Abstract
småcellet lungekreft (SCLC) er en spesifikk subtype av lungekreft presentere som svært metastatisk sykdom med ekstremt dårlig prognose. Til tross for å svare utgangspunktet godt til kjemoterapi eller strålebehandling, SCLC nesten alltid tilbakefall og utvikler resistens mot kjemoterapi. Dette er mistenkt for å være relatert til tumorcelle subpopulasjoner med forskjellige egenskaper som ligner stamceller. Epitel-Mesenchymale Transition (EMT) er kjent for å spille en nøkkelrolle i metastatiske prosesser og i å utvikle resistens. Dette gjelder også for NSCLC, men det er svært lite informasjon om EMT prosesser i SCLC så langt. SCLC, i motsetning til NSCLC-cellelinjer, vokser hovedsakelig i flytende cellegrupper og en mindre del som adherente celler. Vi har sammenlignet disse morfologisk forskjellige subpopulasjoner av SCLC cellelinjer for EMT og epigenetiske funksjoner, oppdage signifikante forskjeller i heft subpopulasjoner med høye nivåer av mesenchymale markører som vimentin og Fibronectin og svært lave nivåer av epiteliale markører som E-cadherin og Zona okkludens en. i tillegg uttrykk for EMT-relaterte transkripsjonsfaktorer som sneglen /Snai1, Slug /Snai2, og Zeb1, DNA metylering mønstre av EMT kjennetegn gener, funksjonelle responser som migrasjon, invasjon, matrix metalloproteaser sekresjon, og motstand mot kjemoterapeutisk behandling alle signifikant forskjellig mellom underlinjer. Dette fenotypiske variasjonen kan reflektere svulst celle heterogenitet og EMT under metastaser
in vivo
, ledsaget av utviklingen av refraktær sykdom i tilbakefall. Vi foreslår at epigenetisk regulering spiller en nøkkelrolle i fenotypiske og funksjonelle endringer i kreftceller og kan derfor gi nye behandlingstilbud for SCLC pasienter
Citation. Krohn A, Ahrens T, Yalcin A, Plönes T, Wehrle J , Taromi S, et al. (2014) Tumor Cell heterogenitet i småcellet lungekreft (SCLC): fenotypiske og funksjonelle forskjeller tilknyttet Epitelial-Mesenchymale Transition (EMT) og DNA Metylering endringer. PLoS ONE 9 (6): e100249. doi: 10,1371 /journal.pone.0100249
Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA
mottatt: 04.02.2014; Godkjent: 22 mai 2014; Publisert: 24 juni 2014
Copyright: © 2014 Krohn et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), prosjekt C3, CRC 850 (til MB), og Deutsche Krebshilfe (110213 til BH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) er en svært ondartet og aggressiv lunge svulst utgjør ca 10-15% av alle lungekrefttilfellene rapporteres. Ca 30.000 tilfeller er diagnostisert hvert år i USA [1], [2]. Som en egen lunge-kreft gruppen skiller seg fra ikke-småcellet lungekreft (NSCLC, inkludert plateepitelkarsinom, stor celle karsinom, og adenokarsinom), er SCLC preget av svært tidlig metastasering og dårlig prognose. De fleste pasienter til stede med nodemetastaser, og to tredjedeler allerede har fjernmetastaser ved diagnosetidspunktet [3]. Til tross for å svare utgangspunktet godt til radio- og kjemoterapi, tilbakefall de aller fleste med en 1-års overlevelse for SCLC på bare 40%, og 5-års overlevelse under 5% [4]. Mens NSCLC behandling har kommet i de senere år, er ikke tilfredsstillende behandling SCLC [5]. Vi har vært vitne til noen vesentlige fremskritt i sin behandling i løpet av de siste 30 årene siden den standard diett av Etoposide i kombinasjon med cisplatin eller karboplatin ble etablert på midten av 1980-tallet [6]; kirurgisk reseksjon er unntaket, og kan bare dra et mindretall av nøye utvalgte pasienter [7]. Det er åpenbart et stort behov for nye tilnærminger for å forstå og behandle denne spesifikke lungekreft subtype.
