontra ikke-kreft kontroller, men var under kvantiteringsstandarder grenser i kohorten en profilering. Metabolitter relatert til lipidmetabolisme kan være spesielt interessante biomarkører. Resultatene tyder på at urin metabolitter kan gi en sårt tiltrengt non-invasiv medhjelper diagnostisk til cystoskopi for påvisning av blærekreft og tilbakevendende sykdom ledelse
Citation. Wittmann BM, Stirdivant SM, Mitchell MW, Wulff JE, McDunn JE Li Z, et al. (2014) blærekreft biomarkører bruke Global Metabolomic Profilering av urin. PLoS ONE 9 (12): e115870. doi: 10,1371 /journal.pone.0115870
Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA
mottatt: May 23, 2014; Godkjent: 27 november 2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 Wittmann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Midler til prøvetaking og annotering ble støttet med tilskudd NIH 1R01-CA151489-01 (Bogdan Czerniak PI), og NIH /NCRR 5 UL1 RR24982 -02 (YL co-etterforsker). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Metabolon ervervet prøver på gebyr per prøve basis
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: BMW, SMS, MWM, JEM, ZL, BPN, MVM og RLW er ansatt i Metabolon Inc .; YL samarbeider om forskningsstudier med Abbott, Cepheid og Pacific Edge, men ikke som en konsulent eller høyttaler. Disse konkurrerende interesser endrer ikke forfatternes tilslutning til alle bilags politikk på deling av data og materialer.
Innledning
I USA er blærekreft den 4
th vanligste krefttypen hos menn og 11
th vanligste krefttypen hos kvinner [1]. I USA for 2012, ble det anslått at 73.000 nye tilfeller vil bli diagnostisert og 15.000 mennesker vil dø av sykdommen [1]. Pasienter med blærekreft mest stede med hematuria [2]. Diagnostisering av blærekreft, i de pasienter med hematuri, innebærer primært cystoskopi sammen med bildebehandling, cytologi og biopsi [3]. Cystoskopi og cytologi er gjeldende standarder for første diagnose og tilbakefall, men begrensninger eksisterer. Cystoskopi kan mislykkes i å visualisere visse områder i blæren og kan også mislykkes i å oppdage alle kreftformer, særlig noen tilfeller av carcinoma in situ [4]. Cytologi har høy spesifisitet og selektivitet for høy klasse svulster men klarte ikke å gi sterk prediktiv verdi for lave svulster grad [5]. Behandlingsalternativer er basert på iscenesettelse og om det er muskelvev invasjon. Et flertall av blære kreft (75%) er uroteliale karsinom klassifisert som ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC). I NMIBC, ca 70% av pasientene med foreliggende stadium PTA, 20% med PT1 og 10% med carcinoma in situ (CIS) [6]. Tilbakefallsprosenten for NMIBC etter tumor reseksjon er høy, med anslag varierer 35-80% [6], [7]. På grunn av risiko for svulst tilbakefall eller progresjon, etablerte retningslinjer anbefaler at NMIBC pasientene overvåkes etter innledende diagnose og behandling [8], [9]. En vanlig tidsplan for cystoskopi anbefales for overvåkning ved en frekvens på hver 3-6 måned i 3 år, og årlig der etter [10], [11]. Som et resultat, kan blærekreft sees på som en kronisk sykdom med livslang oppfølging nødvendig. Langsiktig overvåking stole på cystoskopi, foruten å være invasiv, har potensial for bivirkninger og kan innebære betydelige langsiktige utgifter [12], [13]. I tillegg kan pasienten aversjon mot cystoskopi resultere i redusert pasient samsvar med vanlig overvåknings anbefalinger [14]. Det er en sterk klinisk behov for en ikke-invasiv, billig alternativ til cystoskopi som skal hjelpe til med påvisning av primære kreft, overvåke tilbakefall og hjelpe stratifisere pasienter som til risiko for tilbakefall og progresjon. Nylige fremskritt innen metabolomics har åpnet opp muligheten for å bruke urin metabolitter som biomarkører for kreft [15] – [18]. En rekke studier har sammenlignet metabolitt forskjeller i blæren svulster i forhold til godartet vev og har identifisert kandidat kreft biomarkører [19] – [23]. En studie undersøkte også forskjeller i urin metabolitter mellom pasienter med blærekreft i forhold til kreft frie kontroller [19]. Tidligere studier ble ofte begrenset i antall påviste navngitte metabolitter og en mer omfattende metabolittprofilering kan gi ny kandidat biomarkører og prediktiv algoritmer. Vi rapporterer her metabolomic profilering av urin fra to årskull av blærekreftpasienter og deres respektive ikke-kreft kontroller. Dataene tyder flere kandidat blærekreft biomarkører som kan gi prognostisk verdi i å identifisere kreft positive urinprøver.
