Abstract
Formålet med denne studien var å evaluere chemopreventive effekten av en roman flavonoid, ampelopsin (AMP) på vekst og metastasering av prostata kreft celler. AMP viste mer potent hemmer proliferasjonen av androgen-følsomme LNCaP og, i mindre utstrekning, androgen-uavhengig PC-3 human prostatacancercellelinjer in vitro, primært ved induksjon av apoptose assosiert med nedregulering av bcl-2. På den annen side, AMP viste mye mindre aktivitet ved hemming av proliferasjonen av normale prostata epitelceller enn for prostata kreftcellelinjer. AMP også hemmet migrering og invasjon av PC-3-celler in vitro assosiert med nedregulering av ekspresjon CXCR4. I dyrestudie ved hjelp av en ortotopisk prostata tumormodell, AMP (150 og 300 mg /kg kroppsvekt) hemmet veksten av PC-3 svulster og lymfeknute og lungemetastaser i en doseavhengig måte. Sammenlignet med kontrollmusene, mus behandlet med AMP ved 300 mg /kg kroppsvekt hadde redusert endelig tumorvekt av 49,2% (P 0,05), lymfeknutemetastaser med 54,5% (p = 0,3) og lungemetastaser med 93% (P 0,05), men hadde ingen tydelig endring på matinntaket eller kroppsvekt. Den in vivo antivekst og antimetastase aktivitetene til AMP var assosiert med induksjon av apoptose og inhibisjon av proliferasjon av prostata kreftceller, reduksjon av prostata tumor angiogenese, og reduksjon av CXCR4 uttrykk. Våre resultater gir støtte bevis for å rettferdiggjøre videre undersøkelser for å utvikle AMP som en roman effektiv og trygg kandidat middel mot progresjon og metastasering av prostata kreft
Citation. Ni F, Gong Y, Li L, Abdolmaleky HM, Zhou JR (2012) flavonoid Ampelopsin hemmer veksten og metastasering av prostatakreft in vitro og i mus. PLoS ONE 7 (6): e38802. doi: 10,1371 /journal.pone.0038802
Redaktør: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 27 desember 2011; Godkjent: 10 mai 2012; Publisert: 05.06.2012
Copyright: © 2012 Ni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av stiftelsen av kinesiske departementet for helse Forente Fujian Provincial Health and Education (WKJ2008-2-60), Foundation of Fujian Provincial Department of Science Technology (2011Y0015) og Stiftelsen Scientific Research of Exploitation på Industrial Technology Fujian Development and Reform Commission (2008-762) til FN, og Department of Defense (PC073988) og NCI /NIH (R21 CA133865) til JRZ. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av menuscript
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
prostatakreft er den vanligste invasiv kreft og den nest største årsaken til kreftdød i menn i USA det er anslått at 241,740 nye tilfeller av prostatakreft vil bli diagnostisert og ca 28 170 menn ville dø av prostatakreft i USA i 2012 [1]. Nåværende behandlingsformer for prostatakreft vanligvis har variabel effektiviteten, utvikle metastaser og narkotika-motstand, og har høy toksisitet for normale vev. Derfor forblir søker etter effektive regimer med moderate negative effekter for chemopreventive intervensjon av prostatakreft topp prioritet i prostata kreft forskning.
Bioaktive komponenter i planter og urtemedisiner kan gi effektive og trygge kandidater for chemoprevention og /eller terapi av kreft. Klassiske kinesiske medisinske tekster inneholder omfattende empiriske registreringer av botaniske behandlinger som brukes til å behandle pasienter med kreft og kreftrelaterte systemer. Imidlertid er de fleste av disse kandidat botaniske formler anbefales basert på kliniske observasjoner bare. Videre disse kliniske observasjoner var nesten alltid fra ukontrollerte, observasjonsstudier eller anekdotiske case rapporter. Inntil ganske nylig har det vært begrenset innsats for å utvikle preklinisk, mekanistisk, vitenskapelig vurdering av botaniske urteprodukter som en forutsetning for kliniske studier.
