Abstract
Bakgrunn
DNA metyltransferase (DNMT) er en av de viktigste faktorene som medierer metylering av kreftrelaterte gener som TGF-β reseptorer (TβRs). Dette i sin tur kan føre til et tap av følsomhet til fysiologiske nivåer av TGF-β i aggressiv prostatakreft (CAP). De spesifikke mekanismer DNMT rolle i Cap forbli ubestemt. I denne studien vil vi beskrive mekanismen av TGF-β-mediert DNMT i Cap og sin tilknytning til kliniske utfall etter radikal prostatektomi.
Metodikk /hovedfunnene
Vi brukte menneskelige cap cellelinjer med varierende grad av invasive evne til å beskrive hvordan TGF-β formidler ekspresjonen av DNMT i dekselet, og dens virkning på metylering status av TGF-β reseptorer og invasive evnen til Cap in vitro og in vivo. Videre bestemmes vi sammenhengen mellom DNMT uttrykk og klinisk utfall etter radikal prostatektomi. Vi fant at mer aggressive Cap celler hadde betydelig høyere TGF-beta nivåer, økt uttrykk av DNMT, men redusert TβRs sammenlignet med godartede prostataceller og mindre aggressive prostatakreftceller. Blokkering av TGF-β signalering eller ERK-aktivering (p-ERK) ble forbundet med en dramatisk reduksjon i ekspresjonen av DNMT, noe som resulterer i en sammenfallende økning i ekspresjon av TβRs. Blokade av enten TGF-β signalering eller DNMT dramatisk redusert de invasive egenskapene til Cap. Hemming av TGF-β i en TRAMP-C2 Cap modell i C57BL /6 mus bruker 1D11 var assosiert med nedregulering av DNMTs og p-ERK og svekkelse i tumorvekst. Til slutt, uavhengig av Gleason grad, ble økt DNMT1 uttrykk forbundet med biokjemisk tilbakefall etter kirurgisk behandling for prostatakreft.
Konklusjoner og Betydning
Våre funn viser at CAP avledet TGF-β kan indusere uttrykket av DNMTs i Cap som er forbundet med metylering av sine reseptorer og aggressive potensialet i Cap. I tillegg er DNMTs en uavhengig prediktor for tilbakefall av sykdommen etter prostatektomi, og kan ha kliniske konsekvenser for Cap prognostication og terapi
Citation. Zhang Q, Chen L, Helfand BT, Jang TL, Sharma V, Kozlowski J , et al. (2011) TGF-β Regulerer DNA metyltransferase Expression in Prostate Cancer, korrelerer med aggressive evner, og spår tilbakefall av sykdommen. PLoS ONE 6 (9): e25168. doi: 10,1371 /journal.pone.0025168
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 20 juni 2011; Godkjent: 26 august 2011; Publisert: 30.09.2011
Copyright: © 2011 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Grant Nummer to P50CA090386-06A2 fra National Cancer Institute, NIH, samt tilskudd fra National Cancer Institute (U01 CA152738), American Cancer Society, Illinois (# 08-22), Department of Defense (W81XWH -09-1-0311), Portes Center /Institute of Medicine i Chicago (QZ), American Cancer Society Institutional stipend (ACS-IRG 93-037-12), et stipend fra Genzyme Corporation, et stipend fra Northshore Universitetet Health , og en gave fra Mr. Fred L. Turner. Gjennom ansettelse av SL, JH og BT, Genzyme Corporation rolle inkludert: gi reagenser, med forslag til forsøksplanlegging og hjelpe til med utarbeidelsen av manuskriptet. De andre organer hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. SL, JH og BT er ansatte i Genzyme. Det finnes ingen patenter eller produkter i utvikling for å fortolle. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
TGF-β er en pleiotropisk vekstfaktor som har vært innblandet i flere, og ofte diametralt motstående funksjoner, herunder celleproliferasjon, cellevekstarrest, differensiering og apoptose [1], [2]. Et nærliggende spørsmål reist av disse ulike funksjonene er hvordan TGF-β formidler disse tilsynelatende motstridende roller i både kreft og godartede celler. I kreftceller, TGF-B fungerer som en vekst promoter og hjelpemidler i metastaser, mens det i det normale celler ser ut til å hemme cellevekst og induserer apoptose [3]. Karakteristika for aggressiv prostatakreft (CAP) omfatter et gradvis tap av følsomhet til TGF-β og over-ekspresjon av TGF-β, som synes å sette i gang en ond sirkel for tumorprogresjon. Selv om det er godt kjent at en reduksjon eller tap av ekspresjon av TGF-β reseptorer (TβRs) gjør det mulig for kreftceller å unnslippe den veksthemmende virkning av TGF-β og for å oppnå en vekstfordel, den cellulære mekanisme (r) bak disse hendelsene i menneskelige Cap celler forblir udefinert. Tidligere har vi vist at tapet av TβRs ekspresjon av promoter metylering er forbundet med ufølsomhet overfor TGF-β-formidlet vekstinhibering [4].