Materialer og metoder
Pasientvalg
Retrospective (kohort 1) og prospektive ( cohort 2) urinprøve settene ble hentet fra en IRB-godkjent urin repository (IRB # CR00008160 /STU032011-187) ved University of Texas Southwestern Medical Center (UTSW). Alle forsøkspersonene ble gitt samtykke med skriftlige samtykke. Cohort en blære kreft positive urinprøver var fra individer som har enten primær eller tilbakevendende kreft. Annullert urinprøver ble innhentet før cystoskopi for pasienter fra kohorten en blære kreft positive, sammen med kreft historie og hematuri kontroller. Cystoskopier ble gjennomført som ledd i den løpende overvåking eller for diagnose av kreft og resultatene ble brukt til å diagnostisere gjeldende kreft status, enten hjemme eller borte. Cohort 2 urinprøver ble innhentet fra fagene presenterer med hematuri eller fra individer med en historie med sykdom under overvåking. Blærekreft positive urinprøver i kohort 2 ble oppnådd fra individer som har enten primær eller tilbakevendende sykdom. Metadata om alder, kjønn, rase og kreft stadium og grad var tilgjengelig for begge kohorter.
Metabolomic Profilering
massespektrometer plattformer, prøveutvinning og forberedelse, instrumentinnstillinger og betingelser, og data behandling har tidligere blitt beskrevet i detalj [24]. I korthet kan de viktigste komponentene i fremgangsmåten oppsummeres som følger. Osmolalitet på hver urinprøve blir bestemt før behandling. En cocktail av gjenvinnings-standarder ble tilsatt til urinprøver og 100 pl aliquoter ble ekstrahert i 500 pl metanol. Den resulterende ekstrakt ble oppdelt i tre fraksjoner på vilkårlige metabolske profilering og randomisert for analyse. Hver prøve ble tørket under vakuum for å fjerne organisk løsningsmiddel. Prøvene ble karakterisert ved hjelp av tre uavhengige plattformer: ultrahøy ytelse væskekromatografi /massespektrometri (UHPLC-MS /MS) i det negative ion-modus, UHPLC-MS /MS i positiv ionemodus og gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS ) etter sialysering. Reproduserbarheten av ekstraksjon protokollen ble bestemt ved utvinning av xenobiotiske forbindelser piggete i hver urinprøve før ekstraksjon. Kohort 1 urin ble analysert ved hjelp av en plattform som består av en Waters ACQUITY UHPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA) og et Thermo-Finnigan LTQ massespektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. USA), mens kullet var 2 analysert ved hjelp av en plattform bestående av en Waters ACQUITY UHPLC og en ThermoFisher Scientific Orbitrap Elite høy oppløsning /nøyaktig masse massespektrometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. USA). Forbindelser ble identifisert ved sammenligning til bibliotekoppføringer renset standarder eller tilbakevendende ukjente enheter. Identifisering av kjente kjemiske enheter var basert på sammenligning til metabolomic bibliotekoppføringer av rensede standarder basert på kromatografiske egenskaper og massespektra. Når dette skrives, hadde mer enn 4000 kommersielt tilgjengelige rene standard forbindelser blitt kjøpt og registrert inn i LIMS for distribusjon til både LC og GC plattformer for bestemmelse av sine analytiske egenskaper. Andre enheter (ikke navngitte forbindelser) ble identifisert i kraft av sin tilbakevendende natur (både kromatografisk og masse spektral). Disse forbindelsene har potensiale til å bli identifisert ved fremtidige oppkjøp av en matchende renset standard eller ved klassisk strukturell analyse.