Den kinesiske urten
Ampelopsis grossedentata
er utbredt i sør-Kina og brukes til å behandle kaldt og tinea corporis. Den inneholder en rik kilde av fytokjemikalier med ampelopsin (AMP, (2R, 3R) -3,5,7-trihydroksy-2- (3,4,5-trihydroksyfenyl) -2,3-dihydrochromen-4-on) hoved flavonoid. AMP er også kalt dihydromyricetin og har en lignende struktur for å myricetin (3,5,7-trihydroksy-2- (3,4,5-trihydroksyfenyl) -4-chromenone), en naturlig forekommende flavonoid som finnes i druer, bær, frukt, grønnsaker, urter og andre planter med visse antikreftaktiviteter. Som hoved bioaktive bestanddelen i
Ampelopsis grossedentata, etter AMP viste seg å være hovedsakelig ansvarlig for de rapporterte biologiske aktiviteter, inkludert hypoglycemic [2], anti-oksidativ [3], [4] og hepatoprotektiv [4], [5] aktiviteter. AMP også forbedret chemokinesis og kjemotaksis effekter av neutrofile granulocytter og monocytter [6].
AMP har vist seg å ha visse anti-kreft-aktivitet. AMP hemmet veksten [7] og invasjon av melanomceller in vitro [8], [9], og hemmet tumormetastase av melanom in vivo [8], [9]. AMP hemmet veksten av lungesvulster in vivo ved å hemme proliferasjon [10]. AMP hadde anti-angiogenese-aktivitet ved å hemme sekresjon av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) fra humane leverkreft celler in vitro og også hemmet veksten av humane leverkreft hos mus [11]. AMP også reverseres multilegemiddelresistens i leukemiceller in vitro delvis via reduksjon av ekspresjon av p-glykoprotein [12]. På den annen side, har effekten av AMP på veksten og utviklingen av prostatakreft ikke undersøkt.
Formålet med denne studien var å systematisk evaluere AMP som en potensiell chemopreventive og terapeutisk kandidat mot prostatakreft progresjon av ved bruk av både in vitro og in vivo systemer, og for å belyse de underliggende cellulære og molekylære mekanismer for AMP handlinger. Våre resultater gitt eksperimentelle bevis for å støtte den fremtidige utviklingen av AMP som en effektiv og sikker kandidat middel for forebygging og /eller behandling av prostatakreft.
Resultater
Effekter av AMP, total flavonoid ekstrakt (TFE) og myricetin på spredning av prostatakreftcellelinjer og normale prostata epitelceller (PREC) in vitro
Vi først sammenlignet aktivitet blant AMP, TFE og myricetin i hemme spredning av prostatakreftcellelinjer og Prec. AMP renhet analyse ved høyytelse-væskekromatografi (HPLC) viste at AMP-renhet var omtrent 95%, og den representative HPLC-kromatogram er vist i fig. S1. TFE-konsentrasjonene ble beregnet på grunnlag av dens AMP-nivå, således at forskjellen i aktivitet mellom TFE og AMP skyldes andre fytokjemikalier i TFE. Som vist på fig. 1 (A, B, C), AMP og TFE viste tilsvarende aktivitet ved hemming av proliferasjon av prostata kreftceller eller normale prostataceller, tyder på at AMP er hoved bioaktive flavonoid i TFE. AMP eller TFE inhiberte proliferasjon av LNCaP-cellelinjen på IC
50 er i ferd med 25 uM (fig. 1A), og at av PC-3-cellelinjen på IC
50 s ca 60 uM (fig. 1B). På den annen side, AMP eller TFE viste mye mindre aktivitet ved hemming av proliferasjonen av normale prostata epitelceller enn for prostata kreftcellelinjer (fig. 1C), som tyder på at AMP eller TFE kan ha moderat /minimal bivirkning.
