Abstract
Bakgrunn
Bmi1 er en integrert del av den Polycomb Undertrykkende Complex 1 (PRC1) og er involvert i patogenesen av flere kreftformer. Det spiller også en viktig rolle i funksjon av endogene stamceller og kreftstamceller. Tidligere arbeid implisert en rolle for kreft stamceller i patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen. Vi antok at Bmi1 spiller en viktig rolle i å forbedre bukspyttkjertelen tumorigenicity og funksjonen av kreft stamceller i bukspyttkjertelen ductal adenokarsinom.
Metoder
Vi målte endogene Bmi1 nivåer i primære humane bukspyttkjertelen duktale adenokarsinomer, bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (PanINs) og normal bukspyttkjertelen ved immunhistokjemi og Western blotting. Funksjonen til Bmi1 i bukspyttkjertelkreft ble bedømt ved endring av Bmi1 ekspresjon i flere cellemodellsystemer ved å måle celleproliferasjon, celle apoptose in vitro invasjon, kjemoterapi motstand, og in vivo vekst og metastase i en ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen. Vi vurderte også kreftstamcelle frekvens, tumorsphere formasjon, og in vivo vekst av menneskelige kreft i bukspyttkjertelen xenografter etter Bmi1 lyddemping.
Resultater
Bmi1 ble overuttrykt i menneskelige PanINs, bukspyttkjertel kreft, og i flere bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Overekspresjon av Bmi1 i MiaPaCa2 celler resulterte i økt spredning, in vitro invasjon, større in vivo svulster, flere metastaser, og gemcitabin motstand mens motsatte resultater ble sett når Bmi1 ble stille i Panc-1 celler. Bmi1 ble overuttrykt i kreftstamcelle av primære humane kreft i bukspyttkjertelen xenografter. Bukspyttkjertelen tumorspheres viste også høye nivåer av Bmi1. Stanse av Bmi1 hemmet sekundær- og tertiær tumorsphere dannelse, redusert primære bukspyttkjertelen xenograft vekst, og senket andelen av kreft stamceller i xenograft vev.
Konklusjoner
Våre resultater impliserer Bmi1 i invasivitet og veksten av kreft i bukspyttkjertelen og demonstrere sin nøkkelrolle i reguleringen av kreft i bukspyttkjertelen stamceller
Citation. Proctor E, Waghray M, Lee CJ, Heidt DG, Yalamanchili M, Li C, et al. (2013) Bmi1 Forbedrer tumorigenitet og Cancer Stem Cell Funksjon i bukspyttkjertelen adenokarsinom. PLoS ONE 8 (2): e55820. doi: 10,1371 /journal.pone.0055820
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 31 august 2012; Godkjent: 02.01.2013; Publisert: 20 februar 2013
Copyright: © 2013 Proctor et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Funding var levert av National Institutes of Health R01 CA131045 og Rich Rogel Family Fund for kreft i bukspyttkjertelen Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA) er en svært aggressiv epitelial kreft med den verste prognosen av noen store malignitet med en rapportert fem års overlevelse på ca 5%. Det er den fjerde største årsaken til kreftdød per år i USA og åttende i verden med en forventet forekomst av 43,920 tilfeller i 2012 i USA alene [1]. Til tross for fremskritt i vår forståelse av denne sykdommen, de molekylære hendelser som ligger bak utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt i stor grad ukjent og kan holde nøkkelen til utvikling av mer effektive og nye terapeutiske strategier.
