Abstract
Aktivering av hypoksi induserbar transkripsjonsfaktor HIF og NF-ĸB veien fremmer betennelse-mediert tumorprogresjon. Den cellulære transkripsjonsfaktor ZNF395 har gjentatte ganger blitt funnet overexpressed i ulike kreft hos mennesker, særlig respons på hypoksi, noe som tyder på en funksjonell relevans. For å forstå den biologiske aktiviteten til ZNF395, identifiserte vi målgener av ZNF395 gjennom et genom-wide uttrykk skjerm. Indusert ZNF395 uttrykk førte til oppregulering av gener som er kjent for å spille en rolle i kreft, så vel som en undergruppe av interferon (IFN) stimulert gener (ISG) som er involvert i antivirale responser som IFIT1 /ISG56, IFI44 og IFI16. I celler som mangler ZNF395, ble IFN-α-mediert stimulering av disse faktorene svekket, noe som viser at ZNF395 er nødvendig for full induksjon av disse antivirale gener. Forbigående transfeksjoner avslørte at ZNF395-mediert aktivering av IFIT1 /ISG56 promoter avhenger av de to IFN-stimulerte respons-elementer i promoteren og på den DNA-bindende domene av ZNF395, en såkalt C-klemme. Vi viser også at IĸBα kinase (IKK) -signaling er nødvendig for at ZNF395 å aktivere transkripsjon og samtidig forbedrer sin proteolytisk degradering. Således ZNF395 blir aktivert ved nivået for proteinmodifisering av IKK. Videre bekrefter vi at uttrykket av ZNF395 er indusert av hypoksi. Våre resultater karakteriserer ZNF395 som en ny faktor som bidrar til maksimal stimulering av en undergruppe av ISGs. Denne transkripsjonen aktivitet avhenger IKK signaliserer ytterligere støtte en rolle ZNF395 i det medfødte immunresponsen. Gitt disse resultatene er det mulig at under hypoksiske forhold, kan forhøyede nivåer av ZNF395 støtte betennelse og kreft progresjon ved å aktivere målet gener som er involvert i det medfødte immunforsvaret og kreft
Citation. Jordanovski D, Herwartz C, Pawlowski A, Taute S, Frommolt P, Steger G (2013) The Hypoksi-induserbare transkripsjonsfaktor ZNF395 styres av IĸB kinase-signale og aktiverer gener som er involvert i det medfødte immunrespons og kreft. PLoS ONE 8 (9): e74911. doi: 10,1371 /journal.pone.0074911
Redaktør: Karen L. Mossman, McMaster University, Canada
mottatt: 14 mars 2013; Godkjent: 07.08.2013; Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Steger et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (tilskudd til G. Steger, antall STE604 /5-1), Deutsche Krebshilfe og Koeln Fortune Program /det medisinske fakultet, Universitetet i Köln, Tyskland, gi nummer 220/2010. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
genuttrykk arrays gjentatte ganger funnet et uttrykk for den cellulære faktor ZNF395 (tidligere kalt PBF for papillomavirus bindende faktor) betydelig økt i ulike kreftformer som nyrecellekarsinomer, osteosarcomer og Ewing sarkom [ ,,,0],1,2,3,4]. Spesielt i glioblastomas og neuroblastomer, var ZNF395 blant noen oppregulert gener som var karakteristisk for en hypoksisk respons og assosiert med sykdom utfall [5,6]. ZNF395 også tilhørte genene oppregulert i ulike kreftcellelinjer ved hypoksi og ved overekspresjon av hypoksi-induserbare transkripsjonsfaktor-1α (HIF-1α) [7,8,9]. Disse dataene antyder at ZNF395 har en funksjonell rolle innen trasé som er involvert i hypoksi og kreft. Imidlertid er nesten ingenting er kjent om den biologiske aktivitet av ZNF395 i cellen.