A: den doseavhengige virkninger av AMP, TFE og myricetin for spredning av androgen-følsomme LNCaP-cellelinje; B: Den doseavhengige virkninger av AMP, TFE og myricetin for spredning av androgen-uavhengig PC-3-cellelinjen; C: Den doseavhengige virkninger av AMP, TFE og myricetin på proliferasjonen av Prec. Verdiene er middelverdier ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter, hvert i triplikater.
I motsetning til dette viste myricetin mer potent aktivitet ved hemming av proliferasjonen av Prec enn den for LNCaP eller PC-3. Selv myricetin hemmet veksten av prostatakreft cellelinjer på IC
50s 60 mikrometer (Fig. 1A, 1B), det hemmet veksten PREC cellene på IC
50 ca 35 mikrometer (fig 1c). På grunn av den potente anti-kreft aktivitet og minimal bivirkning av AMP, ble det brukt for videre evaluering.
Effekter av AMP på cellecyklusprogresjonen av prostatakreftcellelinjer in vitro
AMP på 25 og 50 uM betydelig økt brøkdel av LNCaP-celler i S-fasen fra 20% til 28% (P 0,05) og 74% (P 0,001), henholdsvis (figur 2B.). På den annen side, AMP 25 og 50 uM øket brøkdel av PC-3-celler i S-fasen fra 22% til 28% (P 0,05) og 34% (P 0,05), henholdsvis (Fig. 2E), og i G2 /M fase fra 17% til 23% (p 0,05) og 24% (p 0,05), henholdsvis (figur 2F).
A, B og C:. Den doseavhengige virkning av AMP på fordelingen av LNCaP-celler ved G1 (A), S (B) og G2 /M (C) faser; D, E og F: Den doseavhengige effekt av AMP på fordelingen av PC-3-celler ved G1 (D), S (E), og G2 /M (F) faser. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter, hvert i duplikater. Innenfor panelet, verdien med en bokstav er signifikant forskjellig fra den for kontrollprøven, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p. 0,001
Flere cellesyklus relaterte biomarkører, slik som celledeling syklus 2 (CDC2), CDC25c, cyclin B1 og cyclin-avhengig kinase 2 (CDK2), ble bestemt ved Western blot analyse. AMP vesentlig downregulated CDK2 proteinnivå i LNCaP-celler (fig. 3B, 3C) og CDC2 proteinnivå i PC-3-celler (fig. 3E, 3F), men ikke i andre cellesyklusrelaterte biomarkører.
A og D : den doseavhengige effekt av AMP på andelen av DNA-fragmentering (sub-G
0), en markør for apoptose, i LNCaP (A) og PC-3 (D) cellelinjer; B og E: De representative Western blot-bilder som viser virkningen av AMP på proteinnivåer av cellesyklusprogresjon og apoptose-relaterte biomarkører i LNCaP (B) og PC-3 (E) cellelinjer; C og F: Kvantifisering av vesentlig endrede proteinnivåer i LNCaP (C) og PC-3 (F) cellelinjer ved densitometri etter normalisering til p-aktin. Bildene for kvantifisering var fra minst to uavhengige forsøk. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter, hvert i duplikater. Innenfor panelet, verdien med en bokstav er signifikant forskjellig fra den for kontrollprøven, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p. 0,001
Effekter av AMP på apoptoseinduksjon av prostata kreft cellelinjer in vitro
AMP også betydelig økt prostata kreft celle DNA fragmentering, et kjennetegn for apoptose. AMP ved 25 og 50 uM signifikant induserte DNA-fragmentering av LNCaP-celler med 15 ganger (P 0,001) og 70-fold (P 0,001) henholdsvis (Fig. 3A), og PC-3-celler med 86% (P 0,05 ) og 270% (P . 0.001) henholdsvis (figur 3D), sammenlignet med tilsvarende kontroller. LNCaP-celler ble ytterligere behandlet med AMP ved 25 og 50 uM og apoptose-relatert molekylære markører ble bestemt ved Western blot-analyse. AMP fremkalt apoptose av LNCaP og PC-3-celler assosiert med nedregulering av Bcl-2 (fig. 3B, 3C, 3E, 3F).
apoptoseinduksjon effekten AMP på PC-3-cellelinjen ble ytterligere bekreftet bruker Annexin V-PI flowcytometri analyse. AMP viste dose- og tidsavhengige effekter på indusere PC-tre celle apoptose (fig. S2).