DNA metylering utføres ved DNA metyltransferaser (DNMTs). Det er minst tre funksjonelle DNMTs som har blitt identifisert i eukaryote systemer. DNMT1 har vært implisert i første rekke i opprettholdelsen av metylering mønstre som oppstår i løpet av cellereplikasjon, og det fortrinnsvis methylates hemi-metylerte DNA [5]. Det har vært den mest omfattende studert vedlikehold metyltransferase og er rik på tumorceller og vev. Til sammenligning, ikke DNMT2 ikke ut til å ha sterk aktivitet metylering og DNMT3L er sannsynlig å være begrenset til DNA-metylering under kimlinje utvikling [5]. Til slutt, DNMT3A og DNMT3B er kjent for å være de novo methylators av CpG sider [6], som har høyere metyltransferase-aktivitet for unmethylated DNA enn DNMT1 og kan bidra til de novo-metylering under embryogenese [7], [8]. Selv om DNMT er rapportert å være forbundet med visse aggressive kreftformer som levercellekarsinom, magekreft, ikke-småcellet lungekreft, lymfom og prostatakreft [9], [10], [11], [12], [13], dens rolle fortsatt kontroversielt og den generelle regulering, koordinering og aktivitet av DNMTs er uklart med ulike kreftformer. Videre har mekanismen av DNMTs i kreftceller og sin tilknytning til invasive maligne evner og kliniske utfall etter behandling ikke beskrevet.
Vi har nylig rapportert at epigenetisk regulering av TGF-β-indusert uttrykk for foxp3 kan være mediert gjennom inaktivering av ekstracellulære signalregulerte kinaser (ERK), som kan ned-regulere DNMTs i godartede celler [14]. Som nevnt ovenfor, Cap celler og vev er ufølsomme for TGF-β-formidlet vekstinhibering og har promotor metylering mønster som reduserer ekspresjonen av TβRs (TβRI og TβRII) [4], [15], [16]. Tatt sammen indikerer disse resultatene at ufølsomhet overfor TGF-β i enkelte Cap-celler er i det minste delvis på grunn av promoteren metylering av TβRs. Disse funnene har ført oss til å utforske de følgende to hypoteser i denne studien: 1) Det kan være crosstalk mellom svulst avledet TGF-β og DNMTs som er relatert til metylering i kreft; 2) DNMTs kan være nært forbundet med prostata kreft progresjon og resultater etter radikal prostatektomi. Så vidt vi vet, dette emnet er ennå ikke rapportert.
Formålet med vår studie var flere ganger. Først forsøkte vi å undersøke tilsvarende endringer i DNMT og TβRs uttrykk og ERK-aktivering etter behandling Cap celler med varierende grad av invasiv evne og godartede prostata epitelceller med TGF-β. Deretter undersøkte vi effekten av et nøytraliserende TGF-β antistoff på ekspresjon av DNMTs og tumorvekst in vivo ved hjelp av en xenograft modell. Til slutt fant vi ut om aktivering av DNMTs var assosiert med biokjemisk tilbakefall etter radikal prostatektomi.