Hypoksi reflekterende oksygenmangel forekommer ofte i u tumorer og er også et karakteristisk trekk ved akutt foci av vev betennelse. Prolyl- hydroksylaser (doktorgrad) Hydroksylering HIF-a subenheter og målrette dem til ubiquitin-avhengige ødeleggelser. Under forhold med hypoksi, doktorgrader er hemmet. HIF-a subenheter deretter akkumuleres og translocate til kjernen hvor de dimerisere med sin stabil partner HIF-1β, og binder seg til sine mål sekvens kjent som hypoksi respons element (HRE). HIF induserer ekspresjon av mer enn 100 gener som regulerer glukosemetabolisme, celleproliferasjon og celleoverlevelse, så vel som gener som driver angiogenese og induserer immuntoleranse (oversikt i [10]). Avvikende aktivering av NF-ĸB, nøkkelen immunrespons regulator, er et annet karakteristisk for mange kreftformer. Det er foran IĸB kinase (IKK) -mediert fosforyleringen av inhibitorer av NF-ĸB de IĸBα proteiner, noe som resulterer i deres proteasom-avhengig nedbrytning (oversikt i [11,12]). Den ikk Komplekset består av to katalytiske subenheter IKKβ og IKKα og regulatoriske IKKγ. NF-ĸB veien er avgjørende for det medfødte immunresponsen. Dette innledes ved gjenkjennelse av ikke-selv-assosierte patogene molekylmønstre (PAMPs) som detekteres av vertsmønstergjenkjenning reseptorer (PRR) som toll-lignende reseptor-3 (TLR3). Ved ligandbindende, dvs. viralt RNA, utløser TLR3 aktivering av kinaser TBK1 og IKK, som fører til fosforylering og aktivering av transkripsjonsfaktorer IRF3 og NF-ĸB, respektivt. IRF3 og NF-ĸB indusere en antiviral respons ved å øke ekspresjon av type I interferoner (IFN) IFN-α og IFN-β, som ble utskilt av de infiserte celler. Deres binding til type I IFN-reseptor stimulerer JAK-STAT vei for å aktivere transkripsjonsfaktor ISGF3. Komplekset deretter translocates inn i kjernen, binder seg til den IFN-stimulert responselement (SBR) og fremmer transkripsjon av IFN-stimulerte gener (ISGs), som koder for proteiner med antiviral aktivitet (gjennomgått i [13]). Den medfødte immunrespons og den hypoksiske responsen er forbundet siden hypoksi ikke bare stabiliserer HIF1-α, men også stimulerer aktivering av NF-ĸB [14]. Aktivert NF-ĸB ble vist til opp-regulerer uttrykket av HIF-1α [15,16,17,18]. IKKβ avslører også NF-ĸB uavhengige pro-tumorigene funksjoner, bestående IKKβ-mediert fosforylering av tumor suppressors FOXO3a og p53, henholdsvis, som utløser deres proteolytisk nedbrytning [19,20].
Vi har isolert den åpne lese ramme (ORF) for ZNF395 gjennom sin evne til å binde til regulatoriske sekvenser innenfor kontrollområdet av flere HPV-typer (PV) [21]. Det ble også funnet at proteinet binder til kontrollregionen av Huntingtons sykdom (HD) genet og ble kalt HDBP2 (HD-bindende protein 2) i denne studien [22]. ORF for ZNF395 er fylogenetisk konservert i virveldyr. Det er svært lik den GLUT4 enhancer faktor (GEF, HDBP1), som aktiverer genekspresjon av GLUT4, en glukosetransportør, og musen glukokortikoid-indusert gen 1 (GIG1, det humane genet ZNF704). Spesielt er disse proteinene dele de tre høyt konserverte regioner CR1, CR2 og CR3, og har potensial til å danne en sink finger struktur. ZNF395 ble karakterisert som en nucleo-cytoplasma skyt protein [22,23]. Overekspresjon av ZNF395 indusert celledød [24] og undertrykt både HD-arrangøren og den menneskelige PV type 8 (HPV8) promoter, som var avhengig av DNA binding av ZNF395 og på målretting SIN3 /HDAC1 /2 kompleks [25,26] . Vi var interessert i å identifisere andre målgener av ZNF395 og forstå kontroll over sin transkripsjonen aktivitet.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige hudkreft cellelinje RTS3b er beskrevet i [27] og ble vennlig levert av I. Leigh, London, UK. RTS3b celler ble opprettholdt i E-medium, den monocyttisk cellelinje U937 [28] i RPMI 1640, U87-MG og C33A celler i DMEM, alle media ble supplert med 10% FCS og antibiotika. U937, U87-MG og C33A celler ble kjøpt fra ATCC. Transiente transfeksjoner ble utført med X-tremeGENE reagens (Roche Diagnostics) i henhold til produsentens protokoll. 48 timer senere luciferaseaktivitet ble bestemt, som tidligere beskrevet [29]. De relative lysenheter ble normalisert ved proteinkonsentrasjoner av prøvene. Hvor angitt, polyI: C (Invivogen) ble tilsatt ved 10 ng /ml i 24 timer, TNFa (celle signalisering) ved 1NG /ml i 24 timer, BMS-345541 (Sigma-Aldrich) ved 5 uM i 24 timer, MG132 (Biomol) på 25 pm for 24h, og IFN-α (Biomol) ved 1000U /ml i 6 timer. Den RTS3b-TR-ZNF395 cellelinje ble dannet av stabilt transfektere pcDNA6 /TR, etterfulgt av en pcDNA4 /til vektor (begge fra Invitrogen) som koder for FLAG-merket ZNF395 under kontroll av tet-operatorelementer. Cellelinjen ble inkubert i doksycyklin (Dox) (1 ug /ml) i 24 timer for å indusere ekspresjon av FLAG-ZNF395. Hypoksisk responsen ble fremstilt ved å injisere N
2-gass inn i inkubatoren for å oppnå en O
2-konsentrasjon på 2%. Cellene ble deretter inkubert i 12 timer og umiddelbart høstes.