SCLC forutsetter et bredt spekter av morfologiske opptredener histopathologically, med tumorceller vanligvis mindre enn størrelsen på 3 hviler lymfocytter. Det er imidlertid prøver som inneholdt cellene nådde så store som 7-lymfocytter, som demonstrerer deres morfologiske variasjoner [8] i tumorvevet. Typiske cytologiske funksjonene er fint granulert kromatin, mangel på fremtredende nucleoli og cellekantlinjer, og uttrykk for nevroendokrine markører [8]. Siden 2004, beskriver SCLC er WHO klassifisering to undergrupper: ren SCLC med mindre enn 10% store celler, og kombinert SCLC med over 10% ikke-småcellet komponenter [9]. Tumorer med en høy mengde av ikke-små-celle-komponenter beskrives som å være mer terapiresistente enn rene SCLC [10]. Det har også vært postulert at SCLC svulster skaffe kjemo- og radioresistance under behandling, utvikler seg til kombinert SCLC [11].
For å metastasere, cellene trenger å endre sin fenotype. Enkeltceller eller små grupper av celler få muligheten til å migrere og invadere gjennom omkringliggende vev basal membran. I løpet av denne prosessen, kreftceller oppløse celle-celle-tilkoblinger, miste sin basal-apikal polaritet, ledsaget av morfologiske forandringer avsløre en spindel form, etter som microvilli, filopodia og microtentacles blitt uttalt i stedet. Videre proteaser som matriksmetalloproteinaser (MMP) blir oppregulert, tilrettelegging nedbrytning av ekstracellulær matriks. Disse fremgangsmåter er også kjent som den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) og er blitt beskrevet i en rekke forskjellige krefttyper [12] – [15]. Men det er nesten ingen informasjon om EMT prosesser i SCLC så langt [16]. Det er bevis for at EMT er kritisk for både metastase og i kombinasjon med kjemo- og radioresistance [17]. EMT er en flertrinnsprosess som involverer uttales mobil plastisitet og mange forskjellige genetiske og epigenetiske forandringer [18]. Transkripsjonsfaktorer som sneglen /Snai1, Slug /Snai2, Zeb1, FSP og andre forårsaker opp- og nedregulering av flere gener. E-cadherin er blitt beskrevet som en sentral faktor i overgangen mellom den epiteliale og mesenchymale fenotype. Zeb1 og Snail /Snai1 bind til E-cadherin promoter og undertrykke transkripsjon av celleadhesjonsmolekyler [19]. Mens E-cadherin og Zona okkludens en typisk nedregulert i løpet av EMT er mesenchymale gener som vimentin, Fibronectin, og MMP oppregulert. Epigenetiske endringer som for eksempel DNA metylering, histonmodifikasjonene og microRNAs er kjent for å være involvert i EMT-relatert genregulering [15] og kan derfor også være ansvarlig for endringer i celle fenotype for å gjøre det mulig å spre og tilpasse seg nye mikro-miljøer.
i denne studien analyserte vi ulike cellepopulasjoner i SCLC cellelinjer, spesielt i NCI-H69 celler, for forskjeller i EMT viktige gener og funksjonelle egenskaper. Vi sammenlignet med flytende celleaggregater (NCI-H69) med adherently voksende variant delpopulasjoner (NCI-H69V). NCI-H69V ble valgt fra den parentale cellelinje NCI-H69 og er en variant på grunn av lave nivåer av neuroendokrine markører [20]. Sammenligning av underlinjer av NCI-H69 viser klart et annet uttrykk mønster for EMT markører og DNA-metylering, som er i sin tur forbundet med funksjonelle konsekvenser som kapasiteten for invasjon, migrering, MMP sekresjon og aktivering, celleproliferasjon, og chemoresistance. Oppsummert denne studien postulerer at det er en del av mesenchymale celler i SCLC cellelinjer som kan gjenspeile
in-vivo
situasjonen i SCLC med svulster som inneholder heterogene tumorcellepopulasjoner med mer eller mindre epitel og /eller mesenchymale egenskaper som kan være forbundet med de funksjonelle svar i løpet av de metastaseprosesser.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
Menneskelig SCLC cellelinjer NCI-H69, NCI-H82 og NCI-N592 ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC – Manassas, VA, USA). NCI-H69 og NCI-N592 ble verifisert av LGC Standards cellelinje godkjenning. NCI-H69V ble vennlig levert av BIOSs Toolbox (Freiburg, Tyskland). I tillegg ble NCI-H69 og NCI-H69V celler sammenlignet med SNP array (data ikke vist), som viste samme cellulære opprinnelse. Alle cellelinjer ble holdt i RPMI (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS) og 1% penicillin /streptomycin (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) i en fuktet atmosfære (5% CO2) ved 37 ° C. For å velge for tilhenger subpopulasjoner ble heftende celler innenfor NCI-H69, NCI-H82 og NCI-N592 holdes i kultur, mens flytende celler ble avhendet over flere passasjer.