B-celle- spesifikk Moloney murine leukemi virus innstikkstedet 1 (Bmi1) er et medlem av Polycomb gruppe familie av proteiner som opprinnelig ble funnet å indusere murine lymfom formasjon ved samarbeid med c-myc [2], [3]. Det onkogene modulering av Bmi1 er ytterligere belyst i flere aspekter av celleproliferasjon og utvikling. Bmi1 har vist seg å spille en viktig rolle i cellesyklusregulering ved å virke som en transkripsjonen repressor av INK4a /ARF locus [4], [5]. Dysregulering av Bmi1 via stabil inaktivering av p16INK4a-pRb og p14ARF-MDM2-p53-trasé er implisert i onkogenesen av det hematopoetiske system [6], [7] og i utviklingen av småcellet karsinom i lungen [8]. Bmi1 har også kapasitet til å målrette andre aspekter av cellealdring, som overekspresjon av Bmi1 har vist seg å udødeliggjøre normale fibroblaster og mammary epitelceller gjennom reaktivering av human telomerase revers transkriptase-genet i disse celler [9]. I tillegg tyder robust bevis for at Bmi1 er kritisk for invasiv potensial og bidrar til tumorigene kapasitet i tykktarmskreft [10], medulloblastom [11], strupekreft [12], brystkreft [13], og prostatakreft [14]. Nyere studier også implisere Bmi1 som et viktig protein for vedlikehold og selvfornyelse av normale stamceller, inkludert hematopoetisk, neurale, myeloid og plateepitel stamceller [15], [16], [17], [18], så vel som kreft stamceller i flere tumortyper, [14], [19], [20], [21]. Bmi1 har blitt funnet å opprettholde kreft stilk cellefornyelse i glioblastoma multiforme, og for å bestemme den proliferative kapasiteten til leukemiske stamceller [22], [23]. Videre tap av Bmi1 har blitt observert for å hindre utviklingen av lungesvulster i et onkogen K-ras-initiert musemodell for lungekreft gjennom hemming av bronchiolalveolar stamceller [24].
Bmi1 har nylig blitt innblandet i flere aspekter av bukspyttkjertelen biologi. Regulering av INK4a locus av Bmi1 og MLL1 har vært innblandet i vedlikehold av bukspyttkjertelen β celleproliferasjon og kapasiteten ß celler til å komme seg etter bukspyttkjertelen holme skade [25]. Bmi1 uttrykke acinar og øyceller har blitt funnet i murine bukspyttkjertelen og Bmi1 spiller en sentral rolle i utvinning av acinar rommet etter cerulein-indusert pankreatitt og difteri toxin-mediert acinar celle ablasjon hos mus [26], [27]. Overekspresjon av Bmi1 har blitt bemerket i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen prøver i forhold til de normale bukspyttkjertelen [28], [29], [30]. Bmi1 ble oppregulert i pankreastumorer oppstår i Ela-TTA, Teto-Cre, KrasG12V genmodifisert mus modell av bukspyttkjertelkreft [28]. Lignende observasjoner ble gjort i løpet av cerulein-indusert pankreatitt [28]. Overekspresjon av Bmi1 har blitt korrelert med dårligere prognose i en liten kohort av bukspyttkjertelen kreftpasienter [29]. Selv om disse dataene potensielt implisere Bmi1 i bukspyttkjertelen tumorigenesis, har vi svært begrenset forståelse av de underliggende mekanismene for Bmi1 funksjon. I denne studien undersøker den funksjonelle betydningen av Bmi1 uttrykk i bukspyttkjertelen adenokarsinom hjelp primære humane xenograft modeller og bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Vårt arbeid viser at Bmi1 støtter menneskelig kreft i bukspyttkjertelen vekst ved å regulere cellesyklusprogresjon og vedlikehold av kreft i bukspyttkjertelen stamcelle.
Resultater
Bmi1 er sterkt uttrykt i Panin lesjoner, bukspyttkjertelen adenokarsinomer, og i velg bukspyttkjertelkreft cellelinjer
Vi først søkt å bestemme uttrykket av Bmi1 i prøver av humane primære bukspyttkjertel kreft og sammenlignet uttrykk nivåer i prøver av normal bukspyttkjertelen. Vevssnitt fra 10 forskjellige primære humane bukspyttkjertelen adenokarsinomer, 10 normal bukspyttkjertel prøver, og 16 preneoplastiske Panin lesjoner med varierende grad av epitelial dysplasi (Panin 1 til PanIN3) ble undersøkt for Bmi1 uttrykket etter immunhistokjemisk farging. Ved mikroskopisk vurdering, fant vi at Panin lesjoner og deler av menneskelig bukspyttkjertelen adenokarsinom viste markert oppregulering av uttrykk for Bmi1 i forhold til normale bukspyttkjertel vev (Figur 1a). Et betydelig antall Panin lesjoner (med moderat til alvorlig dysplasi) og adenokarsinom seksjoner farget for både cytoplasma og atom Bmi1 (pilene i figur 1A panel VI). Interessant nok Bmi1 farging ble hovedsakelig uttrykt i dysplastisk kjertelvevet av både Panins og adenokarsinom prøver, med mye mindre uttalt flekker detekteres i et delsett av celler i stromal-komponenten av de neoplastiske prøvene. Totalt ble Bmi1 uttrykt i 10/16 Panin lesjon seksjoner og 8/10 primære bukspyttkjertelen adenokarsinomer. RT-PCR (data ikke vist) og Western blot-analyse av normale og kreft vev (figur 1B) rekapitulert resultatene sett i vårt immunhistokjemisk analyse. Vi har også undersøkt fem bukspyttkjertelcancercellelinjer, MiaPaCa2, Panc-1, ASPC-1, BxPC-3 og Capan2 for ekspresjon av Bmi1 ved hjelp av Western blot-analyse (figur 1C). Høye nivåer av Bmi1 uttrykk ble registrert i BxPC3, Panc-1, ASPC-en, og Capan2 menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, mens uttrykk var lav i MiaPaCa2 bukspyttkjertelkreft cellelinje. Disse data indikerer at Bmi1 uttrykk er vanlig i neoplastisk vev og bukspyttkjertelen i bukspyttkjertelcancercellelinjer. De høye nivåer av ekspresjon Bmi1 sett i forstadier til kreft i bukspyttkjertelen (PanINs) tyder også på at ekspresjon av Bmi1 skjer på et tidlig stadium i bukspyttkjertelen onkogenese og potensielt kan spille en rolle i bukspyttkjertelkreft progresjon.