Plasmider
pcDNA3.1-FLAG-ZNF395, pcDNA3.1-FLAG-ZNF395ΔCR1 og pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtCR3 ble beskrevet tidligere [ ,,,0],23,25]. pcDNA3.1-FLAG-ZNF395mtNES ble generert ved seterettet mutagenese. Den ISG56-pGL3-Luc konstruksjon blir beskrevet av Grandvaux [30]. Delesjoner og punktmutasjoner innført enten ved kloning av egnede PCR-produkter til pGL3-Luc eller ved sete-rettet mutagenese. IFI44-Luc ble oppnådd ved å klone et PCR fragment generert fra genomisk DNA, som koder for 560 nukleotider av oppstrøms reguleringsområdet inkludert en i pGL3-Luc. Ekspresjonsvektoren for IRF3-5D er beskrevet av Lin et al. [31]. HA-IKKα (Addgene plasmid 15469), HA-IKKβ (Addgene plasmid 15470) og FLAG-IKKβ, FLAG-IKKβ-K44M, FLAG-IKKβ-S177 /181E (Addgene plasmider 11103, 11104, 11105), er publisert [32, 33].
RT-PCR, microarray
Total RNA ble utarbeidet av RNeasy Mini Kit fra Qiagen. cDNA syntese og hybridisering til Affymetrix Exon 1,0 ST utvalg ble utført av gruppen av Prof. Nürnberg (CCG, Köln, Tyskland). Rådata ble behandlet ved hjelp av Affymetrix Power Tools, versjon 1.12.0 og Robust Multiarray Average (RMA) algoritme [34]. Nedstrøms statistisk analyse ble utført ved hjelp av R språket for statistisk databehandling, versjon 2.10.0. For kvantitativ real-time PCR, 2 ug av RNA ble revers transkribert ved hjelp tilfeldig primer og Super VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen). Sanntids PCR ble utført med SybrGreen og et LightCycler system (Roche Diagnostics). Betydningen ble beregnet ved t-test med parede prøver. Primersekvensene er gitt i tabell 1. Våre microarray eksperimentdata ble avsatt på GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) og tildelt tilgangsnummer GSE44327.
Gene
Forward primer (5’to 3′)
Reverse primer (5’to 3´)
IFI16TGCACCCTCCACAAGCCATGGCTGTGGACATGIFI44TGGCAGTGACAACTCGTTTGACCGCTTCCCTCCAAAAISG56TCATCAGGTCAAGGATAGTCTGGGTGTTTCACATAGGCTAGTAGMEF2CGCCCTGAGTCTGAGGACAAGAGTGAGCTGACAGGGTTGCTPEG10AACAACAACAACAACTCCAAGTCTGCACCTGGCTCTGCAGIFIT2ACTGCAACCATGAGTGAGAACGCCTCGTTTTGCCCTTTGAGZNF395CGAAAAAGAAAGAACTCTGTGCTGTGTCCCCCAGATGGAGHPRTTGACACTGGCAAAACAATGCAGGTCCTTTTCACCAGCAAGCTTable 1. Primere som brukes for QRT-PCR.