Materialer og metoder
(En detaljert forklaring er presentert i Method S1)
Cellelinjer
muse~~POS=TRUNC Cap cellelinje TRAMP-C2-celler ble hentet fra Dr. N. Greenberg [12]. Godartet prostata human epitelcellelinje, RWPE-1, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). BPH-1 celler ble vennlig levert av Dr. Simon Hayward. Fire varianter av det humane Cap PC-3 cellelinjer (PC-3, PC-3M-Pro4, PC-3M og PC-3M-LN4) med varierende grad av invasive evner ble vennligst tilveiebrakt av Dr. Fidler og Dr. Pettaway [ ,,,0],17], [18], [19], [20]. Grunnen til at vi valgte PC-3 varianter var fordi disse variantene stammer fra den samme cellelinje, men varierer i sine aggressive evner. Resultatene av signale regulering var mer sammenlignbare i motsetning til ved hjelp av ulike typer Cap cellelinjer. For noen eksperimenter ble celler gjøres ufølsom overfor TGF-β (som en negativ kontroll) ved å innføre en TβRIIDN som tidligere beskrevet [21], [22]. I noen eksperimenter ble celler behandlet med eller uten TGF-β1 eller MEK-inhibitor U0126 (Promega). Endelig noen eksperimenter involverte bruk av anti-TGF-β (1, -2, -3) nøytraliserende mAb (klon 1D11, en gave fra Genzyme Corporation) som tidligere beskrevet [23], [24]. (Metode S1).
TGF-β1 ELISA
RWPE-en, BPH-en og alle PC3 varianter og tilsvarende TβRIIDN infisert cellelinjer ble dyrket i frisk serum-frie medier i 24 timer . TGF-β1 ELISA ble utført ved hjelp av Human TGF-β1 Immunoassay Kit (R Amersham Biosciences) i ytterligere 5 timer. Tymidininkorporering ble uttrykt som fraksjonen av tellinger som finnes i celler av ubehandlede kontroller (metode S1).
Western blot-analyse
Western blot analyser ble utført for å sammenligne TβRs, DNMTs og ERK uttrykk etter forskjellig behandlinger over tid (metode S1).
metylering Spesifikke PCR (MSP) og sekvense
MSP for metylering status for TβRs ble utført i henhold til vår forrige rapport [4]. De denaturert steder i cytosin stillinger med /uten behandling av 5-Aza eller TGF-β ble identifisert.
immunfluorescens og Co-farging
immunfluorescens studiene ble utført på alle PC-3 cellelinje derivater som tidligere beskrevet [22], [25]. For samlokalisering av DNMTs og fosforylert ERK (p-ERK) ble cellene analysert ved hjelp av kjernen (DAPI) -DNMTs (TR) -p-ERK (FITC) triple flekker (metode S1).
Kvantitativ RT-PCR
Menneskelige benign prostata epitelceller RWPE-en og BPH-en, og Cap PC-3 serier) ble dyrket i frisk media i 24 timer, deretter eksponert i 24 timer til enten: 1) ekstern rekombinant TGF-β1 (10 ng /ml), 2) anti-TGF-β nøytraliserende monoklonalt Ab (1D11, 5 ug /ml), eller 3) MEK-inhibitor U0126 (5 uM). Total RNA ble ekstrahert ved bruk av en RNeasy-sett (Qiagen). Primere for mennesker for DNMTs [26] og TβRs [4] ble oppført i metode S1.
Cell invasjon analysen
Cell invasjon analysen (Matrigel invasjonen assay) ble gjort i en 24-brønns Transwell kammeret (8 um porestørrelse; CytoSelect, Cell Biolabs). Celler ble sådd ut i en tetthet på 0,5 x 10
6 til 1,0 x 10
6 /ml i serumfritt medium. TGF-β1 og /eller Erk inhibitor UO126, 5-Aza ble tilsatt direkte til cellesuspensjonen, og 24 timer senere ble suspensjonen ble aspirert og invaderte celler ble tellet med et lysmikroskop under høyt forstørrelse objektiv (x 100; Olympus) og målt ved A560 nm i en plateleser etter behandling med utvinning løsning.
Animal Studies
undersøkelsen ble igangsatt ved hjelp av subkutan (sc) injeksjon av mus prostatakreft TRAMP-C2 celler transfektert med hSV1-tK-GFP-luciferase (SFG-nTGL) reporter gene expression vector [27], [28] inn i den høyre flanken mellom 30 C57BL /6-mus som tidligere beskrevet [25]. Dyr ble randomisert til en av tre grupper etter intraperitoneal injeksjon med det spesifikke anti-TGF-β nøytraliserende antistoff 1D11 eller kontroll antistoff 13C4 som beskrevet tidligere [23], [24]. Alle musene ble avlivet etter 15 injeksjon av antistoffer og gruppe 3 ble avlivet på den samme tidsintervall. (Metode S1). Denne studien fått godkjenning fra Institutional Review Board of Northwestern University (Evanston, IL). Northwestern University ACUC Godkjenning protokollnummer 2007-0565. »(Brev S1).