Vekstratene og befolkning dobling tid
vekst~~POS=TRUNC rater~~POS=HEADCOMP av NCI-H69 og NCI-H69V ble bestemt seeding 3 * 10
6 celler (i tre paralleller) i vevskulturflasker. Cellene ble tellet på dag 2, 4 og 6 ved anvendelse av et hemocytometer. For å beregne befolkning dobling tid (PDT), formelen PDT = h * ln (2) /ln (c2 /c1) ble brukt i henhold til ATCC retningslinjer.
Immunofluorescensanalyse farging av vimentin, E-cadherin, Zona okkludens og Ki-67
Celler ble fiksert i 2% PFA, permeabilisert med 0,5% TritonX-100 ved 4 ° C i 10 min, og blokkert med PBS inneholdende 5,0% (volum /volum) normalt geiteserum og 0,3% (v /v) Triton X-100. Immunfluorescens farging ble utført med mus mAb Ki-67 (Dako, Hamburg, Tyskland), vimentin XP Rabbit mAb, E-cadherin kanin mAb og Zona okkludens mAb (cellesignalisering Technologies, MA, USA), og passende sekundære antistoffer (geit-anti -mouse IgG-Alexa488 og geit-anti-kanin IgG-Alexa467, Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Glassene ble deretter montert med Forleng Gold Antifade Reagens med DAPI (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
Omvendt transkripsjon PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner, etterfulgt av DNA-spaltning med DNase i (Applied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK). For cDNA syntese 1 mikrogram total RNA ble transkribert med iScript kit (
Bio-Rad
, Hercules, CA, USA). CDNA ble amplifisert ved hjelp av
Taq-polymerase
(Qiagen, Hilden, Tyskland) ved anvendelse av følgende PCR-programmet for alle primere: 94 ° C i 5 minutter etterfulgt av 28 sykluser ved 94 ° C 30 sek, 55 ° C 30 sek og 72 ° C i 30 sekunder og siste runde med amplifisering ved 72 ° C i 5 minutter. PCR-produktene ble analysert på en 1,0% agarosegel, visualisert og fotografert under UV-lys. For kvantifisering, ble PCR-band analysert av ImageJ 1.42q. For primer sekvenser se tabell 1.
Utarbeidelse av celleekstrakter og western blot analyse
Celler ble vasket med iskald PBS, og lysert ved hjelp Qproteome pattedyr Protein Prep Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) eller ved lysebuffer inneholdende 20 mM Tris /HCl pH 8,0, 150 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, 1% Triton X-100, 0,5 mM PMSF med protein-inhibitor cocktail (komplett, Roche Applied Science, Basel, Sveits). Like mengder av proteinprøver ble denaturert ved 95 ° C i 5 minutter, adskilt med 10% SDS-PAGE og overført til PDVF membraner. Membranene ble deretter blokkert med 5% ikke-fettholdig tørrmelk i PBS /0,1% Tween-20 og inkubert over natten med følgende antistoffer: ZO-1 mAb, vimentin XP kanin mAb, E-cadherin kanin mAb, sneglen kanin mAb, Slug kanin mAb, TCF8 /ZEB1 Rabbit mAb, β-catenin kanin mAb Anti-kanin IgG, GAPDH kanin mAb, HRP-bundet antistoff (epithelial-Mesenchymale Transition (EMT) antistoff Sampler Kit # 9782 fra cellesignalisering Technologies, MA, USA) og L -Dopa (# 8786 Cell Melde Technologies, MA, USA), Neuron-enolase (NSE) (# 9536 Cell Melde Technologies, MA, USA). Til slutt ble immunoreaktive band visualisert ved hjelp pepperrotperoksidase-konjugert sekundære antistoffer og den forbedrede kjemiluminescens system (Amersham Biosciences, Freiburg, Tyskland)
pyrosekvensering
Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop 1000 spektrofotometer (peqlab, Erlangen, Tyskland). DNA var bisulfite behandlet med EZ DNA Metylering-Gold Kit (Zymo Research, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner og lagret i delmengder ved -20 ° C inntil bruk. PCR-primere ble utformet ved hjelp av pyrosekvensering analyse Design Software (Qiagen, Hilden) (Tab.2). En universell kode ble plassert på 5’end av sekvens-spesifikke revers primer for CDH1 og en tilsvarende universell biotinylert primer inneholdende en 5′-biotin etikett ble tilsatt til disse PCR-reaksjoner. Den 5’end av sekvens-spesifikke revers primer anvendt for VIM amplikonet 1 og fragment 2 ble merket med biotin. Amplikonet (som strekker seg over -61 til 18 med hensyn til TSS) av CDH1 inkluderte syv CpG områder. Ved vimentin, ble amplikonet delt i to deler, adskilt av et 73-bp gap. Det første fragment av vimentin mellom nt 608 til 703 i forhold til TSS inneholdt tolv og den andre fragment (som strekker seg over 468 til 537 i forhold til TSS) åtte CpG-områder, henholdsvis. Hver 25 pl PCR-reaksjon inneholdt 1,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 0,03 U /ul varm start Taq DNA-polymerase (Invitrogen, CA, USA), 0.16 uM forover og revers primer og 1 pl av bisulfitt behandlet DNA. For CDH1 0,16 uM forover primer og 0,03 ul tailed revers primer og 0,14 uM biotinylert universal primer ble anvendt. Sykkelforholdene var som følger: 95 ° C i 5 minutter for innledende denaturering; 50 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing varierende temperatur i 30 s og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. PCR-produkter ble visualisert på 2% agarosegeler. Hver pyrosekvensering reaksjon ble oppnådd med 8-10 mL av hver biotinylert PCR produkt og Pyromark Gold Kit i henhold til produsentens instruksjoner på en PyroMark Q96 MD pyrosequencer (Qiagen, Hilden, Tyskland). I korte trekk, ble biotinylert enkelt strand DNA immobilisert på streptavidin-belagte Sepharose High Performance perler (GE Healthcare, UK) og adskilt av denaturering med 0,2 N NaOH. Etter gløding av sekvenseringsprimeren (0,25 uM /reaksjon) til det biotinylerte enkeltkjedet DNA, ble blandingen utsatt for sekvensering. Pyrograms ble analysert ved å bruke pyro Q-CpG programvare for å bestemme nivået av metylering denaturert og unmethylated cytosines på hvert CpG område i amplikonet. Hver pyrosekvensering analyse ble uavhengig er utført minst tre ganger. Student «s uparede t-tester ble utført for å teste statistiske forskjeller i det midlere nivå metylering av de analyserte amplikonene. Dyrkede lunge fibroblaster isolert fra tre pasienter uten fibrotiske sykdommer fungerte som normalt kontroll. Primerene som brukes til PCR er oppført i tabell 2.
Live-celle proteolyse analysen
LabTek 4-brønns kammer lysbilder ble belagt med fenol-rød gratis basalmembran matrix, som inneholder 30 ng /ml DQ-kollagen IV (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Etter 12 min størkning, 3 x 10
4 celler i fenol rød-fri RPMI med 1% FCS ble sådd på toppen av den belagte basalmembran matrise. Etter 48 timers inkubering ble cellene fiksert med 2% PFA, farget med Hoechst og montert. Nedbrytningsproduktene av DQ-substrat (grønn fluorescens) ble analysert på en automatisert mikroskop (scan∧R – Olympus) med en 20x, NA 0,75 UPLSAPO objektiv med Hoechst utslipp målt ved 440-475 nm og DQ-kollagen på 520-550 nm . Den midlere intensitet av DQ-substrat nedbrytning ble beregnet ved anvendelse av scan∧R Analysis Software (v. 1.2.0.6) og normalisert til antall cellekjerner.
matriksmetalloproteinase-antistoff matrise
Matrix metalloproteinaser i cellekondisjonerte medier ble analysert med human MMP Array 1 (RayBiotech, Norcross, GA, USA). Cellene ble vasket med PBS og inkubert med FCS-fri og fenol-rødt fri RPMI 1640 over natten. Etter sentrifugering ble celle-kondisjonert medium påføres de forhåndsblokkerte membraner, inkubert ved 4 ° C over natten og behandlet i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoff arrays ble kvantifisert med ImageJ programvare v. 1.42q.