CSV ned CSV
Small interfererende RNA interferens
Små interfererende RNA (siRNA, siGenome SMARTpool) ble oppnådd som en pool av fire glødet dobbelttrådet RNA ( dsrna) oligonukleotider: IKKα (M-003473-02) og IKKβ (M-003503-02) fra Dharmacon, ZNF395 (SC-77820) fra Santa Cruz Som en kontroll siRNA mot onkogen E6 av HPV8 (8E6) [35. ] ble brukt i samme mengder som de spesifikke siRNAs hhv. 6 cm-retter av U87-MG og RTS3b celler ble transfektert med 150pmol siZNF395, 250 eller 500pmol siIKKα, β eller riktig mengde kontroll siRNA hjelp Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) .
antistoffer, Chromatin Immunpresipitasjon (chip) analyse, gel shift
kanin polyklonale antistoff mot ZNF395 ble beskrevet tidligere [21]. den M2 FLAG antistoff var fra Sigma-Aldrich, anti- HA-antistoff fra Roche, anti-aktin antistoff fra Santa Cruz, og antistoffer mot IKKα og IKKβ var fra Cell Signaling. Fremstilling av hele celle-ekstrakter og co-immunoutfellinger ble utført som tidligere beskrevet [36]. Defosforylering reaksjoner ble utført med λ-fosfatase (Santa Cruz) i henhold til produsentens protokoll. ChIP analysen ble gjort i henhold til chip-analyse protokollen ved Upstate bioteknologi. Tilstedeværelsen av ISG56 promotorfragmenter i bunnfallet ble analysert ved hjelp av qPCR LightCycler systemet (Roche Diagnostics) og primer flankerende sekvensene fra -173 til 1 av ISG56 promoter (forover 5′-TGAGATCTGGCTATTCTGTCTTGTGG-3, den motsatte 5′-ATGGTTGCAGGTCTGCAGTTTATCTG -3′). Gel-skift ble utført som tidligere beskrevet [25] med de følgende ds oligonukleotid (bare den øvre del er gitt): SBR-wt: 5′-TTTAGTTTCACTTTCCCCTTTCGGTTTCCCTAGGT-3′; SBR-mut114 /101. 5′-TTTAGTGTCACTTTCCCCTGTCGGTTTCCCTAGGT-3′, som ble merket med
32P-γ-ATP eller brukes som konkurrenter
Resultater
ZNF395 aktiverer gener assosiert med medfødte immunrespons og kreft
Vi har isolert cDNA for ZNF395 fra HaCaT celler [21]. Av denne grunn har vi brukt en human keratinocytt-cellelinje for å undersøke de transkripsjonelle arrangementer som følge av ekspresjonen av ZNF395 ved oligonukleotid-mikromatriser. Siden vi har observert tidligere at overekspresjon av ZNF395 indusert hemming av cellevekst [23], genererte vi en cellelinje, basert på den hudkreft avledet RTS3b linje [27], slik at den induserbare ekspresjonen av ZNF395 styres av doksycyklin (Dox). Fem uavhengige kulturer ble inkubert enten i nærvær eller fravær av Dox. Mens en total proteinekstrakt ble fremstilt fra en prøve satt for å bekrefte ekspresjon av ZNF395 ved immunoblot (IB) (figur 1A), ble de gjenværende fire sett anvendes for isolering av total-RNA, som ble transkribert til cDNA, etterfulgt av hybridisering med Genechip menneskelig Exon 1,0 ST utvalg fra Affymetrix. Genekspresjon forskjeller ble vurdert av studentene t-test. Gener med en falsk funnrate p 0,05 og en fold endring 1,5 ble vurdert til å være forskjellig uttrykt. Ti kjente gener, som er oppført i tabell 2, vedtatt disse kriteriene. Seks av de ZNF395-induserte gener som er kjent for å bli regulert av IFN, som er IFIT1 (ISG56), IFIT2 (ISG54), IFI16, IFI44, CARD6, og SAMD9. Genene MACC1, PEG10, CALCOCO1, og MEF2C har blitt funnet å være innblandet i kreft (tabell 2). ZNF395 mediert aktivering av IFIT1 /ISG56, IFIT2 /ISG54, IFI44, IFI16, PEG10, og MEF2C i disse cellene ble bekreftet av kvantitativ (q) RT-PCR med RNA preparert fra Dox-behandlede RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler i forhold til RNA fra ubehandlede celler (figur 1B). Det er veldig overraskende at vi ikke oppdage eventuelle genet trykt av ZNF395 selv i reporter gen-analyser ZNF395 effektivt undertrykt spesifikke arrangører [25].