Bygging av microarray (TMA) og klinisk utfall Assement
Den eksisterende kliniske saksopplysninger og banked vev etablert i vår prostata SPORE program database ved Northwestern University ble brukt. Alle deltakere inkludert gitt skriftlig informert samtykke ved Northwestern Memorial Hospital og studien ble godkjent av Northwestern University Institutional Review Board (IRB-tallet er 1480-002, Letter S2). Totalt 243 radikal prostatektomi prøver var tilgjengelig med tilhørende klinisk informasjon. En serie av prostata TMA ble konstruert med formalinfikserte, parafininnstøpte radikal prostatektomi prøvene som beskrevet tidligere [4], (Metode S1 og S2 Method).
Immunhistokjemi
Alle antistoffer dannet mot DNMTs, fosforylert ERK (p-ERK), total ERK (t-ERK), fosforylert Smad2, TβRI og TβRII ble først testet og optimalisert på hel-vevssnitt og test matriser som tidligere beskrevet [4], [17], [29 ], [30], (Metode S1 og S2 Method).
Statistisk analyse.
SPSS 10.0.7 programvarepakke (SPSS Inc.) ble benyttet for alle analyser. Kaplan-Meier overlevelseskurve ble analysert av log-rank test bruker Graphpad Prism 4,02 programvare (Graphpad programvare) (metode S1).
Resultater
1. DNMTs ekspresjon er assosiert med nedregulering av TβRs og mer invasive prostata cancer fenotyper
En ELISA-analyse ble først utført for å bestemme om det var forskjeller i de endogene ekspresjonsnivåer av TGF-β i forskjellige Cap cellelinjer sammenlignet godartet prostata cellelinjer. Vi fant at alle PC-3 cellelinjer uttrykte betydelig høyere nivåer av TGF-β (x 2 til 6 ganger) sammenlignet med BPH-1 og RWPE-1 (p 0,05). Videre fant vi at mer invasive celler (PC-3M og PC-3M-LN4) utskilles nesten 2 ganger høyere baseline nivå av TGF-β1 sammenlignet med de mindre invasive cellelinjer (PC-3 og PC-3M-PRO4) ( fig. 1A).
A. ELISA-analyse som viser at PC-3 cellelinjer uttrykker signifikant (p 0,05) høyere (x 2-6 ganger) nivåer av TGF-β sammenlignet med godartede prostata cellelinjer, BPH-1 og RWPE-1. Videre PC-3M og PC-3M-LN4, utskilte nesten to ganger høyere utgangsnivået av TGF-β1 i forhold til PC-3 og PC-3M-PRO4-celler, henholdsvis, som er mindre invasiv. B. En tymidin-inkorpore-ringsanalyse indikerer at veksten av RWPE-1 og BPH-1-celler inhiberes betydelig ved eksponering for TGF-β1. Til sammenligning, er veksten av PC-3 og PC-3M-PRO4 celler bare svakt hemmet, og PC-3M-LN4 og PC-3M-celler viser ingen signifikant respons på TGF-β1 eksponering. C. I alle kreftcellelinjer (her vi vise PC-3 som et eksempel), hemming av TGF-β ved hjelp av TβRIIDN konstruere resulterer i betydelig høyere naive TβRII uttrykk, og D. høyere TGF-β sekresjon. Lignende funn er funnet i funnene i de mer invasive cellelinjer. Til sammenligning var det ingen forskjell i uttrykket av TβRII i BPH-en eller RWPE-en når de ble smittet med TßRIIDN (tabell S1).
Vi har bekreftet at ulike prostata cellelinjer oppfører seg annerledes i respons på eksogen TGF-β1 eksponering. For eksempel har vi funnet at RWPE-1 og BPH-1-celler var mest følsomme overfor eksogen TGF-β1 som deres vekst ble inhibert med 64,1% og 61,9%, henholdsvis, etter 24 timers behandling med TGF-β1. Til sammenligning, PC-3 og PC-3M-PRO4 celler ble kun inhibert med 13,7% og 12,3%, respektivt. Endelig veksten av PC-3M-LN4 og PC-3M var upåvirket av TGF-β1 eksponering (Fig. 1B). Interessant, i Cap cellelinjer, hemming av TGF-β signalering, ved hjelp av dominant negativ type II TGF-β reseptor (TßRIIDN) konstruere, var assosiert med signifikant høyere endogen TβRII uttrykket (ved bruk av antistoffer rettet mot det intracellulære domenet, fordi TβRIIDN omfatter bare ekstracellulære og transmembrane domener, men ikke intracellulært domene) (fig. 1C) og høyere TGF-β sekresjon (fig. 1D). Til sammenligning var det ingen forskjell i ekspresjonen av TGF-β i BPH-1 eller RWPE-1 når de ble infisert med retrovirale TβRIIDN konstruere (tabell S1).