A. Immunhistokjemi for Bmi1 ekspresjon ble utført på bukspyttkjertel vevsprøver med varierende grad av dysplasi som strekker seg fra normal (n = 10) gjennom Panins (n = 16) til invasiv adenokarsinom i bukspyttkjertelen (n = 10). Som negative kontroller, vi utsatt vevsprøver til fargeprosedyre i fravær av spesifikk Bmi1 antistoff (1:100, cellesignalisering). Bildene ble tatt på 10x, 40x og 60x forstørrelse. Representative Bildene viser noen celler som uttrykker Bmi1in normal pankreas vev (i, ii, iii), høye nivåer av ekspresjon i Panins lesjoner (iv, v, vi), og signifikant overekspresjon i adenokarsinom (VII, VIII, IX). B. Western blot-analyse av Bmi1 ekspresjon i normale bukspyttkjertel lysater (n = 10) og lysatene bukspyttkjertelkreft vev (n = 10) fra forskjellige pasienter ble utført. Bmi1 er overuttrykt i tumorlysatene i forhold til normal bukspyttkjertelen vev kontroller. Beta-aktin ble benyttet som kontroll lasting. C. Endogen Bmi1 uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble bestemt ved Western blot analyse. β-actin fungert som en lasting kontroll.
Bmi1 påvirker bukspyttkjertelkreft celledeling in vitro
Gitt økt nivå av uttrykk for Bmi1 i bukspyttkjertelen epithelial neoplastisk vev og dets kjente cellesyklus regulerende rolle, ved siden spurte vi om det overekspresjon spiller en funksjonell rolle i kreft i bukspyttkjertelen celler. Vi valgte Panc-1 og MiPaCa2 cellelinjer for disse eksperimentene på grunn av deres differensielle nivåer av Bmi1 uttrykket (figur 1C). Vi overexpressed Bmi1 i MiaPaCa2 celler og brakt til taushet Bmi1 i Panc-1 celler med lentiviral konstruksjoner. Overekspresjon eller knockdown av Bmi1 i disse cellelinjene ble bekreftet ved Western blot-analyse (figur 2A). Transfeksjon av kontroll lentiviral-GFP vektor alene påvirket ikke Bmi1 ekspresjon i enten cellelinje (figur 2A). Økt uttrykk for Bmi1 i MiaPaCa2 celler betydelig økt celledeling i forhold til å kontrollere MiaPaCa2 celler (235 ± 11% vs. 333 ± 9% på 72 timer, p 0,0001, n = 6 eksperimenter, figur 2B). Stanse av Bmi1 uttrykk i Panc-en cellelinje hemmet celleproliferasjon i forhold til lentiviral kontroll shRNA infiserte celler, selv om våre resultater ikke statistisk signifikant (177 ± 12% vs. 141 ± 16% på dag 4, p = 0,11, n = 6 forsøk, figur 2B). Disse dataene viser at økte nivåer av uttrykk for Bmi1 i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer øker cellulær proliferasjon.