(A) stabilt transfekterte RTS3b celler som uttrykker tet repressor og FLAG-merket ZNF395 under kontroll av tet induserbare promoteren (sporene 3, 4) eller den tomme vektoren pcDNA4 /TO (kolonnene 1, 2) ble enten dyrket i fravær (banene 1 og 3) eller nærvær av Dox (sporene 2, 4) i 24 timer . Ekstraktene ble anvendt for immunblot (IB) som ble utviklet med FLAG-antistoff og et anti-actin-antistoff som kontroll. ns (uspesifikk Band) (B) Total RNA isolert fra RTS3b TR-FLAG-ZNF395 celler, enten vokst med eller uten Dox ble brukt for QRT-PCR for å analysere uttrykk av faktorene som vises i grafen. De tilsvarende verdier ble normalisert til verdiene for husholdningsgenet hypoxanthin guanin fosforibosyl transferase (HPRT), og de som er oppnådd fra celler dyrket i fravær av Dox ble angitt som en for hver faktor. Grafen representerer gjennomsnittene av to uavhengige eksperimenter hver utført i duplikat. Feilstolpene representerer standardavviket. (C, D) RTS3b og U87-MG-celler ble transfektert med kontroll siRNA eller siRNA målretting ZNF395 i duplikat. Ett sett av prøver ble behandlet med oppløsningsmiddel og den andre med IFN-α, før total-RNA ble isolert. QRT-PCR ble utført med den spesifikke primer for å forsterke ISG56, IFI44, IFI16 og ZNF395 transkripsjoner. CP-verdier på de ulike faktorene ble normalisert mot dem for husholdningsgenet HPRT. Verdien med RNA fra løsningsmiddel-behandlede celler transfektert med siControl ble angitt som en i hvert enkelt tilfelle. Bretteaktiveringer ble beregnet i henhold til sammenligningsterskelen fremgangsmåten beskrevet i Pfaffl et al. [64]. QPCRs ble utført fire ganger, og standardavvikene er angitt. Verdiene er gitt i figuren reflekterer ikke-indusert basal uttrykk nivå i fravær av ZNF395 (** p 0,01)
Gene navn.; tiltredelse
fold ind
t-test
fullt navn.; funksjon
Interferon regulert: IFIT1 /ISG56; NM_0186602.940.0087Interferon-indusert protein med tetratricopeptide gjentar en, antiviral aktivitet [38] IFI16; NM_0055311.510.0278Interferon-indusert protein 16, (Hin200), medfødt sensor for DNA, induserer senescence [43] IFI44; NM_0064172.890.0280Interferon-indusert protein 44, anti-proliferativ og antiviral aktivitet [42] IFIT2 /ISG54; NM_0015471.60.044Interferon-indusert protein med tetratricopeptide gjentar 2, induserer apoptose, antiviral aktivitet [60] CARD6; NM_0325871.580.058Caspase rekruttering domene familien, medlem 6, NF-ĸB aktivator, assosiert med karsinom [61] SAMD9; NM_0176541.60.066Sterile alpha motiv domene som inneholder 9; medfødt antiviral faktor, TNFa responsive [62] Cancer-forbundet: CALCOCO1; NM_0208981.670.0087Calcium bindende og coiled-spole domene 1, transkripsjonen coactivator med TCF /LSF og β-catenin [58] MEF2C; NM_0023971.640.0087Myocyte Enhancer faktor 2C, potensial onkogen i T-celle akutt lymfatisk leukemi [57] PEG10; NM_0150681.570.0278Paternally uttrykte 10, involvering i leverkreft [63] MACC1; NM_1827621.590.0352Metastasis forbundet i tykktarmskreft 1; assosiert med tykktarmskreft metastaser [59] Unknown: ARMCX6; NM_0190071.660.0435Armadillo gjenta inneholder, X-linked 6; unknownTable 2. ZNF395-induserte gener, identifisert av microarray, er involvert i det medfødte immunrespons og kreft progresjon.