I motsetning til ekspresjonen av TGF- β, både TβRI og TβRII uttrykk ble betydelig redusert i de mer invasive cellelinjer, PC-3M-LN04 og PC-3M, sammenlignet med PC-3 og PC-3M-PRO4 celler (fig. 2A). Blokade av TGF-β signale med TβRIIDN vektor forårsaket en ca 2-10 ganger økning i uttrykket av både TβRI og TβRII i alle Cap cellelinjer (Fig. 2B). Tatt sammen betyr dette at forhøyede nivåer av TGF-β er forbundet med inhibering av TβRs uttrykk. Blokade av intracellulær TGF-β signalering resulterte i opp-regulering av sekresjon av TGF-β i kreftceller.
A. Western blot-analyser viser at i motsetning til ekspresjonen av TGF-β, både TβRI og TβRII uttrykket (som beskrevet i figur 1 B) er betydelig redusert i de mer invasive cellelinjer sammenlignet med mindre invasive cellelinjer. B. Blokade av TGF-β signalering med den TβRIIDN forårsaker betydelig økning i ekspresjon TβRIs i alle cellelinjer. C. I motsetning til ekspresjonen av TβRs, den i forhold til ekspresjon av DNMTs er assosiert med mer invasive cellelinjer sammenlignet med de mindre invasive cellelinjer. D. Blokade av TGF-β signalering med TβRIIDN forårsaket en ≥3 gangers nedgang i ekspresjon av DNMTs. Den tilsvarende verdi (relative forholdet mellom TβRs /GAPDH eller DNMTs /GAPDH) vises i høyre diagrammer. (Fig. 2A og 2B var fra samme Western Blot bilde, og fig. 2C og 2D var fra den andre enkelt Western blot bilde).
Siden promoter metylering av TβRs er forbundet med redusert ekspresjon [ ,,,0],4], vi sammenlignet uttrykket nivåer av DNMTs i de ulike Cap cellelinjer. Generelt er de mer invasive PC-3M-LN4 og PC-3M-celler viste en økt ekspresjon av DNMTs, sammenlignet med den mindre invasiv PC-3 og PC-3M-Pro4 (Fig. 2C). Blokkering av TGF-β signalering med den TβRIIDN vektoren forårsaket en ≥3 gangers nedgang i ekspresjon av DNMTs i alle Cap cellelinjer (Fig. 2D), og det var en tilsvarende økning i ekspresjon av både TβRI og TβRII (fig. 2B). Den tilsvarende verdi (relative forholdet av TβRs /GAPDH eller DNMTs /GAPDH) er vist i høyre panel. Dette funnet ble også støttet av flere bekreftende studier. Immunoblotanalyse analyser viste at etter behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza), ekspresjon av TβRI og TβRII i PC-3 økt dramatisk. I motsetning til ekspresjonen av både TβRI og TβRII betydelig redusert med behandling av TGF-β og denne endringen kunne utvinnes ved 5-Aza tilsettes (figur S1A). Tilsvarende bekreftet real-time PCR at ekspresjon av både TβRI og TβRII ble øket fra 2 til 2,5 folder etter behandling av 5-Aza i PC-3-celler. Behandling med TGF-β undertrykkes de uttrykk for TβRI og TβRII 46% og 29%, respektivt (figur S1B). Vi identifiserte også metylering status for TβRI og TβRII arrangører, ved å bruke de samme MSP tilnærming og sekvensering metoder [4]. Ved hjelp av denne teknikken, fant vi de samme denaturert nettsteder som vår tidligere studie [4] i at cytosin posisjoner -251, -231, -244, -348, -356 og -365 i formidler av TβRI, og 27, 32 og -140 for arrangøren av TβRII ble metylert (figur S1C). PC-3 celler har også en del av TβRI og TβRII arrangører som er unmethylated. Interessant, behandling med TGF-β økte metylering status, men behandling med 5-Aza omdannet alle denaturert sider for å unmethylated. Den tymidin-inkorpore-ringsanalyse indikerte at spredning av PC-3-celler ble inhibert bare beskjedent beskjedent av eksogen TGF-β. Til sammenligning, 5-Aza behandlingen resulterte i signifikant inhibering av celleproliferasjon, uavhengig av om eksogen TGF-β ble tilsatt til kulturen eller ikke. Det var ingen signifikant forskjell observert mellom behandling med både 5-Aza og TGF-β eller med 5-Aza alene (P 0,05) (figur S1D)