A. Bmi1 protein uttrykk ble analysert etter transfeksjon av MiaPaCa2 (øverst) og Panc-en (nederst) kreft i bukspyttkjertelen celler med lentiviral vektor (Bmi1) koding Bmi1 eller Bmi1 shRNA (Bmi1 shRNA) som beskrevet tidligere [40]. En lentiviral vektor som uttrykker GFP (GFP) eller kontroll shRNA ble anvendt som negativ kontroll. B.
In vitro
celleproliferasjon av MiaPaCa2 celler (til venstre) og Panc-1 celler (høyre) følgende modulering av Bmi1 uttrykk ble vurdert av MTS analysen (Promega, Madison, WI). Cell replikering ble registrert som beregnet prosent økning spredning avledet fra reagent opptak på tid (t) minus basal reagent opptak på dag 0. Bottom panelene viser de observerte endringene i spredning 72 timer etter plating. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05, ** p 0,0001, n = 6 uavhengige eksperimenter. C. Representative cellesyklus histogrammer følgende flowcytometrisk analyse av propidiumjodid (PI) farget Panc-1 celler viser reduksjon i andelen av celler inn S-fase på Bmi1 uttrykk hemming.
Endringer i Bmi1 uttrykk resultat i endrede progresjon gjennom cellesyklusen, men ingen endringer i frekvensen av apoptose
de observerte endringene i celleproliferasjon etter Bmi1 uttrykk endringer kan føre til endringer i cellesyklusprogresjon med eller uten en endring i frekvensen av apoptose . Vi brukte flowcytometrisk analyse med propidiumjodid for å undersøke fordelingen av Panc-1 og MiaPaCa2 cellelinjer med endrede nivåer av BMI-1 i de ulike faser av cellesyklusen for å løse dette punktet. I MiaPaCa2-celler, induksjon av Bmi1 ekspresjon viste en mild, men ikke-signifikant økning i prosentandelen av celler som kommer inn i S-fasen (44,7 ± 1,7% til 50,7% ± 2,3%, p = 0,63, n = 3 forsøk, ikke data vist ). Endringen av Bmi1 uttrykk førte til en mer uttalt effekt på PANC-1-celler, som tap av Bmi1 i disse cellene forårsaket en signifikant reduksjon i prosentandelen av aktivt delende S-faseceller fra 54,9 ± 2,5% til 42,0 ± 1,4% ( * p 0,05, n = 3 forsøk, figur 2C). Endring i ekspresjonen av Bmi1 ikke føre til vesentlige endringer i apoptose målt ved hjelp av sub-G0 /G1 fraksjon og TUNEL-farging i både MiaPaCa2 og Panc-1-cellelinjer (data ikke vist).
Bmi1 øker pankreatisk kreftcelle invasjon kapasitet
Bmi1 overekspresjon har tidligere vært forbundet med dårligere prognose og en mer invasiv fenotype i andre kreftformer. Vi spurte om Bmi1 uttrykk hatt en slik effekt på kreft i bukspyttkjertelen celler ved hjelp av Matrigel in vitro invasjon analysen. MiaPaCa2 celler med forhøyet Bmi1 uttrykk viste nesten to ganger høyere kapasitet (149 ± 26 vs 363 ± 30, * p 0,0003) for invasjonen i forhold til naturlig forekommende kontroll vektor celler (figur 3A, venstre). Stanse av Bmi1 i Panc-1 celler førte til en markert redusert kapasitet for cellene å gjennomgå invasjon (61 ± 12 vs 14 ± 4, p 0,004, figur 3A, høyre). Disse dataene tyder på at Bmi1 uttrykk ikke bare forbedrer spredning, men også invasiv kapasitet på kreft i bukspyttkjertelen celler. Siden Bmi1 uttrykk forbedret cellulær invasjon, testet vi evne til å modulere Bmi1 regulatorer av epitel mesenkymale overgang (EMT), en prosess som er assosiert med en invasiv fenotype. Vi fant økt Bmi1 uttrykk i MiaPaCa-2 celler gjorde i forhold til økt uttrykk av EMT markører vimentin og ZEB1, mens knockdown av Bmi1 i Panc-1 celler føre til nedregulering av disse markørene og Snail (figur 3B), viser en klar sammenheng mellom Bmi1 og uttrykk for EMT markører i kreft i bukspyttkjertelen celler.