RNA ble renset fra fire behandlet og ubehandlet celleprøver, henholdsvis revers transkribert og hybridisert til åtte uavhengige oligonukleotid arrays. Den gjennomsnittlige ganger endring og FDR q verdi for t-test er gitt. Gener som uttrykk ble indusert mer enn 1,5 ganger med en q 0,05 er oppført, inkludert deres tiltredelse nummer og kjente funksjoner. CSV Last ned CSV
Oppdagelsen av at seks av genene identifisert i microarray er kjent regulerte IFN gener innebar en rolle ZNF395 i IFN-α-mediert stimulering av disse målgener. For å analysere bidraget fra ZNF395 vi transient transfektert normale RTS3b celler med kontroll siRNA (siControl), som var rettet mot HPV8E6 onkogen som ikke er uttrykt i disse cellene, eller siRNA målrettet mot ZNF395 (siZNF395) og inkuberes cellene 40h senere med IFN-α i 6 timer. QRT-PCR avslørte at ekspresjonen av ZNF395 ikke ble forandret i siControl transfekterte cellene på grunn av IFN-α, noe som indikerer at ZNF395 ikke er regulert av dette signal. Den ZNF395-spesifikke siRNA redusert ZNF395 uttrykk mer enn 90% (figur 1C). IFN-α indusert ekspresjon av ISG56 190-fold i kontrollcellene. Ved transfeksjon av siRNA målretting ZNF395, IFN-α-formidlet aktivering først oppnås 43-fold. MRNA nivået for IFI44 ble øket 20 ganger av IFN-α, mens undertrykkelse av ZNF395 ga en 7,4 gangers induksjon ved IFN-α. Vi har også analysert ekspresjonen av IFI16, som bare var svakt indusert i mikromatrise er vist i tabell 2. IFI16 transkripter steg 5-fold som respons på IFN-a i siControl transfekterte celler og i celler hvor ZNF395 ble undertrykt, IFN-α aktivert 2.2 fold (figur 1C). Således mangel på ZNF395 sterkt nedsatt IFN-α-mediert induksjon av ISG56, IFI44 og IFI16 i epithelial RTS3b cellene. Vi bekreftet bidraget fra ZNF395 i IFN-α-avhengig stimulering av ISG56 og IFI44 uttrykk i astrocytom-cellelinje U87-MG. Vi valgte denne cellelinjen ettersom Murat et al. rapporterte at ZNF395 blir indusert ved hypoksi i U87-MG-celler [5]. Undertrykkelse av ZNF395 ved siRNA redusert basalnivå av transkripter for ISG56 og IFI44 med omtrent 40 og 50% henholdsvis i de ikke-stimulerte celler (figur 1D). Den ISG56 uttrykk ble indusert 15 ganger i kontrollcellene og 12 ganger i siZNF395-transfekterte celler ved IFN-α, mens IFI44 uttrykk ble bare økt to ganger på grunn av IFN-α, og 1,6 ganger når ZNF395 ble slått ned . IFI16 var knapt aktivert uavhengig om ZNF395 var til stede eller ikke. Således, de samlede effekter av IFN-α samt knockdown av ZNF395 var svakere i U87-MG forhold til RTS3b celler. Likevel, disse resultater viser at ZNF395 er nødvendig for den fullstendige IFN-α reaksjon for å indusere ekspresjon av IFI44, ISG56 og IFI16.
ZNF395 krever sin CR3 DNA-bindende region, og de to ISREs å stimulere ISG56 promoteren
for å undersøke hvilken rolle ZNF395 i induksjon av ISG56, analyserte vi rekombinant ZNF395 i transient transfeksjon analyser med en reporter konstruksjon innehold 654bp av oppstrøms kontroll regionen ISG56 som inkluderer arrangøren. Overekspresjon av ZNF395 indusert ISG56 promoter 4-fold, som er i området observert i mikromatrise (figur 2A). Vi identifiserte regioner i ZNF395 som kreves for aktivering av ISG56 promoteren. CR3 av ZNF395 er nødvendig for sekvens-spesifikk DNA-binding til en CG-rik element tilstede i HPV8 og i Huntingtons sykdom genpromoteren [22,23]. ZNF395mtCR3, med punktmutasjoner avskaffe DNA-binding til den HPV8 promotoren [23] mistet sin evne til å aktivere ISG56-Luc uttrykk. I tillegg ZNF395ΔCR1, mangler CR1 regionen, ikke klarte å aktivere. Nuclear-cytoplasma skyt av ZNF395 ble vist å kreve en kjernefysisk eksport signal (NES) ligger innenfor CR1 [22,23]. For å skille mellom rollen som NES og CR1, introduserte vi to punktmutasjoner å ødelegge NES. ZNF395mtNES aktivert ISG56 arrangøren opp til 10 ganger (figur 2A). Dermed er rester tilstede i CR1 engasjert i ZNF395-mediert aktivering av transkripsjon som ikke ble ytterligere adressert her. Jo høyere aktivering av ZNF395mtNES korrelerte med den eksklusive kjernefysiske lokalisering av ZNF395mtNES (upubliserte resultater) [22]. Ekspresjonen av de muterte proteinene har tidligere vært vist [23,25]. For å bekrefte disse aktiveringer, avslørte vi en påvirkning av endogen ZNF395 på arrangøren aktivitet oppnås med ISG56-Luc av forbigående co-trans siZNF395 eller siControl med ISG56 Luc reporter konstruere. Undertrykkelse av ZNF395 resulterte i en 20% reduksjon av aktivitet i Luc RTS3b og C33A celler, respektivt (figur 2B). Ectopically uttrykt ZNF395 var også i stand til å aktivere IFI44 arrangøren til stede i en reporter konstruere. Dette inkluderte 590bp oppstrøms for initiering området med to overlappende ISREs fra pos. -46 Til -64 som ble kartlagt tidligere for å mediere den induksjon ved IFN-α og IFN-β [37]. Igjen, ZNF395mtNES viste økt aktivering, selv om de totale effekter ble mindre i forhold til ISG56-Luc (figur 2C).