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført i R-versjon 2.14.2 [25] . Wilcoxon test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans av metabolitten midlere forskjeller mellom gruppene komparator. For alle analysene ble manglende verdier (hvis noen) tilregnet med den observerte minimum for den aktuelle forbindelsen (kalkulatoriske verdier ble lagt etter blokk-normalisering). De statistiske analyser ble utført på naturlige log-transformerte data for å redusere effekten av eventuelle utliggere i dataene. I tillegg, ble data normalisert for å prøve osmolalitet for å kompensere for forskjeller i urin konsentrasjon. Random skogen er en veiledet klassifisering teknikk basert på et ensemble av beslutningstrær [26] og ble utført i R-versjon 2.14.2. Hierarkisk clustering av blærekreft og kontrollurin overflod profiler ble utført i ArrayStudio versjon 5.0 ved hjelp av komplett hydraulikk og Pearsons korrelasjon som likheten metriske (OmicSoft, Raleigh, NC). Beregninger av AUC og ROC kurver ble utført ved hjelp av Proc pakken i R [27]. Den multi-biokjemiske algoritme, brukt til å generere AUC og ROC-kurver, ble trenet og testet fra data som ble skalert slik at medianer av både de kohortstudiene-1 og kohort-2 negativt var lik 1. rescaling tillater algoritmen testing på en skala hensiktsmessig for de monterte koeffisienter avledet fra treningssettet.
Resultater
emne populasjoner
Urin metabolsk profilering ble utført på to fag kohorter. Cohort en ble brukt som en utforskende /biomarkør identifikasjon satt til å identifisere biokjemikalier som nivåene var annerledes i urin med blærekreft urin i forhold til nivåene i kontroll urin. Kohort 2 ble anvendt som et andre oppdagelse sett og for å teste den prediktive verdi av kandidat biomarkører valgt fra kullet ett datasett, men ettersom kullet 2. Prøvene ble analysert på en mer følsom massespekt plattform, metabolitter som bare ble målt i kullet 2 prøvene var også av interesse. Cohort en var en retrospektiv urinprøve sett samlet ved University of Texas Southwestern, mens kohort 2 prøver ble samlet inn prospektivt ved samme institusjon. Et sammendrag av pasientens demografi for de to kohortene er presentert i tabell 1. Cohort en omfattet 66 urinprøver fra forsøks diagnostisert med BCA og 266 ikke-BCA kontroller. Urin i kohort 1 ble samlet fra pasienter med enten primær eller tilbakevendende sykdom. Noen forskjeller i generelle kjønns og rase komposisjoner var tilstede i kohort 1. Ikke-BCA kontrollene i kohorten en kan deles inn i tre pasientgrupper: 1) fag presenterer med hematuri; 2) pasienter med en historie med BCA, men ingen nåværende sykdom og 3) normale personer med ingen historie med BCA. Cohort 2 besto av 29 urinprøver fra forsøks diagnostisert med BCA og 79 ikke-BCA kontroller. Som i kohort 1, var det noen forskjeller i kjønn og rase balanse mellom BCA og ikke-BCA kontroller. Kohort 2 urinprøver ble oppnådd fra individer med enten primære eller tilbakevendende sykdom i et forhold identisk med det i kullet 1 (59% tilbakevendende: 41% primære). Også i notatet var en kohort forskjell i prosent av høy klasse vs. BCA svulster lav karakter, med kohort en ha en mye høyere prosentandel av høy klasse BCA (79%) enn kohort 2 (59%).