Effekter av AMP om migrasjon og invasjon av PC-3 celler og nedregulering av CXCR4 protein nivå in vitro
PC-3 cellelinjen ble anvendt for å evaluere virkningen av AMP på prostatakreft celle migrering og invasjon. AMP ved 25 og 50 uM inhiberte signifikant PC-3-celle migrasjon med 26% (P 0,05) og 63% (P 0,01), henholdsvis (figur 4A.), Og invasjon av 27% (P 0,05) og 45% (P 0,01), henholdsvis (figur 4B.). Den inhiberende virkning av AMP på PC-3-celle-migrering og invasjon ble assosiert med nedregulering av CXCR4 proteinnivå (Fig. 4C, 4D), en viktig biomarkør for kreftcelleinvasjon og metastase. Under den eksperimentelle betingelse (16-timers behandling), ble AMP ikke føre til PC-3-celle cytotoksisitet, som målt ved trypan-blå-analysen (fig. S3). Det tyder på at de observerte anti-migrerings og anti-invasjons aktivitetene til AMP er ikke sekundært på grunn av sin cytotixicity
A.: Den doseavhengige effekt av AMP på migrering av PC-3-celler; B: Den doseavhengige effekt av AMP på invasjon av PC-3-celler; C: Den doseavhengige effekt av AMP på CXCR4 proteinnivåene i PC-3 celler; D: Kvantifisering av CXCR4 proteinnivåer i PC-3-celler ved densitometri etter normalisering til p-aktin. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter, hver i duplikat. Innenfor panelet, verdien med en bokstav er signifikant forskjellig fra den for kontrollprøven, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p. 0,001
Effekter av AMP på vekst og metastasering av androgen-uavhengig PC-3 prostatakreft og modulering av tumor celleproliferasjon, apoptose og CXCR4 uttrykk og tumor angiogenese hos mus
An ortotopisk PC-3 tumordyremodell ble anvendt for å evaluere virkningen av AMP på å hindre vekst og metastasering av prostata svulst. AMP inhiberte både tumorvekst og metastaser in vivo på en doseavhengig måte. AMP ved 150 og 300 mg /kg kroppsvekt reduseres den endelige tumorvekten med 28% (P 0,05) og 52% (P 0,05) henholdsvis (Fig. 5A), noder hemmet lymfeknutemetastaser med 27% (P 0,05) og 43% (P 0,05) henholdsvis (fig. 5B), og inhiberte lungemetastaser hos 57% (P 0,05) og 86% (P 0,05) henholdsvis (figur 5C.). De representative bilder av lungemetastaser er vist i fig. S4. På den annen side, AMP behandlinger ikke vesentlig endre total matinntak (fig. 5D), eller endelig kroppsvekt (fig. 5E).
Verdier er middelverdi ± SEM gruppe (n = 8 /gruppe). Innenfor panelet, verdien med en bokstav er signifikant forskjellig fra den for kontrollprøven, a, p. 0,05
Analyser av cellulære markører viste at AMP behandling signifikant induserte prostatakreft celle apoptose med 200% (fig. 6A, P 0,001), redusert prostatakreft celleproliferasjon med 60% (fig 6B, P . 0.001) og hemmet prostata svulst angiogenese ved 58% (fig. 6C, P 0,05). Disse resultatene bekrefter at AMP hemmet veksten av prostata tumorer ved å indusere apoptose, redusere proliferasjon, og inhibering av prostatatumor angiogenese in vivo. De representative bilder av cellulære biomarkører er vist i fig. S5. Den AMP behandling også redusert CXCR4 protein uttrykk med 30% i prostatakreft (Fig 6D, P . 0,05).