(A) RTS3b celler ble sådd ut i seks-brønns plater og transient transfektert med 500 ng av det ISG56- Luc reporter konstruksjon og økende mengder (5, 10, 20 ng) av ekspresjonsvektor for FLAG-ZNF395 eller de forskjellige mutanter per brønn, som angitt. Strukturen av ZNF395 med sine konserverte regioner CR1, CR2 og CR3 er avbildet under diagrammene inkludert sekvensen av de C-terminale 25 aminosyrer, som er konservert i den E-halen av TCF-1E og TCF-4E [52]. M på pos. 169 og 172 ble endret til A i mtNES mens i ΔCR1 aminosyrer fra 165-188 ble slettet. Aminosyrene som ble mutert i mtCR3 og som fører til tap av DNA-binding er angitt. (B) RTS3b og C33A celler ble først transfektert med siControl eller siZNF395 og 24 senere med ISG56-Luc reporter konstruere. Alle diagrammene representerer resultatene fra minst tre uavhengige eksperimenter. Standardavvikene er gitt. (C) RTS3b celler ble transient transfektert med luciferase reporter konstruksjon inneholdende IFI44-promoteren inkludert 560bp baser oppstrøms for initieringssete. Segmentet havner to overlapp ISREs, som har vist seg å megle IFN-avhengig induksjon av IFI44. Uttrykket vektor for ZNF395 og ZNF395mtNES ble co-transfektert som i A.
Vi så bestemt sekvens kravene ZNF395 i ISG56 promoter. Som vist i figur 3A, selv om det gir noe redusert aktivitet, fjerning av sekvensene inntil -117 ikke eliminere aktiveringen av ZNF395. Slettingen av segmentet fra -117 til -93 dramatisk redusert den basale aktiviteten av promoteren, og eliminerte enhver stimulering av overuttrykt ZNF395. Dette DNA-segment havner de IFN-stimulerte-responselementer (SBR) Jeg og ISREII at megle induksjon av ISG56 av IRF3 og IFN-α sensitive transkripsjonsfaktor ISGF3 [38]. To punktmutasjoner innenfor ISREs, som ble vist å eliminere respons til IRF3 [30] og til IFN-α (data ikke vist) opphevet aktivering av overekspresjon av ZNF395 (figur 3B) viser at ZNF395 virker gjennom enten den ene eller begge deler SBR elementer. Med to modifiserte konstruksjoner som inneholder enten to eksemplarer av ISREII (ISG56-2x ISREII) eller to kopier av ISREI (ISG56-2x ISREI), fikk ZNF395 halvparten av aktivisering i forhold til vekt arrangøren. Endringene var ikke signifikant påvirker IRF3-5D, et konstituerende aktiv mutant av IRF3 [31], i egenskap av å øke luciferase-aktivitet (figur 3C). Således sekvensen sammensetningen av ISREI og -II er tilstede i vekt- promoteren er optimal for ZNF395 å aktivere. For å teste om ZNF395 ligger ved endogene ISG56 promoter, ble en chip analysen med RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler utført. Mengden av fragmentet inneholdende de ISG56-spesifikke ISREs som var trukket ned ved FLAG-antistoff fra ekstraktene ble bestemt ved qPCR. Med ekstrakter fra celler dyrket i nærvær av Dox å indusere ekspresjon av FLAG-ZNF395, FLAGG antistoff utfelt 288% av input (+ Dox, figur 3D), som representerer en 2,3 ganger økning i forhold til IgG kontroll som utvinnes 127 % av input. For å bekrefte at ZNF395 kan direkte binde seg til ISREs, utførte vi gel skift. Hans-merket renset ZNF395 skiftet en radiomerket oligonukleotid som koder for de to ISREs av ISG56 promoter (SBR-vekt). Overraskende, oligonukleotid koder disse to ISREs med mutasjoner T-G i pos. 114 og 101 (SBR-mut) var like godt bundet og var i stand til å konkurrere om bindingen da lagt i overkant (figur 3E). Den direkte binding av ZNF395 ble bekreftet med atom ekstrakter fremstilt fra RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler enten dyrket med eller uten Dox og polyI: henholdsvis C, en etterligner av dsRNA,. En fremtredende Bandet var synlig med alle ekstrakter, uavhengig av polyI: C og Dox. Homologer ISG56-SBR-wt oligonukleotid, men ikke den muterte SBR-mut oligonukleotid var i stand til å konkurrere dette komplekset. Ved induksjon av ZNF395 uttrykk ved Dox, en ekstra svakt bånd migrere like over store komplekse dukket opp (Figur 3E, baner 9, 12). Dette komplekset forsvinner i nærvær av et overskudd av umerket SBR-vekt, så vel som SBR-mut oligonukleotid. Siden dette bandet bare ble påvist med ekstrakter av celler som overuttrykker rekombinant ZNF395 og oppførte seg som renset ZNF395 om sekvensen spesifisitet, kan det representere ZNF395 bundet til ISREs. Disse observasjonene antyder at ZNF395 ligger direkte på ISREs. Imidlertid kan sekvensen spesifisitet observert med de transiente transfeksjoner ikke stole på ZNF395 binding.