Gelatin Zymografi
MMP-2 og MMP-9 virksomhet ble vurdert av gelatin zymografi. Cellene ble vasket med PBS og inkubert med FCS-fri og fenol-rødt fri RPMI 1640 over natten. Celle kondisjonerte medier ble konsentrert ved hjelp Amicon Ultracel 10 k kolonner. Etter bestemmelse av proteinkonsentrasjonen ved Bradford assay like mengder av protein og 2 pl MMP-2 Zymografi Kontroll (ProteaImmun, Berlin, Tyskland) ble underkastet elektroforese i 7% SDS-polyakrylamidgeler, inneholdende 1 mg /ml gelatin (Merck, Darmstadt, Tyskland) . Gelene ble vasket i 2,5% Triton X-100-løsning i 1 time, deretter inkubert over natten i inkubasjonsbuffer (0,05 M Tris /HCl pH 7,5, 0,2 M NaCl og 0,005 M CaCl2) ved 37 ° C. Gelene ble fiksert i 12% TCA i 1 time og farget i Coomassie brilliant blue R250-fargeløsning i 1 time, etterfulgt av avfarging. For lasting kontroller, ble prøver lastet opp på SDS-PAGE og farget med Coomassie brilliant blue-R250 farging.
Drug Resistance
For å teste kjemosensitivitet, 3 × 10
4 NCI-H69 eller NCI-H69V-celler ble utsådd i 6-brønners plater i 12 timer og ble deretter behandlet med 200 pM Etoposid (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland) i 48 timer som tidligere beskrevet [21]. Deretter ble cellelevedyktigheten testet under anvendelse av propidiumjodid (PI) (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland) og 3,3′-dihexyloxacarbocyanine jodid (DIOC6) (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland). Celler ble inkubert i RPMI 1640 inneholdende 0,5% BSA, 10 nM DIOC 6 og 2 mg /ml PI ved 37 ° C i 20 minutter og analysert ved flowcytometri på et FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Flowcytometri data ble analysert ved hjelp FlowJo programvare v.7.6.3 (Tre stjerners Inc., San Carlos, CA, USA).
Transwell migrasjon
Migrasjon av SCLC celler ble evaluert ved hjelp av 24- brønn microchemotaxis plater (Costar, New York, USA), i hvilken en x 10
6-celler i 100 pl RPMI 1640 uten FCS etter sult i 12 timer, ble satt inn i det øvre kammer og det nedre kammer inneholdt RPMI med 10% FCS . Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2, ble cellene tellet i henhold til produsentens instruksjoner. Invaderte celler på bunnen av innsatsen membranen ble dissosiert med trypsin og telt ved bruk av et hemocytometer. Migrasjon indeks ble beregnet som antall migrerte celler dividert med antall migrerte celler i den ubehandlede gruppen. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer. Data representerer gjennomsnittet +/- SD fra tre uavhengige eksperimenter
Invasion analyser
For invasjon analyser den QCMTM 24-Well Cell Invasion analysen. (ECM 550, Chemicon International, Temecula, CA, USA) med en 8 um porestørrelse polykarbonat-membran og et lag av ECMatrix lignende materiale ble anvendt. Analysene ble utført i henhold til produsentens instruksjoner, der 6 × 10
5 celler ble sultet i 12 timer, seeded inn i salen, og inkubert i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO
2. Det nedre kammer inneholdt RPMI med 10% FCS. Etter 48 h celler i det øvre kammer ble fjernet ved anvendelse av bomullspinner, ble invaderte celler på bunnen av innsatsen membranen dissosiert med trypsin og telt ved bruk av et hemocytometer. Forsøk ble utført in triplo.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans mellom kontroller og individuelle forhold ble bestemt ved GraphPad Prism programvare 5 ved hjelp av t-testen. * Representerer en P-verdi 0,01 til 0,05, ** representerer en P-verdi 0,01 til 0,001 og *** betyr en P-verdi som er mindre enn 0,001. En p-verdi på 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