Verdier er gruppe gjennomsnitt ± SEM (n = 8 /gruppe). Innenfor panelet, verdien med en bokstav er signifikant forskjellig fra den for kontrollprøven, a, p 0,05; c, p. 0,001
Diskusjoner
I denne studien fant vi at AMP vesentlig hemmet spredning av prostata kreft cellelinjer via apoptoseinduksjon forbundet med nedregulering av BCL2 uttrykk, og undertrykt prostatakreft celle migrering og invasjon assosiert med nedregulering av CXCR4 ekspresjon in vitro. Den dyrestudie videre bekreftet at AMP betydelig redusert endelig tumorvekt assosiert med indusering av prostatakreft celle apoptose, inhibering av prostatacancer celleproliferasjon og redusere prostata tumor angiogenese, og i betydelig grad hemmet lungemetastaser. På den annen side, AMP ved effektive doser som ikke viser signifikant negativ effekt på matinntaket eller kroppsvekt. Dette er den første studien, etter beste overbevisning at demonstrerte den hemmende effekten av AMP på vekst og metastasering av prostata cancer in vitro og i en klinisk relevant orthotopic tumormodell.
Cellular mekanisme studier viste at AMP hemmet spredning av prostata kreft celler. Interessant, AMP arrestert LNCaP-celler i S-fase (Fig. 2B) delvis gjennom nedregulering av CDK2 (fig. 3B, 3C), et biomarkør avgjørende for G1 /S overgang, mens det arrestert PC-3-celler ved S og G2 /M-faser (fig. 2E, 2F) assosiert med nedregulering av CDC2 (fig. 3E, 3F). CDC2, også kjent som CDK1 (cyklinavhengig kinase 1), spiller en viktig rolle i cellesyklusen fremgang. CDC2 kombinerer vanligvis med cyclin B og regulerer S og G2 /M fase progresjon. CDC2 har vært ansett som et viktig mål for molekylær utforming av terapeutiske anti-kreft legemidler [13]. Nedregulering av CDC2 kan tilveiebringe en viktig molekylær mekanisme som AMP arresterer cellesyklusutvikling av PC-3-cellene ved S og G2 /M-fasene. Analyse av in vivo-tumorprøver også bekreftet at AMP inhiberte PC-3-tumorvekst assosiert med inhibisjon av tumorcelle-proliferasjon (fig. 6B).
Induksjon av prostatakreft celle apoptose er også en viktig mekanisme ved hvilken AMP sperre veksten av prostatakreft. AMP fremkalt apoptose av prostata kreftceller in vitro (Fig. 3A, 3D) og in vivo (Fig. 6A). Videre undersøkelser viste at induksjon av apoptose ble forbundet med nedregulering av BCL-2 protein nivåer (Fig. 3C, 3F). Bcl-2 er en viktig regulator av apoptose. Uttrykk av BCL-2 er hyppigere i høyverdig svulster og metastaser enn i lavere grad og ikke-metastatisk svulster [14], [15]. Apoptoseresistens er assosiert med høyere nivåer av BCL-2 [15], [16], og nedregulering av bcl-2 sensitizes prostatakreftceller til å gjennomgå apoptose [17]. Derfor, nedregulering av bcl-2 kunne representere et viktig molekylære mekanismen ved hvilken AMP induserer apoptose prostatakreft.