2.. DNMTs uttrykk er formidlet gjennom et fosforylert-ERK avhengig veien
Våre tidligere studier viser at ERK kan påvirke DNMT uttrykk i godartede celler [14]. Vi forsøkte derfor å bestemme om nivået av aktivert ERK (fosforylert ERK, p-ERK) er relatert til TGF-β-indusert ekspresjon av DNMTs. For å teste denne hypotesen, må vi først bestemmes nivået av p-ERK i godartede prostataceller og sammenlignet det med nivåene i ulike Cap cellelinjer. BPH-en og RPWE-1 celler uttrykt betydelig høyere baseline nivåer av p-ERK enn PC-3 celler (fig. 3A). Interessant, tidsforløpet av p-ERK uttrykk etter eksponering for TGF-β var forskjellig i de godartede og ondartede cellelinjer. Nærmere bestemt var det en tidsavhengig positiv korrelasjon mellom behandling med TGF-β1 og ekspresjon av p-ERK i alle PC-3 cellelinjer. Faktisk er denne raske økningen i p-ERK uttrykk (4 ganger) begynte i løpet av 5 minutter etter TGF-β1 behandling. Nivåene av p-ERK fortsatte å øke i løpet av alle tidspunkter opptil 30 minutter etter TGF-β1 tillegg. I motsetning til dette ble ekspresjonen av p-ERK hurtig inhibert (mindre enn 5 minutter) etter TGF-β1 tilsetning til mediet av godartede celler, på en måte som var uavhengig av det totale ERK proteinekspresjon (fig 3A.). Immunofluorescence studier ble senere brukt for å fastslå om p-ERK og DNMTs ble samlokalisert med de samme cellulære regioner. For dette formål, fast konfokale mikroskopiske analyser av formaldehyd immunostained PC-3-celler, i fravær eller nærvær av TGF-β1, viste ko-loczalization mellom p-ERK og DNMTs signaler. Bare celler med p-ERK immunfluorescens utstilt DNMT uttrykk. I motsetning til dette, når PC-3-celler ble gjøres ufølsom overfor TGF-β1 ved transfeksjon med TβRIIDN, ble nivåene av både p-ERK og DNMTs reduseres dramatisk som bestemt ved immunofluorsence farging (fig. 3B). For bedre å kvantifisere dette forholdet mellom TGF-β1, p-ERK og DNMTs, neste brukte vi real time PCR. Resultatene viste at eksponering for TGF-β1 i 24 timer betydelig økt uttrykk av alle tre DNMTs (~16.7% -14%) i alle PC-tre cellelinjer undersøkt. Behandling med et antistoff som er spesifikt for TGF-β1 (1D11, 5 mg /ml) eller den spesifikke ERK-inhibitor, UO126, førte til en betydelig nedregulering av DNMTs mRNA ekspresjon (~33.9% -52,3%, og ~41.5% -57,6% henholdsvis fig. 3C). Disse resultatene tyder på at TGF-β mediert ekspresjon av DNMTs er assosiert med en økning i p-ERK i kreftceller. Nærmere bestemt vises tumor avledet TGF-β å være ansvarlig for denne ERK-aktivering, som blokade av den opprinnelige sekrert TGF-β resulterte i en stor endring i ekspresjonen av DNMTs (Fig. 3C). Disse resultatene antyder også at tumor avledet TGF-β mediert ERK-aktivering er i det minste en av de viktigste mediatorer for TGF-β induserte ekspresjon av DNMTs som fører til TβRs nedregulering av promoter metylering i Cap [4], [14]. Etter behandling med TGF-β, var det en signifikant økning i invasive egenskapene til Cap-celler. Invasjon av Cap-celler ble hemmet av enten TGF-β inhibitor 1D11, eller p-Erk inhibitor U0126 eller DNMT inhibor 5-Aza. Inhiberingen av invasjonen av den U0126 ikke kunne reverseres ved TGF-β1 behandling. Viktigere, DNMTs inhibitor 5-Aza kan dramatisk hemmet Cap celler invasjonen, enda mer enn blokade av TGF-β eller p-ERK (Fig. 3D). Denne observasjonen foreslo at p-ERK var nedstrøms faktor på TGF-β, og synergi formidler TGF-β regulert DNMTs som var nært knyttet til invasiv evnen til Cap celler.