Metabolomic profilering og analyse
Urinprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble hentet ut og metabolsk profilering ble utført ved hjelp av positive (+) og negative (-) LC-MS /MS og også GC-MS, for å oppnå bred dekning av biokjemikalier nåværende. MS toppene ble identifisert ved hjelp av Metabolon proprietære peak integrering /identifisering programvare, ved å sammenligne MS peak data som i et bibliotek med rensede standarder eller tilbakevendende ukjente enheter. Etter imputering av minste observerte verdier, logg transformasjon og normaliser, ble statistisk analyse utført for å identifisere statistisk signifikante forskjeller i metabolitter mellom sammenlignende grupper. Profilering av kohorten en målt 499 navngitt og 624 navngitte biokjemikalier, mens profilering av kohort 2 målt 587 navngitt og 541 navngitte biokjemikalier. Lister over alle navngitte metabolitter målt i de to kohortene er vist i S1 S2 tabeller. Det økte antall navngitte forbindelser, målt i kohort 2, i forhold til kohort en delvis reflekterer den høyere sensitiviteten til den nøyaktige massen MS instrument benyttet for kullet 2 og en utvidelse av den biokjemiske biblioteket i tidsperioden mellom profileringskullene 1 og 2 . En Wilcoxon to sample test ble anvendt for å identifisere statistisk signifikante forskjeller i metabolitt-nivåer i kohort 1 BCA urinen i forhold til kontroll urin. Statistisk analyse ble utført sammenligne BCA urinen til alle kontrollgruppene kombinert; eller sammenligne BCA til hver av styre undergrupper. Antallet statistisk signifikante forskjeller i angitte forbindelse nivåene varierte 178-233 tvers av de forskjellige sammenligninger (tabell 2). Totalt sett, antall statistisk signifikante biokjemikalier ikke varierer sterkt når man sammenligner BCA-positive prøver til de forskjellige kontrollgruppene. Analyse av kullet 2 BCA urin sammenlignet med kontroller ved anvendelse av en Wilcoxon test, identifisert 75 navngitt biokjemikalier som viser statistisk signifikante forskjeller med 70 biokjemikalier forhøyet og 5 biokjemikalier lavere i BCA urinen i forhold til kontrollurinprøver (tabell 2). Den mindre antall statistisk signifikante forskjeller i kohort 2 i forhold til kullet en kan gjenspeile dels lavere prøvenumrene i kohort 2. Jo høyere prosentandel av høyere stadium svulster i kohorten 1 i forhold til kohort 2 kan ha påvirket også antall statistisk signifikante forskjeller observert.
Identifikasjon av kandidat biomarkører
En strategi ble ansatt for å bruke kohorten en til å identifisere kandidat biomarkører og til å rangere de mest interessante kohort 1 biomarkører for BCA forutsigbarhet ved hjelp kohorten 2 prøver innstilt. En arbeidsflyt diagram av strategien brukes for biomarkør testing og bekreftelse vises i fig. 1. hierarkisk clustering ble utført på kohorten 1 datasett ved hjelp av alle prøvene (332) og alle navngitte biokjemikalier, unntatt eksogene stoffer (totalt = 442). Resultatene av den hierarkiske clustering er presentert i fig. 2, med en viss grad av BCA prøven clustering observert. De clustering Resultatene tyder på at metabolitt forskjeller mellom kreft og ikke-kreft gruppene finnes, og at disse forskjellene har en evne til å differensiere urinprøver
Forkortelser. HX, BCA negativ men med historie BCA; Hema, BCA negative presenterer med hematuri.
Subject BCA diagnose (post urin) er angitt i den nederste linjen. Clustering ble utført ved hjelp av komplett hydraulikk og Pearsons korrelasjon som likheten beregning.