Angiogenese er et kritisk trinn i tumorvekst [18]. Veksten av alle faste tumorer er avhengig av angiogenese og undertrykkelse av tumor blodkar gir en ny mulighet for forebygging og behandling av kreft [19]. Tidligere studier viste at AMP hadde anti-angiogenese-aktivitet ved å hemme sekresjon av pro-angiogen faktor VEGF og bFGF fra humane leverkreft-celler in vitro [11]. I denne studien demonstrerte vi at AMP hemmet veksten av PC-3 prostata tumor assosiert med inhibisjon av tumor angiogenese (Fig. 6C). Selv om vi ikke måle VEGF og bFGF nivåer in vivo, våre resultater gitt tankevekkende eksperimentelle bevis for å støtte at en av de mekanismer som AMP hemmer tumorvekst er via hemme angiogenese. Videre undersøkelser er nødvendig for å bestemme de underliggende molekylære mekanismer som AMP hemmer tumor angiogenese.
Tidligere studier har vist at AMP hemmet in vitro invasjonen og in vivo metastase evne B16 melanom [8]. Det har imidlertid ikke blitt studert hvis AMP hadde anti-metastase-aktivitet i prostata kreft. Våre resultater viste at AMP hadde potente aktivitet ved inhibering av migrering og invasjon av prostatacancerceller in vitro og prostata cancer metastase i ortotopisk prostata tumordyremodell assosiert med nedregulering av ekspresjon CXCR4. CXCR4 er involvert i flere sykdommer som angiogenese, metabolske og nevrologiske lidelser, leddgikt og i ulike former for metastatisk kreft. CXCR4 er en kritisk faktor i invasivitet og spredning av brystkreftceller [20], [21], [22], og spiller en sentral rolle for vekst av ondartet neuronal og glial-tumorer [23]. CXCR4-inhibitorer er foreslått for behandling av forskjellige former for metastatisk kreft [24], [25], [26]. AMP er vist å være et lite molekyl CXCR4-antagonist [27], [28]. Selv om vi ikke undersøke om CXCR4 var en direkte molekylære mål for AMP, våre studier tyder på at en av de molekylære mekanismer som AMP hemmer prostata cancer metastase kan skje via nedregulering av CXCR4 ekspresjon og funksjon. Videre undersøkelser i å søke AMP og /eller dets derivater som nye anti-metastase midler for å forsinke og /eller forebygge kreft metastase kan ha betydelige konsekvenser for forebygging og behandling av kreft.
I konklusjonen, resultatene fra denne studien gitt kritisk viktig eksperimentelle bevis som tyder på at AMP kan være en roman effektiv og trygg kandidat middel for å hemme vekst og metastasering av prostata kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
alle prosedyrer med dyr ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Beth Israel Deaconess Medical Center med guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
TFE, AMP og myricetin
En proprietær utvinning prosedyre ble brukt til å trekke TFE fra
Ampelopsis grossedentata
med AMP innhold på ca 80%. AMP ble renset fra TFE ved preparativ HPLC; og renheten ble bekreftet ved analytisk reversfase HPLC. Myricetin ble kjøpt fra LKT Laboratories (St. Paul, MN). HPLC-analyse ble brukt for å kontrollere kvaliteten av materialet. Alle materialer ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO) for cellekulturstudier.
Kultur av prostata kreft celler, normale prostata epitelceller og endotelceller
To menneskelige prostata kreft cellelinjer, androgen-sensitive LNCaP og androgen-uavhengig PC-3 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) ble benyttet for in vitro-eksperimenter. Humane prostatacancercellelinjer ble opprettholdt som monolagskulturer i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 umol L-glutamin /ml, 100 U penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml i en 95% luft, 5% CO
2, og vannmettet atmosfære. Prec celler ble kjøpt fra Lonza (Walkers, MD) og dyrket i PrEGM pluss EGM-2 singlequotes (Lonza, Walkers, MD) i en fuktig atmosfære av 95% luft og 5% CO
2.
celle~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP
effekten av AMP, TFE og myricetin på cytotoksisiteten av prostata kreftceller eller Prec ble bestemt ved anvendelse av celle Titer Aqueous 96 celleproliferasjonsanalyse (Promega, Madison, WI) som vi tidligere beskrevet [29] . Assayet bestemmer antall levedyktige celler i proliferasjon, cytotoksisitet og kjemosensitivitet. Alle analyser ble uavhengig gjentas minst tre ganger, hver i triplikat, og resultatene ble bekreftet ved direkte celle-telling ved bruk av et hemocytometer.