A. De godartede BPH-1 og RPWE-1 celler uttrykker betydelig høyere baseline nivåer av p-ERK enn PC-3 celler. Det er en tidsavhengig positiv korrelasjon mellom behandling med TGF-β1 og ekspresjon av p-ERK i PC-3-celler. Nivåene av p-ERK fortsette å øke i løpet av alle tidspunkter opp til 30 minutter etter TGF-β1 tilsetning. I motsetning til dette er uttrykk for p-ERK hurtig (mindre enn 5 minutter) hemmet etter TGF-β1 eksponering i godartede-celler på en måte som er uavhengig av det totale ERK proteinekspresjonen. B. Immunofluorescensanalyse avslører at bare celler (dette er PC3 for eksempel) uttrykker p-ERK utstillings DNMT uttrykk. I motsetning til dette, når PC-3-celler blir gjøres ufølsom overfor TGF-SS1 ved TβRIIDN, nivåene av både p-ERK og DNMT er betydelig redusert (forstørrelse: 10 x 20). C. Vi utførte sanntid PCR for å bedre kvantifisere forholdet mellom TGF-β1, p-ERK og DNMTs. Eksponering for TGF-β1 betydelig økt ekspresjon av alle tre DNMTs i PC-3-celler. Behandling med 1D11, eller MEK-inhibitor, har UO126 assosiert med nedregulering av alle DNMT mRNA-ekspresjon. D. (Her viste vi mest aggressive PC-3M som et eksempel). Det var en signifikant økning i celle motilitet gjennom en Matrigel-belagt polykarbonat membran under behandling av TGF-β1 (10 ng /ml). Invasjonen av alle Cap-celler kunne inhiberes ved å blokkere TGF-β signal ved 1D11 eller ved hjelp av en p-ERK-inhibitor UO126, eller DNMT inhibitor 5-Aza separat. Hemming av invasjonen av UO126 kan ikke gjøres av TGF-β behandling. panel øverst til høyre: Tilsvarende antall invasive celler. panel Nederst til høyre: absorbans verdier. Dette resultatet indikerer p-ERK-mediert TGF-β-indusert DNMT potenserer invasiv evne prostatakreftcellelinjer. (Forstørrelse, 10 × 10).
3. In vivo validering av effektene av TGF-β på ERK-aktivering, DNMT uttrykk, og prostatakreft vekst
For å validere om TGF-β er ansvarlig for aktivering av ERK og oppregulering av DNMTs som kan være involvert i tumorprogresjon in vivo, gjennomførte vi eksperimenter med en mus xenograft cap modell som involverte injeksjon av Cap tumorceller (TRAMP-C2-celler som stabilt transfektert med en hSV1-tk-GFP-luciferase reporter, 5 × 10
6 /stk mus). Tumorvekst ble fulgt under anvendelse av luciferase-avbildning. Vi brukte tre grupper av mus for bedre å forstå virkningen av TGF-β for ERK-aktivering og DNMT uttrykk: Gruppe 1: mus (n = 10) mottok regelmessige injeksjoner av TGF-β nøytraliserende antistoff, 1D11. Gruppe 2: mus (n = 10) mottok isotypekontrollantistoff, 13C4, ved de samme jevne mellomrom som gruppe 1. Gruppe 3: mottok ingen behandling etter xenograft injeksjon som en kontroll. Vi fant at tumorveksten ble hemmet signifikant med anti-TGF-β 1D11 antistoff, behandling (gruppe 1) sammenlignet med de to andre gruppene (fig. 4A, 4B). Faktisk, ved slutten av den 45-dagers behandlingsperiode, en av de ti mus (10%) i denne gruppen var fri for tumor. I de resterende 9 mus, den gjennomsnittlige tumorvekt og volum var 5,3 g og 6,85 cm
3, henholdsvis. Til sammenligning ble tumorer funnet i alle musene i gruppene 2 og 3. Den gjennomsnittlige vekt og volum av tumorer i de 10 dyr som ble behandlet med kontrollantistoffet (gruppe 2) eller ingen behandling (gruppe 3) var signifikant høyere (Fig. 4C) . Det var ingen metastaser i alle gruppene som vurderes av bioluminesens imaging. Immunhistokjemiske analyser av de primære tumorer viste at ekspresjon av p-ERK og DNMTs i dyrene i gruppe 1 var signifikant lavere enn for de to andre gruppene (fig. 4D).