(A) sekvensiell delesjoner som starter fra 5 «enden av den ISG56 oppstrøms regulatoriske område ble innført i ISG56-Luc konstruere det som er anført i figuren. De tilsvarende luciferase reporter-konstruksjoner ble ko-transfektert med 5, 10 og 20 ng av FLAG-ZNF395 ekspresjonsvektor. Den relative luciferase-aktivitet av full lengde ISG56-Luc (= ISG56-654)-konstruksjonen ble satt som 1. Tallene ovenfor hvert sett representerer de bretteaktive indusert ved ZNF395 med den relative aktivitet av hver mutert reporter konstruksjon angitt som 1. (B ) konstruksjonen ISG56Δ117-93 inneholder en delesjon av de to ISREs innenfor rammen av full lengde ISG56-Luc konstruere som havner oppstrømsområdet opp til -654bp mens i ISG56-mtISRE i /II en T i hvert SBR er blitt forandret til G, som angitt under grafen. Alle rapportør konstruksjonene ble ko-transfektert igjen med 5, 10 eller 20 ng av ekspresjonsvektoren for FLAG-ZNF395. Sekvensen av de to ISREs stede i ISG56 arrangøren med punktmutasjoner som er innført er gitt. (C) Forbigående transfections med ISG56-Luc reporter konstruksjoner som ble endret til å inneholde enten to kopier av SBR-I (ISG56-2x SBR I) eller to kopier av SBR-II (ISG56-2x SBR II) og 5 ng uttrykksvektor for ZNF395 eller IRF3-5D hhv. (D) ChIP-analysen. RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler ble dyrket i fravær eller nærvær av Dox, tverrbundet og utsatt for en chip analysen med antistoff mot FLAG-tag og kontroll mus IgG. De utfelte DNA-segmenter ble amplifisert med en LightCycler ved anvendelse av primere som flankerer ISREs av ISG56 promoteren. Den ISG56-Luc reporter konstruksjonen ble inkludert som standard for å tillate en kvantifisering. Kopiantallet oppnådd for inngangs ble satt til en for hvert ekstrakt og falsen berikelse ble beregnet. De PCR ble utført i triplikat (* p = 0,05). (E) Gel skift analyse. Bakterielt uttrykte sin-merket renset & n-ZNF395 (mangler aminosyrene 1-114) ble inkubert med 200pg ISREI-Vekt (baner 1-4) eller SBR-mut oligonukleotid (baner 5-7), begge radioaktivt merket med
32P -γ-ATP, og bindingen ble analysert med en innfødt PAA-gel. I kolonnene 3 og 6, en 250-fold overkant av umerkede SBR-vekt og i baner 4 og 7, av SBR-mut oligonukleotid ble tilsatt som konkurrenter. I gel shift vises til høyre, atom ekstrakter fremstilt fra RTS3b-TR-FLAG-ZNF395 celler, enten inkubert i fravær eller nærvær av Dox og polyI: C, som angitt, ble inkubert med merket SBR-wt oligonukleotid og en 250 fold overkant av umerket SBR-wt eller SBR-mut oligonukleotid. Plasseringen av den antatte ZNF395-SBR komplekset er angitt med en pil.
IKK merkene ZNF395 for proteasomal degradering
Resultatene er beskrevet så langt viser at ZNF395 er nødvendig for full induksjon av ISG56, IFI44 og IFI16. Disse IFN-stimulerte faktorer er kjent for å være en del av en antiviral medfødte immunrespons. I tillegg kan ISG56 bli direkte aktivert av IRF3 ved TLR3 aliserte respons på dsRNA.