Valg av biomarkør kandidater fra kohorten 1 datasett
En Wilcoxon test ble brukt til kohorten en profileringsdata å sammenligne urin fra pasienter med nåværende BCA til urinprøver fra tre separate kontrollgrupper: 1) fag presenterer med hematuri; 2) pasienter med en historie med BCA men ingen gjeldende sykdom eller 3) normale personer med ingen historie med BCA. I tillegg ble en Wilcoxon test anvendt sammenligne BCA urin til en kontrollgruppe bestående av alle ikke-BCA urin kombinert. En heatmap og statistikk for alle målte metabolitter for de 4 forskjellige sammenligninger finnes i S1 tabell. Kombinert, ble 290 statistisk signifikante forskjeller i navngitte metabolitter identifisert mellom tre separate BCA /komparator analyser, med 135 metabolitter viser statistisk signifikante forskjeller mellom alle tre BCA til negative kontroll sammenligninger (hematuri, historie, normal, S1 Table). For å redusere det totale antallet metabolitt forskjeller ned til et mer håndterlig sett med «beste biomarkør kandidater», ble flere filtreringskriterier anvendt. Filtre som følger med: 1) metabolitter med BCA å kontrollere nivåer som var statistisk signifikant i minst 3 av 4 BCA å styre gruppesammenligninger; 2) metabolitt forskjeller som viser lavest p-verdi (alle p≤0.05); 3) størst fold forskjeller mellom BCA og kontroller; 4) målt i 50% av urinprøver; 5) kreft fenotype forening; 6) dekning av flere metabolske veier; 7) navngitte bare forbindelser; 8) utelukkelse av eksogene forbindelser (f.eks xenobiotics, narkotika). Bruk av disse utvalgskriteriene vi utpekt et panel av 25 kandidat biomarkører for videre analyse. Settet av 25 kandidat biomarkører er vist i heatmap på fig. 3, sammen med de statistiske resultatene i hver av 3 mulige BCA å kontrollere gruppesammenligninger. Også vist i fig. 3 er et blærekreft undergruppe analyse som sammenligner eneste ikke-muskel invasiv blærekreft til historien kontrollgruppen. Ved å sammenligne alle BCA prøvene til hver av kontrollgruppene, alle biokjemikalier med unntak av forgrenede aminosyrer (BCAA) leucin, isoleucin og valin vist p≤0.05 statistisk signifikans i alle tre kontrollgruppesammenligninger. 3-hydroksybutyrat og glukonat var den mest høyt hevet i BCA urinen, mens anserine og 3-hydroksyfenyleddiksyremetylester og pyridoxate ble mest redusert i BCA vs. kontroll urin. De fleste av biomarkør kandidater som oppnådde statistisk signifikans når alle BCA prøvene ble sammenlignet med kontrollene viste historie også statistisk signifikante forskjeller når bare NMBIC prøvene ble sammenlignet med kontrollene historie. Differensiering av NMBIC kreftformer er viktige fordi de vil være mer utbredt i pasienter under aktiv overvåking. De 25 kandidat biomarkører valgt fra kohorten 1 data ble brukt i en hierarkisk clustering analyse av kohort 1 prøver. Gruppering av BCA og kontrollprøver ble observert, noe som indikerer at differensial nivåer av de 25 biokjemikalier gi en viss grad av urinprøve lagdeling på grunn av diagnose (fig. 4).
Red fylle cellene indikere metabolitter med høyere gjennomsnittlig nivå innenfor BCA urin enn i ikke-BCA kontroller på ap≤0.05 betydning. Grønne celler tyder på lavere nivåer i BCA sammenlignet med kontrollgruppen urin ved en p≤0.05 betydning. Statistiske q-verdier og profilerings resultater for alle andre navngitte forbindelser målt i kohort 1 prøver presenteres inn S1 tabell.