A. IVIS 100 bildesystem ble brukt til å overvåke tumorvekst i sanntid. Vi fant at tumorveksten hemmes drastisk med behandling av 1D11 sammenlignet med gruppe 2 (13C4 behandling) og 3 (ikke behandlet kontroll). B. 1D11 behandling inhiberer tumorvekst i en tidsavhengig måte. C, Ved slutten av den 45-dagers behandlingsperiode, ble musene avlivet og tumorene ble isolert. Den gjennomsnittlige tumor vekt og volum var 5,3 g og 6,85 cm
3, henholdsvis i 1D11 behandlingsgruppen. Til sammenligning er gjennomsnittlig vekt og volum av svulster i de 10 dyrene som ble behandlet med kontroll 13C4 var betydelig større på 15,8 g og 12.85 cm
3, henholdsvis. De tilsvarende verdier i mus som fikk ingen behandling var 31,4 g og 23,39 cm
3, henholdsvis (
P
0,01 blant tre grupper). D. Immunhistokjemisk analyse av de primære tumorer viste at ekspresjon av p-ERK, DNMTs i dyr med 1D11 behandling er betydelig lavere enn for de to andre gruppene.
4. DNMTs korrelerer med kliniske kjennetegn
For å vurdere sammenhengen mellom TGF-β og induksjon av DNMTs i Cap prøver, vi sammenlignet uttrykket nivåer av TGF-β1, ERK, p-ERK, TβRI, TβRII, p- Smad2, og DNMTs i arkiv vev microarray prøver innhentet ved radikal prostatektomi og korrelert dem med tilsvarende pasientenes kliniske og patologiske egenskaper (Tabell S2 Hver markør ble tildelt verdien 0 (. 20% celle farging), 1 ( 20-49% celle immunfarging), 2 (50-74% celle immunfarging) og 3 (75-100% celle immunfarging), avhengig av prosentandelen av kreftceller som viser positiv immunfarging. den positive og negative kontroll farging ble vist i «figur S2 «. Vi fant ut at et høyt nivå av uttrykk av TGF-β1, p-ERK og DNMTs kombinert med et lavt nivå av uttrykk for TβRI, TβRII, og p-Smad2 ble forbundet med negative patologiske funksjoner, for eksempel høyere Gleason sin klasse ( fig. 5A, fig. 5B, Tabell S3). Disse resultatene samsvarer med våre funn i PC-3M-LN4 og PC-3M celler som TGF-beta indusert DNMTs er assosiert med klinisk mer aggressive fenotyper.
En . Immunhistokjemisk analyse av serie TMA-seksjoner fra en pasient med Gleason score på 8, avslørte høyere ekspresjon av TGF-β, p-ERK, DNMTs, men lavere ekspresjon av TβRI og TβRII og p-Smad2 sammenlignet med seriesnitt tatt fra en pasient med en lavere Gleason største grad av 6. Disse resultatene er representative for den fremherskende fargemønster sett i alle pasientprøver /vev matriser (forstørrelse: 10 x 20). Den tilsvarende frekvens (eller prosent) av farging og intensiteten av fargingen ble funnet på BB Høye nivåer av TGF-β1 uttrykket (Score = 3) ble identifisert på 42,3%, 8,9% og 7,0%, p-Erk ekspresjon på 36,4%, 6,7% og 13,5%, DNMT1 uttrykk i 27,9%, 1,8% og 1,3%, DNMT3A uttrykk i 40,6%, 11,9% og 6,7%, og DNMT3B uttrykk i 58,7%, 18,3% og 22,8% av høy (≥8), middels