Nøkkel EMT markører vimentin og E-cadherin er forskjellig uttrykt
SCLC cellelinjer som. NCI-H69 vanligvis vokser så tett-pakket flytende aggregater. Men en konsekvent andel (5-10%) av den totale observer celle nummer vokser adherently. For cellelinjen NCI-H69 en tilhenger underlinjen er etablert kåret NCI-H69V [20]. Immunofluorescent farging skilte seg betraktelig når du sammenligner NCI-H69 og dens underlinjen NCI-H69V for de viktigste markører for epiteliale og mesenchymale celler fenotyper E-cadherin og vimentin: NCI-H69 var positive for E-cadherin (Figur 1a) og Zona okkludens (Figur 1b ), men viste ingen vimentin uttrykk (figur 1c), mens det vedheftende NCI-H69V var negativ for E-cadherin (figur 1d), men sterkt positive for vimentin (figur 1f). Flertallet av NCI-H69V celler var negative for Zona okkludens (figur 1e); men noen enkeltceller viste svak rester Zona okkludens uttrykk (figur 1e, asterisk). Uttrykk av E-cadherin og vimentin, som kjennetegn gener av EMT, skiller mellom de ulike subpopulasjoner i cellelinjen, viser et flertall av epitel-lignende celler og færre adherently voksende celler med en mesenchymale-lignende fenotype.
suspensjonsceller (NCI-H69) er sterkt positiv for E-cadherin (rød) (a) og Zona okkludens (rød) (b), mens adherente NCI-H69V genene er negative for E-cadherin (d). Flertallet av NCI-H69V celler var negative for Zona okkludens, men noen enkeltceller viste svak Zona okkludens uttrykk (stjerne, e). Suspensjonsceller (NCI-H69) er negativ (c), mens tilhenger NCI-H69V er positiv (f) for vimentin (rød). Ki-67 ble co-farget (grønn). Celler ble fotografert av Zeiss Axioplan mikroskop og AxioCam Digital og analysert av ZeissAxioVision programvare. Bar representerer 20 mikrometer.
Ulike cellemorfologi innen SCLC cellelinjer
Vi undersøkte cellen morfologi subpopulasjoner (flytende vs. tilhenger) i SCLC cellelinjer. For dette formål er den heftende undergruppe ble øket ved seleksjon inntil cellene vokste som et fullstendig vedheftende monolag (fig 2b, e, g). Cellelinjene viste forskjeller i spontan tilslutning: NCI-N592 festet oftere og raskere enn NCI-H69 (NCI-H69: 2a, b /NCI-N592: Tall 2d, e). En tilhenger sublinje har vært etablert i NCI-H69, nemlig NCI-H69V (figur 2c) [20]. De adherente cellelinje vi valgt selv avslørte lignende morfologi (fig 2b, c). Vekstrater og dobling tider av NCI-H69 og NCI-H69V var sammenlignbare med 28 h (± 6,02) for NCI-H69 og 30 h (± 7,34) for NCI-H69V (figur S1).
NCI-H69 SCLC-cellelinjer som vokser i flytende klynger (a) med en liten subpopulasjon av adherently-voksende celler som ble valgt ved å anordne flytelegemer over flere passasjer (b) ligner den etablerte sublinje NCI-H69V (c). NCI-N592 og NCI-H82 i vanlige flytende klynger (d, f) og utvalgte adherente celler (e, g). Heft subpopulasjoner avsløre en spindel form, filopodia og microtentacles. Celler ble fotografert av Zeiss Axioplan mikroskop og AxioCam Digital og analysert av Zeiss LSM Image Browser. Bar representerer 200 mikrometer
Det er imponerende morfologiske forskjeller mellom tilhenger og flytende celler i alle undersøkte SCLC cellelinjer. Mens celler i flytende klynger vises liten og rund, med små kjerner, festet cellene er større, spredt, og har et stort cytoplasma-to-kjerne-forhold. Spesielt NCI-H69V-celler har en spindel form med lange pseudopodia og fibre, fine granulære kromatin og en mangel på fremtredende nucleoli. I tillegg trenger heftende celler vokser ikke via trange celle-celle kontakter til de er svært konfluent.