Subject BCA diagnose (post urin) er angitt i den nederste linjen. Clustering ble utført ved hjelp av komplett hydraulikk og Pearsons korrelasjon som likheten beregning.
Cohort en kandidat biomarkører som best skiller kohort 2 prøver
En tilfeldig skogen analyse ble utført ved hjelp av 25-kullet 1 biomarkør kandidater til stratify kohorten to prøvesett i sin rette kreft og ikke-kreft grupper. Random skogen er et ensemble metode basert på klassifisering trær og ut-av-bag feil gir et anslag på hvor godt vi kan forvente å forutsi en fremtidig prøve. Den tilfeldige skog analysen gir en «viktig» rang bestilling av biokjemikalier. Den relative betydning av hver av de 25 metabolittene er vist i fig. 5, med palmitoyl sphingomyelin viser størst diskriminerende effekt (høyere gjennomsnittlig reduksjon nøyaktighet verdi). Toppen 6 diskriminerende metabolitter i tilfeldig skogen analyse utgjorde 3 metabolitter som var høyere i BCA urin og tre som var lavere i BCA prøver. En sammenligning av relative nivåer for disse 6 metabolitter i alle krefturinprøver versus alle ikke-kreft-kontroller i de to kullene blir vist i fig. 6. Forskjellene i de relative nivåer for hver av de 6 metabolitter var statistisk signifikant (p≤0.05) i begge kullene, med unntak av succinat som oppnådde en p-verdi på 0,053 i kohort to sammenligning. I tillegg ble NMIBC undergruppe av BCA-prøvene sammenlignet med alle kontrollprøver og 4 av de 6 metabolittene fortsatte å oppnå statistisk signifikans ved et p≤0.05 nivå, med fosfokolin og succinat å være unntaket (fig. 6). Phosphocholine og succinate var statistisk signifikant på et p≤0.1 nivå.
metabolitter rang-ordnet etter gjennomsnittlig reduksjon nøyaktighet poengsum. En høyere gjennomsnittlig reduksjon nøyaktighet verdi indikerer en større prediktiv verdi. De 6 eske datapunktene representerer toppresultat metabolitter oppsummert i fig. 6.
Sammenligninger er for alle BCA positive urinprøver versus kombinere BCA negative kontroller. Mørk rød og mørk grønn celler representerer ganger forskjellen med en p≤0.05. Lys grønn celle med blå tekst representerer p≤0.1. BLQ: under kvantifiseringsgrensen; NA: Ikke anvendelig.
Andre biomarkør kandidater observert i kohort 2 urinprøver
Metabolsk profilering av kohort 2 urinprøver ble utført ved hjelp av en mer følsom accurate- masse MS-plattformen, som er i stand til å måle urin metabolitter er tilstede ved lavere konsentrasjoner. En heatmap inneholder alle navngitte metabolitter målt i kohort 2 prøvene er presentert i S2 tabell. Arachidonat, spermidin, spermin og cytosin, ble ikke målt i kohort 1 urinen, men ble forhøyet i kohort 2 BCA urin på p≤0.05 (Fig. 6). Arachidonat ble også forhøyet i NMIBC tumor urin til et statistisk signifikant nivå, da NMIBC prøvene ble isolert og analysert separat fra MIBC tumor urin (fig. 6). Spermine, spermidin og cytosin ble forhøyet i NMIBC urinen også, men ikke på statistisk signifikante nivåer. Disse fire metabolitter kan også anses å være kandidat biomarkører, men bekreftelsen ville kreve en uavhengig kohort som hadde også vært profilert på nøyaktig masse instrument.