A. Overekspresjon av Bmi1 i MiaPaCa2 celler forbedrer deres invasivitet i in vitro Matrigel invasjonen analysene (venstre panel). I motsetning til dette fører Bmi1 nedregulering i Panc-1 celler til redusert tumorcelle-invasjon (høyre panel). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P 0,0003, ** p 0,004, n = 6 uavhengige eksperimenter. B. Overuttrykte Bmi1 i MiaPaCa2 celler fører til oppregulering av EMT markører vimentin, og ZEB1, mens nedregulering av Bmi1 i Panc-1 celler fører til redusert uttrykk for EMT markører. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM sammenlignet med kontrollceller (* p 0,005). C. Cell overlevelse av GFP eller Bmi1 transfektert MiaPaCa2 celler (til venstre) etter behandling med gemcitabin i 48 timer. Data ble registrert som gangers forandring i løpet av kontroll ubehandlede gruppen og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p 0,05 vs kontroll). q-RT-PCR analyse av MRP5 uttrykk i GFP eller Bmi1 transfektert MiaPaCa2 celler (høyre) følgende gemcitabin behandling. Dataene er normalisert til GAPDH og uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p 0,05 vs kontroll).
Bmi1 forbedrer gemcitabin motstand
EMT fenotypen er blitt beskrevet for å bidra til ikke bare bukspyttkjertelkreft invasjon, men også behandling motstand i kreft i bukspyttkjertelen celler [31], [32]. Vi antok derfor at Bmi-en kan regulere motstanden mot kjemoterapeutika i kreft i bukspyttkjertelen celler. For å teste denne hypotese, ble MiaPaCa2 celler som uttrykker GFP alene eller Bmi1 ubehandlet eller behandlet med 100 uM gemcitabin i 48 timer og analyser ble utført for å vurdere celleoverlevelse. Kvantitativ RT-PCR ble utført for å måle endringer i uttrykket av ABC transporter genet MRP5. Medlemmer av MRP-familien er viktig ved formidling av medikamentresistens, og MRP5 har vist seg å være uttrykt ved betydelig høye nivåer i bukspyttkjertelkreft sammenlignet med kontroll pankreatiske vev, tyder det kan ha en rolle i medikamentresistens [33]. MiaPaCa2 celler med forhøyet ekspresjon av Bmi1 hadde økt motstand mot celledød som følge av gemcitabin og økt ekspresjon av medikament-resistens-genet MRP5 sammenlignet med kontrollceller. Disse dataene antyder Bmi1 deltar i terapeutisk motstand i bukspyttkjertelen kreftceller og at MRP5 kan bidra til dette fenotype.
Bmi1 forbedrer bukspyttkjertelkreft celle tumorigenicity in vivo
Siden våre in vitro studier antydet at Bmi1 spiller en regulerende rolle i kreft i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og invasjon, ønsket vi å ta den biologiske betydningen av disse resultatene i en in vivo orthotopic modell for kreft i bukspyttkjertelen. For å løse dette punkt, injiserte vi lentivirale transdusert cellelinjene inn i de pankreatiske haler av mottakerens NOD /SCID-mus og målte den resulterende tumorvekst og utvikling av metastaser ekstrapankreatiske i disse musene. Etter induksjon av Bmi1 uttrykk, MiaPaCa2 celler viste signifikant større
in vivo
tumorvekst. Bmi1 indusert MiaPaCa2 celler viste forbedret innpoding, med 100% (5/5) ortotopisk tumordannelse mens bare 3/5 mus injisert med villtype MiaPaCa2 celler viste pankreatisk tumor-innpoding (tabell 1). Dessuten ble en tendens til større tumorstørrelse sett i tumorer dannet av Bmi1 uttrykkende celler sammenlignet med kontroll MiaPaCa2 celler (0,27 ± 0,17 cm3 vs. 0,98 ± 0,41 cm3, p = NS, figur 4A). Alle mus injisert med enten kontroll Panc-1 celler (5/5) eller Bmi1 forstummet Panc-1 celler (5/5) viste tumordannelse i bukspyttkjertelen, men Bmi1 forstummet Panc-1 celler dannet svulster som var 2,5 ganger mindre i gjennomsnitt enn svulster som stammer fra kontroll Bmi1 uttrykker Panc-1 celler (1,21 ± 0,23 cm3 vs. 0,42 ± 0,09 cm
3, * p 0,05, 4A, nedre panel). I tillegg til større tumor størrelse, vises Bmi1 uttrykker celler forbedret metastatisk potensial
in vivo
. Obduksjon hos dyr 28 dager etter injeksjon av Bmi1 uttrykke MiaPaCa2 celler avslørt grov metastasering av tumor til ekstra-bukspyttkjertel nettsteder, inkludert bukhule, leveren og tarmen (3/5 dyr, 4B), mens ingen brutto metastatisk innskudd (0 /5) observert hos mus injisert med villtype MiaPaCa2 cellene ved 28 dager (tabell 1). Disse data underbygge våre in vitro observasjoner og støtte tanken om at Bmi1 koordinerer proliferative og invasive programmer i kreft i bukspyttkjertelen celler.