Uttrykk for EMT-relaterte gener og DNA metylering endringer i vimentin og E-cadherin under EMT
mRNA-ekspresjon av typiske EMT genprodukter ble sammenlignet mellom de forskjellige SCLC-cellelinjer og dens valgte adherente underlinjer av RT-PCR (figur 3a). Den epitel markørgenet E-cadherin ble sterkt uttrykt i flytende NCI-H69. I motsetning til dette, E-cadherin ekspresjon var lav i vedheftende NCI-H69V. Vimentin var fraværende i de flytende NCI-H69-celler, mens det ble sterkt uttrykt i adherently voksende NCI-H69adh og NCI-H69V (figur 3a). Disse forskjeller i mRNA-ekspresjon ble også påvist i NCI-H82 NCI-og N592 underlinjer, sammen med de adherente celler demonstrerer en mer mesenchymale-lignende mønster. Men konverteringen var ikke så klart som i NCI-H69 /NCI-H69V (figur 3a).
EMT markører og transkripsjonsfaktorer er uttrykt ulikt innenfor SCLC linjer (NCI-H69, NCI-H82, og NCI-N592). NCI-H69-celler uttrykte ikke mesenchymale markører eller spoler i suspensjonskulturer, tydelig på mRNA-nivå ved RT-PCR (a). Zeb1, Snail /Snai1, Slug /Snai2, og FSP er uttrykt i heftunderlinjen (NCI-H69V), men E-cadherin er bare uttrykt i suspensjonsceller. Mesenchymale markører Fibronectin og vimentin er oppregulert i de adherente underlinjer (a). MRNA-ekspresjon i NCI-H82 NCI-og N592, sammenlignet med dets tilfestede subkulturer generelt viste en lignende tendens mot en mesenkymale fenotype i de adherente celler (a). Western blot analyse viser redusert proteinnivået i epiteliale markører E-cadherin og Zona okkludens en, og uttrykk for mesenchymale markører vimentin og ZEB1 i NCI-H69V. EMT inductors Snail /Snai1, Slug /Snai2 er uttrykt i NCI-H69V (b). Uttrykket Endringen i vedheftende NCI-N592 mot en mesenchymale-lignende fenotype er mer betydnings på proteinnivået enn det mRNA-nivået (b). Den nevroendokrine markører NSE og L-Dopa er uttrykt i foreldrenes cellelinje NCI-H69, men er ikke synlig i den heftunderlinjen NCI-H69V (c). DNA-metylering analyse (d) i EMT kjennetegn genet vimentin viser sterk metylering i NCI-H69 og betydelig hypometylering i NCI-H69V, er E-cadherin metylering betydelig høyere i H69V. Som kontroll, dyrkede lunge fibroblaster isolert fra tre pasienter for vimentin metylering nivåer og fra to pasienter for E-cadherin metylering nivåer uten fibrotiske sykdommer fungerte som normalt kontroll. Linjen viser gjennomsnittet av tre uavhengige målinger. Forskjellene mellom den midlere metylering nivåene av det analyserte fragment ble testet ved anvendelse av Students uparede t-test (* p verdien 0,01 til 0,05, ** p verdi 0,01 til 0,001 og *** p-verdi mindre enn 0,001).
til sammen faktorer EMT-relatert transkripsjon Zeb1, Snail /Snai1, Slug /Snai2 og FSP ble uttrykt løst i de ulike cellelinjer (figur 3a). Vi merket oss de sterkeste forskjellene i NCI-H69V i forhold til NCI-H69 og derfor fokusert på disse cellene i de følgende eksperimenter.
Denne konverteringen fra epitelceller NCI-H69 celler i en mesenchymale fenotype (NCI-H69V) var demonstrert enda mer åpenbart på proteinnivå (figur 3b): vi har oppdaget betydelig nedregulering av epiteliale markører E-cadherin og Zona okkludens 1 i NCI-H69V ledsaget av oppregulering av EMT inductors og effektorer som ZEB1, Snail /Snai1, Slug /Snai2 og vimentin. Selv om mRNA-ekspresjon av NCI-N592 bare tendens mot en mesenchymale fenotype (figur 3a), protein ekspresjon klart frem en mesenchymale mønster (figur 3b).