Multi-analytt algoritmen ytelse med et sett med 6 biomarkører
Som en test eksempel på potensiell biomarkør ytelse i en multi-analytt-algoritmen, palmitoyl sfingomyelin, laktat, glukonat, adenosin, 2-methylbutyrylglycine og guandinoacetate ble valgt for algoritmen trening ved hjelp av kohort-1 datasett. Disse kandidat biomarkører ble valgt basert på deres fold forskjeller og p-verdier i både kohort-en og kohort-2. Algoritmen utledet fra trening på kohort-1 datasett ble testet på kohort-to datasett. AUC og ROC-kurver for både trening og testsett analyse er vist i fig. 7. Sammenlign AUC ble oppnådd for begge kohorter, med AUC = 0,81 for kohort-1 og 0,78 for kohort-2. Spesifisitet verdiene holdt seg høy, opp til en følsomhet cutoff på rundt 0,5, i begge kohorter. Forestillingen observert ved hjelp av denne algoritmen ikke antyde fremtid prediktiv verdi, siden biomarkører som brukes i algoritmen var forhåndsvalgt basert på deres tumor differensiering evne i begge kohorter. Dette eksemplet illustrerer at det er mulig å utlede en algoritme som segregerer svulst fra kontroll urin i begge disse spesifikke kullene.
En algoritme, ved å benytte den kandidat biomarkører palmitoyl sfingomyelin, laktat, glukonat, adenosin, 2-methylbutyrylglycine og guanidinoacetate ble trent med kohort-1 datasett og deretter testet på kohort-to datasett. ROC kurver med AUC vises for treningssettet (A.) og testsettet (B.).
Diskusjoner
Blærekreft er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet med en stor grad av tilbakefall og behov for hyppig oppfølging overvåking. Foreløpig overvåking for tilbakefall krever cystoskopi på en semi-rutinemessig basis, vanligvis inntil en omfattende sykdomsfrie perioden har utløpt. En mer lettvinte, mindre invasiv diagnostisk metode ville være en fordel for pasientbehandling og kan øke oppfølging overvåking etterlevelse. Måling av urin metabolitter kan gi en følges diagnostisk metode som kan legge til rette for oppfølging av blærekreft tilbakefall og kanskje også bidra til primærdiagnose.
Nyere metabolomic studier har vist seg nyttig i å identifisere kreft biomarkører og i å få innsikt i den rollen av metabolsk omprogrammering i initiering og progresjon av malignitet. Metabolsk omprogrammering i tumorceller er et vanlig fenomen, og er nå anerkjent som en voksende kjennetegn på kreft [28]. Endringer i metabolitter som følge av svulst metabolske omprogrammering kan tilby unike muligheter for biomarkører. For eksempel er 2-hydroxyglutarate økte i gliomer, multippelt myelom og tykktarmskreft [29] og forhøyet sarkosin er forbundet med prostatakreft og tykktarmskreft [30], [31]. Metabolitter forbundet med tumorcellemetabolic omprogrammering eller kanskje tumor-stromal interaksjoner kan forventes å vise en forandring i nivåer ikke bare i tumorvevet i seg selv, men også i matrikser slik som blod eller urin som understøtter opptak eller utskillelse av biokjemikalier forbundet med tumorvekst eller invasjon. Flere undersøkelser har rapportert om nytten av metabolitten biomarkører til å diagnostisere, stratify og overvåke kreftpasienter [31] -. [34]
Denne studien profilerte 430 urinprøver fra to årskull av fag, med kjent positiv eller negativ BCA diagnoser og som sådan representerer den mest omfattende screening for blærekrefturin metabolitt biomarkører til dags dato. Tidligere studier har målt et begrenset antall av metabolitter i urin (typisk mindre enn 25). Den ikke-målrettede UPLC /massespektrometri basert teknologi plattform som anvendes i denne studien letter identifikasjon og kvantifisering av relative 500 kjemiske forbindelser, i urinprøver, i stor grad å utvide antallet potensielle biomarkører kandidater enn de som er tidligere beskrevet. 