Analyse av prostatacancer cellesyklusprogresjon og DNA-fragmentering
Effekten av AMP-behandling på cellesyklusfordelingen av prostatakreftcellelinjer ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri å følge de beskrevne fremgangsmåtene [30]. Celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AMP ble høstet, farget med propidiumjodid (til en endelig konsentrasjon på 50 ug /ml) og RNase (til en endelig konsentrasjon på 50 ug /ml) og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Fargede celler ble deretter analysert ved hjelp av FACScan (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA) for cellesyklusfordeling og fragmentert DNA. Forsøkene ble uavhengig gjentas minst tre ganger, hver i to eksemplarer.
Annexin V og PI farging for apoptose deteksjon
Effekten av AMP på apoptose av PC-3 celler ble videre bestemt av Annexin V-PI apoptose deteksjon kit (Chemicon International Inc, Billerica, MA) etter instruksjon av kit. Kort beskrevet, ble behandlet PC-3-celler resuspendert i Annexin V-løsning og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter, PI ble deretter tilsatt til en 5-minutters inkubering i mørket. Apoptotiske celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA). Forsøkene ble uavhengig utført minst to ganger, hver i duplikater.
Kreft celle migrasjon og invasjon analyser
En suspensjon av PC3 celler (6000 celler for migrasjon og 30000 celler for invasjon) i 250 mL av serumfritt DMEM med AMP eller bærer (DMSO) ble lastet inn i en fibronektin-belagt innsats for migrering assay eller et matrigel belagt innsats for invasjon assay (BioCoat, 24-brønners plate, 8 um, Becton Dickinson). Hver kultur innskuddet ble satt inn i en brønn som inneholder 750 pl DMEM med 5% FBS. Etter inkubasjon i 16 timer ved 37 ° C, ble celler på toppen av innsatser fjernes forsiktig med en bomullstupp, og cellene på undersiden av innsatsen membranen ble farget med Diff-Quick (Dade fargende oppløsninger Behring Inc., Newark, dE) og bildene ble tatt til fange. Cellene ble tellet under et mikroskop. Alle analyser ble uavhengig utført minst tre ganger, hver i tre eksemplarer.
For å bekrefte at anti-migrasjon og anti-invasjons aktiviteter AMP var ikke sekundært på grunn av sin cytotoksisitet til PC-3 celler, PC-3 celler ble behandlet med AMP (0, 25, og 50 uM) i 16 timer, og celletall ble målt ved trypan blå eksklusjon assay. Forsøket ble utført uavhengig er minst tre ganger, hver i duplikat.
Western blot-analyse
For in vitro-studie, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AMP, ble cellelysater fremstilt, og protein -nivåer ble bestemt ved Western blot-analyse ved å følge prosedyrene vi som tidligere er beskrevet [31]. De primære antistoffene anvendt i Western blot mot humane antigener var som følger: cyklin B1 (1:200), cdc2 (1:500) og bax (1:500) (Oncogene Forsknings Products, Boston, MA), bcl-2 (1 :100), p21 (1:200) og p53 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), CDK2 (1:1,000) (Selleck Chemicals, Houston, Texas), CXCR4 (1:200) ( R (Ii) AMP ved 150 mg /kg kroppsvekt (BW); og (iii) AMP ved 300 mg /kg kroppsvekt. Hver mus ble deretter implantert orthotopically med PC-3 celler (2 × 10
6 celler /50 mL) og fortsatte på de tilsvarende behandlinger hele forsøket. Matinntak og kroppsvekt ble målt ukentlig. Ved slutten av eksperimentet (8 uker etter PC-3-celle implantasjon), ble musene avlivet; primære tumorer ble skåret ut og veiet. En svulst stykke fra hver primær svulstvev ble nøye dissekert og fiksert i 10% buffer-nøytralisert formalin, parafin-embedded, og seksjonert i 4 mikrometer tykkelse for immunhistokjemi. Alle prosedyrer med dyr ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Beth Israel Deaconess Medical Center med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr [32]. Den dyrestudie ble gjentatt.