A. Representative bilder vist demonstrere relative tumorstørrelse forskjell på 28 dager etter orthotopic bukspyttkjertelen implantasjon av MiaPaCa2 (øverst) og Panc-1 celler (nederst) i NOD-SCID mus etter moduler Bmi1 uttrykk. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen for volumet av en ellipsoide struktur (4/3 * * π bredde /2 * lengde /2 * høyde /2). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p 0,05, n = 5 uavhengige forsøk). B. Bildet som vises er representative for forbedret metastatisk potensial i MiaPaCa2 celler etter indusert uttrykk for Bmi1. * Merkede nettsteder viser brutto metastasering av MiaPaCa2 tumor til ekstrapankreatiske steder i NOD-SCID-mus 28 dager etter orthotopic injeksjon av celler.
Bmi1 er sterkt uttrykt i bukspyttkjertelen kreft stamceller og kontrollerer deres selv -renewal
Vårt laboratorium har tidligere identifisert en befolkning på høyt tumorigent undergruppe av celler som viser egenskapene til selvfornyelse og differensiering i bukspyttkjertelkreft [34]. Vi antok at Bmi1 kan spille en funksjonell rolle i disse bukspyttkjertelen kreft stamceller (cscs) gitt sitt engasjement i andre stamcelle systemer. Vi snudde til lav passasje primære humane kreft i bukspyttkjertelen xenografter å ta opp dette spørsmålet. Anvendelse av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), vi isolert cscs gjennom kombinasjonen av CD44, CD24, og ESA (også kjent som EpCAM eller epithelial cell adhesion molecule) celleoverflate-ekspresjon [34]. Kvantitativ RT-PCR ble utført for å måle Bmi1 nivåer i cscs (celleoverflatemarkører CD44
+ CD24
+ ESA
+) og sammenlignet med de gjenværende bulktumorceller høstet fra de humane kreft i bukspyttkjertelen xenografter dyrket i NOD-SCID-mus. Normale bukspyttkjertelen ekstrakter fungert som en ekstra kontroll. Spesielt, bukspyttkjertelen cscs har en betydelig høyere uttrykk for Bmi1 mRNA (ca. 9 ganger, * p 0,05) i forhold til normale celler og merke negativ bulk tumorceller (inntil 3 ganger, p 0,05, figur 5A)
A. CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ celler ble isolert ved hjelp av flowcytometri fra kreft i bukspyttkjertelen vev som beskrevet tidligere [34]. Total RNA ble isolert og mRNA ble kvantifisert ved q- RT-PCR i normale bukspyttkjertelen, bulk CD44
– /CD24
– /ESA- kreft i bukspyttkjertelen celler og CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ kreft i bukspyttkjertelen celler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p 0,05, n = 3 uavhengige forsøk, hvert utført in triplo). B. Immunofluorescent farging av Bmi1 i tumorspheres dannet fra CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ celler. C. Dempe Bmi1 hemmer evnen til CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ celler til å danne kuler med serieaging. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p 0,05, n = 3 uavhengige eksperimenter som hver ble utført i triplikat)
Sorter cscs ble også testet
in vitro
i tumorsphere. analyser for å fastslå om Bmi1 deltar i CSC fornyelse på serieaging. Uttrykk av Bmi1 i tumorspheres ble vurdert gjennom immunfluorescens mikroskopi (figur 5B). Høye nivåer av Bmi1 uttrykk ble sett i tumorspheres beriket for kreft stamceller som tilsvarte den observerte heving i Bmi1 mRNA uttrykk nivåer på RT-PCR. Vi deretter omformet de tumorspheres med Bmi1 shRNA holdig eller kontroll lentivirus og serielt passert kulene. Først passasje sfære formasjonen var ikke signifikant forskjellig mellom Bmi1 forstummet cscs og lentiviral smittet kontroller (34 ± 6 enheter /HPF vs. 30 ± 6 enheter /HPF, p = NS, figur 5C). Men ved etterfølgende aging, Bmi1 forstummet celler vises minkende evne til å danne nye tumorspheres. Ved passering tre, Bmi1 stilnet celler viste en omtrent syv gangers nedgang i deres evne til å danne nye tumorspheres sammenlignet med villtype-kontroller (34 ± 7 enheter /HPF vs. 6 ± 1 enheter /HPF, s 0,05, figur 5C) . Disse eksperimentene implisere Bmi1 i reguleringen av bukspyttkjertel CSC fornyelse.