25 metabolitter ble valgt ut fra kohort 1 for evaluering i det uavhengige kohorten to datasett. De 25 biokjemikalier identifisert som kandidat biomarkører dekket et bredt spekter av metabolske veier. Mens 25 kandidat biomarkør sett inneholdt både økt og redusert metabolitter – valgt å beste utforske multi-analyse prediktiv algoritmer – hypoteser for økt urin metabolitter i BCA er lettere generert enn hypoteser for redusert metabolitter. Økte metabolitter kan utlede fra tumor metabolitter utskilles i urinen eller fra nedbryting eller endring av ikke-ondartet vev forårsaket av invasjonen av tumoren gjennom epitelet veggen. Betennelsesreaksjoner som følge av tilstedeværelsen av svulst kan også føre til økte nivåer av metabolitter. Reduksjoner i metabolitter kan skyldes en lavere rate av metabolitt utskillelse av tumorceller i forhold til normale epitel eller ved et opptak av metabolitter fra urinen inn i svulsten eller tilstøtende vev. Endringer i systemisk metabolisme forårsaket av faktorer utgitt av blæren svulster eller ombygd tilstøtende vev og utskillelse påfølgende urin, kan også føre til endringer i urin metabolitter, både øker og minker. 25 metabolitter ble valgt som biomarkør kandidater fra kohorten 1 datasett basert på flere kriterier. Den tilfeldige skogen analyse teste de 25 metabolitter mot kohorten to datasett illustrert at en undergruppe av 25 skilte seg ut som bedre utøvere. Palmitoyl sphingomyelin, laktat, adenosin og succinate hadde høyest prediktiv verdi, med andre metabolitter vise et utvalg av reduserte verdier. En mulig forklaring på den svakere resultat av mange av de kohort 1 kandidat biomarkører kan være at kohort en blærekreft positive urinprøver ble hentet fra en høyere prosentandel av personer med høy scene /høygradige svulster enn de som er tilstede hos personer fra kohort 2. Det er også mulig at mange av kohorten 1 kandidat biomarkører var falske positive resultat av unike funksjoner av den aktuelle prøven befolkningen
de 25 kohort en kandidat biomarkører representerer et mangfoldig sett av metabolske veier -. delvis fordi veien mangfold var et filter for valg av sett av 25 fra 200 metabolitter med statistisk signifikante forskjeller sammenligner kohort 1 BCA positive urinprøver fra den kombinerte gruppen av alle negative kontroller. Flere veier representert ved søker metabolitter var av spesiell interesse. En stor metabolsk kjennetegn på kreft er ofte observert skiftet fra oksidativ fosforylering i større avhengighet av glukosemetabolismen gjennom glykolyse, selv under aerobe forhold (Warburg metabolisme) [35]. Mens mange forskjellige mekanismer som antas å bidra til denne bryteren i metabolsk aktivitet, inkluderer resultatene økt opptak og forbruk av glukose, økt laktatproduksjon og utskillelse, forhøyet citrat produksjon og øket pentose-fosfat-reaksjonsveien (PPP) aktivitet. Oppregulering disse banene gir energi, fettsyre, nukleotid-biosyntese, og NADPH generasjon [36], [37]. Laktatnivåer ble signifikant økt i urinprøver fra pasienter med blærekreft i kullene 1 og 2, og kan være en indikasjon på øket glykolyse i BCA-celler. I tillegg til laktat, ble β-hydroxypyruvate, som ikke tidligere har vært knyttet til tumor metabolisme, signifikant forhøyet i urinen hos primærblærecancer fag. β-hydroxypyruvate kan kobles til glykolyse skjønt dens formasjon via den serin-pyruvat-transaminase reaksjon eller dens avledning fra glykolysen mellomproduktet 3-fosfoglycerat [38].
Tre metabolitter assosiert med lipidmetabolisme, palmitoyl sphingomyelin, og fosfokolin arachidonat (kohort 2 only) ble betydelig endret i urinen til BCA fag. Dette var noe overraskende siden;