In situ påvisning av apoptotiske indeks
apoptotiske celler ble bestemt ved en terminal deoksynukleotidyl-transferase-mediert deoksyuridin trifosfat-biotin nick ende merking (TUNEL) analyse (Chemicon International Inc , Billerica, MA) etter våre beskrevet protokoller [30], [33], [34]. Seks representative områder av hver seksjon uten nekrose ble valgt og begge apoptotiske celler og totalt kjerner celler ble tellet under et lysmikroskop ved 400 x forstørrelse. Den apoptotiske indeksen ble uttrykt som prosentandelen av positive apoptotiske tumorceller i forhold til totale tumorceller, og effekten av behandlingen på apoptose ble uttrykt som prosent av kontroll.
Immunhistokjemisk bestemmelse av tumorcelle-proliferasjon
indeksen proliferasjon ble bedømt ved å beregne hvor stor andel av cellene med Ki-67-farging, ifølge fremgangsmåtene i laboratoriet [31]. Både Ki-67-positive prolifererende celler og totale tumorceller ble telt i seks ikke-nekrotiske områder av hver seksjon ved hjelp av lysmikroskop ved 400 x forstørrelse. Indeksen proliferasjon ble beregnet som prosentandelen av Ki-67-positive tumorceller i forhold til totale tumorceller, og effekten av behandlingen på proliferasjon ble uttrykt som prosent av kontroll.
Immunohistokjemisk påvisning av microvessel tetthet (MVD )
MVD ble anvendt som en markør for tumor angiogenese og kvantifisert ved immunhistokjemisk farging av faktor VIII etter vår tidligere beskrevne metoden [30], [33], [34]. MVD ble beregnet ved å telle microvessels på 200 × felt under lett mikroskopi på seks representative områder uten nekrose av hver del, og effekten av behandlingen på angiogenese ble uttrykt som prosentandelen til kontrollen.
Statistisk analyse
Resultatene ble uttrykt som gruppe middelverdier ± SEM og analysert for statistisk signifikans ved analyse av varians [35], etterfulgt av Fishers beskyttede minste signifikante forskjell basert på to-side-sammenligninger mellom forsøksgruppene ved hjelp av Statview 5,0 program (SAS Institute, Inc. , Cary, NC). En
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
representativt kromatogram som viser renheten av AMP ved analytisk reversfase HPLC. HPLC eksperimentelle betingelsene var: Instrument: Waters 2695 med auto-sampler og bildet diode array (PDA) detektor; HPLC-kolonne: Phenomenox C-18 (5 um i indre diameter, 10 x 250 mm); Mobile faser: A (H
2o med 0,1% eddiksyre) og B (acetonitril); Gradient betingelse: 0-30 min, 5% B til 35% B; 30-35 minutter, 35% B til 95% B; 35-40 minutter, 95% B til 5% B; 40-45 min, 5% B; Strømningshastighet:. 1 ml /min
doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Representative FACS-histogrammer som viser den tidsavhengige effekt av AMP-behandlinger (0, 20, og 50 uM) på apoptose av PC-3-celler, som målt ved hjelp av Annexin-PI strømningscytometri-analyse.
doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
virkningen av AMP på PC-3-celle cytotoksisitet, som målt ved trypan blå eksklusjon assay. Cellene ble behandlet med AMP ved forskjellige konsentrasjoner i 16 timer, på samme tid som brukes for migrering og invasjon analyser. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter, hvert i duplikater. Verdiene er statistisk ubetydelig blant grupper
doi:. 10,1371 /journal.pone.0038802.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