Bmi1 stanse i cscs resulterer i mindre svulster og redusert cscs selvfornyelse in vivo
For å teste in vivo relevans tumorsphere eksperimenter implantert vi like mange Bmi1 forstummet og kontroll lentiviral transfektert CD44
+ CD24
+ ESA
+ cscs avledet fra primære humane kreft i bukspyttkjertelen xenografter i subcutaneum av NOD /SCID-mus og målte den resulterende tumorvekst. Bmi1 dempede tumorer var betydelig mindre sammenlignet med kontroll svulster når de blir analysert 30 dager etter implantasjon (0,4 ± 0,2 cm
3 vs. 1,3 ± 0,2 cm
3, * p 0,05, figur 6A). Når tumorene ble analysert for deres CSC innhold via flowcytometri, Bmi1 dempede tumorer viste en signifikant reduksjon i CD44
+ CD24
+ ESA
+ CSC befolkning i forhold til sine kontroll motstykker (0.20 ± 0.04% vs. 1,2 ± 0,1%, * p = 0,0007, figur 6B). Denne in vivo data, sammen med in vitro tumorsphere resultater, støtter rollen Bmi1 i vedlikehold av bukspyttkjertelen CSC rommet ved å regulere sin selvfornyelse.
A. Stanse av Bmi1 hemmer tumor spredning. Representant bilde (øverst) av tumorxenotransplantater vist. Venstre – kontroll svulst, rett – Bmi1 forstummet svulst. Bar Grafen viser tumorvolumet forskjell på 28 dager. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p 0,05, n = 4 uavhengige eksperimenter). B. stanse av Bmi1 direkte påvirker CSC nummer i tumorxenotransplantater. Representant flowcytometri plott (øverst) av CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ celle tall i kontroll (til venstre) og Bmi1 forstummet (til høyre) xenografter på 28 dager. Søylediagram (nederst) kvantifiserer CSC tall i xenografter på 28 dager etter stanse av Bmi1. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (* p = 0,0007, n = 4 uavhengige forsøk).
Diskusjoner
Denne studien gir et klart bevis for integrert involvering av Bmi1 i patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen. Overekspresjon av Bmi1 ble konsekvent observert i kreft i bukspyttkjertelen vev sammenlignet med normale kontroller. De fleste menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble også observert å ha høy endogen uttrykk for Bmi1. Viktigere, ble Bmi1 overekspresjon observert i et flertall (10/16) av de preneoplastiske Panin lesjoner med moderat til alvorlig grad av epitelial dysplasi. Disse dataene antyder at Bmi1 uttrykk oppstår på et relativt tidlig stadium i bukspyttkjertelen kreftutvikling og bekrefter tidligere utgitt observasjoner i humane og murine bukspyttkjertelkreft modeller [28], [29], [30]. Til tross for disse resultatene, en funksjonell rolle for Bmi1 har ikke tidligere blitt belyst i menneskelig eller murine bukspyttkjertelkreft.
Vi funksjonelt validert betydningen av Bmi1 uttrykk i bukspyttkjertelkreft ved hjelp av bukspyttkjertelkreft cellelinjer og primære humane tumorxenotransplantater. Bmi1 overekspresjon i MiaPaCa2 bukspyttkjertelen kreftceller ført til økt spredning og økt invasjon i in vitro Matrigel analyser. Motsatt Bmi1 knockdown i Panc-1 celler hemmet deres spredning. Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved implantering i NOD-SCID-mus, hvor Bmi1 overekspresjon i MiaPaCa2 celler resulterte i økt tumorstørrelse og metastatisk evne av cellene. I motsetning til dette, selv om Panc-1 celler hadde tilsvarende innpoding uavhengig av Bmi1 status, tumorene som følge av Panc-1 celler som mangler Bmi1 var betydelig mindre enn de fra kontroll Panc-1 celler. Økt Bmi1 ekspresjon har blitt assosiert med øket aggresjon i andre krefttyper [6], [10], [35], [36] og korrelerer med tumorinvasjon og metastase i brystkreft [10], [13]. Våre funn i menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og primære humane xenografter ytterligere utvide disse observasjonene og implisere Bmi1 i indusere EMT og narkotika motstand dermed regulerer kreft i bukspyttkjertelen vekst og aggressivitet.