Interessant, nevroendokrine markører NSE og L-dopa ble uttrykt i foreldrecellelinje NCI-H69, men var ikke påvises i sin tilhenger underlinjen (figur 3c).
DNA metylering av vimentin og E-cadherin
for å vurdere om epigenetisk regulering av DNA promoter metylering kan spille en rolle i ekspresjonsnivåene, søkte vi kvantitativ pyrosekvensering for å promotorområdene for vimentin og E-cadherin (figur 3d). Mens vimentin-promotoren viste DNA-metylering nivåer av 35% i NCI-H69-celler, DNA-metylering nivåer i NCI-H69V-celler var signifikant lavere med 1,3% (p 0,0001). Dette fører til aktiv gentranskripsjon, som faller på linje med den observerte økningen i vimentin på mRNA /protein-nivå (figur 1 og 2). Normale lungefibroblaster (n = 3) viste vimentin metylering nivåer av 1,1%. Omvendt, DNA-metylering nivåer av E-cadherin /CDH1 var 31% i H69-celler og øket til 40% i NCI-H69V-celler (p = 0,0032). Normale lungefibroblaster (n = 2) viste 17% og 8% metylering, respektivt. Dette invers korrelasjon mellom uttrykk og DNA metylering kan tyde på at DNA metylering bidrar til vimentin og E-cadherin mRNA regulering og protein uttrykk under EMT prosessen i SCLC cellelinjer.
Høyere migrasjon og invasiv potensialet tilhenger NCI-H69
For å undersøke om disse dramatiske fenotypiske forskjeller har funksjonelle konsekvenser, gjennomførte vi Transwell migrasjon og invasjon analyser. De adherente NCI-H69V-celler viste signifikant høyere migrering og invasjon til ekstracellulære matriksproteiner mot 10% FCS-holdig medium enn de NCI-H69-celler (figur 4). NCI-H69 viste svært lite migrasjon potensial og nesten ingen invasjon. Migreringen nivå i NCI-H69 suspensjonsceller var 15 celler pr migrering kammeret (± 6 /n = 3), mens NCI-H69V økte 11 ganger med 196 celler pr migrering kammeret (± 81 /n = 3) (p = 0,0001 ). Den invasjon nivå i H69 ble 7-celler pr migrering kammeret (± 3 /n = 3), mens NCI-H69V var 16 ganger høyere med 118 celler pr migrering kammeret (± 35 /n = 3) (p = 0,0001).
Adherently voksende NCI-H69-celler demonstrere signifikant høyere migrasjon (a) og invasjon (b) i retning av 10% FCS-inneholdende medium i forhold til suspensjonen cellelinje (*** p = 0,0001). Migrasjon indeks ble definert som antall migrerte celler dividert med antall migrerte celler i den ubehandlede gruppen (ingen FCS) etter 48 timer. Invasion Index ble definert som antall telte celler i fem visningsfelt delt på antall migrerte celler i den ubehandlede gruppen (ingen FCS) etter 48 timer.
Live cell imaging av ekstracellulært proteolytisk aktivitet indikerer høyere proteolytisk potensialet heftunderlinjer
Kreft celle invasjon er ledsaget av nedbrytning av ekstracellulær matriks (ECM). På grunn av større invasjon av tilhenger underlinjen, analyserte vi dens potensial for kollagen IV degradering. Etter 48 timers inkubering på matrigel innehold DQ-kollagen IV, adherente NCI-H69V-celler viste signifikant høyere pericellulær nedbrytning av kollagen enn NCI-H69-celler som målt ved hjelp av grønn fluorescens. Kvantifisering av proteolytisk aktive celler viste at 77% av NCI-H69V celler var positive, mens bare 8% av NCI-H69 suspensjonsceller var positive (figur 5)
Live-cell proteolyse analysen. Suspensjon NCI -H69 og adherente NCI-H69V-celler ble inkubert i 48 timer på matrigel inneholdende 30 ng /mL DQ-kollagen IV. (A) Nedbrytning av kollagen bestemmes av grønn fluorescens som omgir positive celler. Bar representerer 30 mikrometer.