Tumor initiere eller kreft stamceller har vært isolert i menneskelig bukspyttkjertelkreft [34]. Som i normale stamceller, er Bmi1 antatt å være en viktig del av maskineriet som holder selvfornyelse i cscs. Dette ble vist å være tilfelle i det hematopoetiske system, så vel som bryst, hjerne, prostata og [14], [17], [19], [20]. I vår studie, da Bmi1 uttrykk ble stille i CD44
+ CD24
+ ESA
+ bukspyttkjertelen CSC befolkningen, både
in vitro
CSC forplantning og
in vivo
tumorvekst ble betydelig hemmet. Videre ble en markert nedgang i antall cscs bemerket når Bmi1 dempede tumorer ble analysert for deres innhold CSC. Disse data for den første gang eksperimentelt impliserer Bmi1 som en viktig regulator av pankreatisk CSC vedlikehold og bukspyttkjerteltumorstart. Videre studier er i gang av den rollen Bmi1 i de komplekse regulatoriske transkripsjons programmene som styrer fornyelse og vedlikehold av stamcelle staten. Bmi1 har vært implisert i stammen cellefornyelse og proliferasjon i mange normale så vel som cancervev inkludert hematopoetiske system, nervesystemet, bryst, prostata, lunge, tarm, og den normale bukspyttkjertelen. En kritisk observasjon, når man gjennomgår fleste av disse studiene, er at Bmi1 funksjon har i hovedsak vært innblandet i disse organsystemer ved hjelp av genmanipulerte musemodeller. Det er et sparsomt med data som undersøker Bmi1 funksjon i menneskelig vev direkte. Vår studie impliserer Bmi1 som en direkte regulator av bukspyttkjertelen tumorigenesis å bruke primære humane pasient avledet lav-passasje xenograft og bukspyttkjertelen cellelinjer. Det utfyller funnene i de andre studiene og videre sement rollen Bmi1 som en viktig regulator av kreft stamcelle fornyelse, som direkte påvirker startfasen og vekst in vivo. Det er den første studien som implisere Bmi1 direkte i bukspyttkjertelen tumorigenesis. Det er vanskelig å ekstrapolere hvordan Bmi1 ekspresjon i bukspyttkjertelkreft stamceller vedrører normal pankreas homeostase som den eneste papir adressering Bmi1 funksjon, og ikke bare ekspresjon i voksen bukspyttkjertelen fokuserer på en murin modell og ikke human pancreas [27]. Det er bemerkelsesverdig at i det papir Bmi1 ble ikke uttrykt i celler som uttrykker de vanlige benyttede bukspyttkjertelen progenitor markører så som PDX-1, nestin, og Sox9, men i stedet var tilstede i det som viste seg å være fullt differensierte akinærceller. Derfor er det vanskelig å spekulere på seg rollen Bmi1 i normal bukspyttkjertel homeostase i mennesker, men vårt arbeid klart impliserer Bmi1 i menneskelig bukspyttkjertelen tumorigenesis.
De underliggende molekylære mekanismene for Bmi1 funksjon i kreft er ikke helt forstått. Bmi1 regulerer cellesyklusprogresjon i det minste delvis av den transkripsjonelle regulering av Ink4a locus, som inneholder p16INK4a og p14Arf (p16 og p19 i mus) cyklin-avhengige kinase-inhibitorer [4], [5]. Den Ink4a locus forstyrres i mange bukspyttkjertel kreft og mutasjoner i eller stanse av p16 /p14 uttrykk er innblandet som en viktig hendelse i bukspyttkjertelkreft progresjon [37]. Nyere studier har vist at avvikende Bmi1 uttrykk trenger ikke nødvendigvis å være assosiert med nedregulering av ekspresjon p16INK4a [38], [39], [40]. Hver prøve ble analysert i triplikat.
