Abstract
Livmorhalskreft er en av de vanligste kreftformene hos kvinner over hele verden, er høyrisikogruppe HPV smittet, ledende etiologisk faktor. Den raf-kinase-inhiberende protein (RKIP) har blitt forbundet med tumorprogresjon og metastase i flere humane svulster, men dens rolle på livmorhalskreft er uklart. I denne studien, 259 livmor livmorhalsen vev, inkludert cervicitt, cervikal intraepitelial lesjoner og karsinom, ble analysert for RKIP uttrykk ved immunhistokjemi. Vi fant at RKIP ekspresjon ble betydelig redusert i løpet av ondartet progresjon, som er sterkt uttrykt i ikke-neoplastiske vev (54% av prøvene, 73/135), og uttrykt ved lave nivåer i livmorhalsen invasive karsinomer (~15% (19/124 ). Etter
in vitro
nedregulering av RKIP, observerte vi en levedyktighet og proliferativ nytte av RKIP-hemmet celler over tid, noe som var forbundet med en endret cellesyklus distribusjon og høyere koloni tall i en koloni formasjon analysen. en
in vitro
sårheling analysen viste at RKIP opphevelse er assosiert med økt vandrende evne. RKIP downregulation ble også assosiert med økt vaskularisering av svulstene
in vivo
bruke en CAM-analysen. Videre RKIP hemming indusert livmorhalskreftceller apoptotiske resistens mot cisplatin behandling. Avslutningsvis beskrev vi at RKIP protein er betydelig utarmet i løpet av ondartet progresjon av livmorhals svulster. til tross for manglende samarbeid med pasienten klinisk utfall, viser vi,
in vitro
og
in vivo
, at tap av RKIP uttrykk kan være en av faktorene som er bak aggressivitet, ondartet progresjon og kjemoterapi motstand av livmorhalskreft
Citation. Martinho O, Pinto F , Granja S, Miranda-Gonçalves V, Moreira MAR, Ribeiro LFJ, et al. (2013) RKIP Hemming i Livmorhalskreft er assosiert med høyere Tumor Aggressive Behavior og Motstand mot Cisplatin Therapy. PLoS ONE 8 (3): e59104. doi: 10,1371 /journal.pone.0059104
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Italia
mottatt: 23 november 2012; Godkjent: 11 februar 2013; Publisert: 19 mars 2013
Copyright: © 2013 Martinho et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av den portugisiske Fundação para en Ciencia e Tecnologia (gi PTDC /SAU-TOX /114549/2009). Olga Martinho og Sara Granja var mottakere av Stipendiater (SFRH /BD /36463/2007 og SFRH /BD /51062/2010, henholdsvis), og Filipe Pinto og Vera Miranda-Gonçalves var mottakere av stipendiatstillinger (UMINHO /BI /016 /2011 og SFRH /BI /33503/2008, henholdsvis), begge fra FCT, Portugal. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Livmorhalskreft er den tredje vanligste diagnosen kreft. og den fjerde største årsaken til kreftdød hos kvinner over hele verden, står for 9% (529,800) av den totale nye krefttilfeller og 8% (275,100) av den totale kreftdødsfall blant kvinner i 2008 [1]. Vedvarende infeksjon med høyrisiko typer av humant papillomavirus (HPV) er en
sinus-qua-non
betingelse for livmorhalskreftutvikling. HPV infiserer epitelceller og forårsake en rekke lesjoner som strekker seg fra vanlige vorter til livmorhalskreft neoplasi og [2] – [4]. Svulster i livmorhalsen er delt inn i tre ulike histologiske undergrupper: Livmor plateepitelkarsinom (SCC) er den hyppigste, etterfulgt av adenokarsinom (AC) og adenosquamous karsinom (ASC), som er en uvanlig subtype [5]. HPV-infeksjon alene er ikke nok for å utløse livmorhalskreft og HPV-mediert onkogenese krever også opphopning av flere genetiske endringer som oppstår over tid følgende første infeksjonen [6]. Det kan ta flere år for en
in situ
svulst å utvikle seg til en invasiv carcinoma. Mekanismen for klonal evolusjon, noe som innebærer valg av celler med invasive eller metastatisk potensiale, forblir også uløst
Raf-kinase-inhiberende protein (RKIP, også kjent som PEBP1, for fosfatidyletanolamin-binding protein1)., Som angitt ved navnet, ble først identifisert som en endogen inhibitor av RAF /MEK /ERK vei, inhibering av Raf-1-aktivering [7] – [9]. Egentlig RKIP har vært implisert i en rekke intracellulære signalveier som kontrollerer cellevekst, [10], [11], motilitet [12], [13], epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [14] og differensiering [15]. RKIP er allment uttrykt i normale humane vev, fremhever dets rolle i en rekke fysiologiske prosesser [16], men er ansett for å være en metastase suppressor i kreft [17], som er dens tap eller redusert ekspresjon i forbindelse med malignitet og prognose i mange typer av metastatisk og aggressive kreft [10], [11], [18] – [34]
en tidligere studie, utført i en liten brøkdel av pasienter, funnet ved uttrykket mikromatriseanalyse som RKIP er en av de gener som. er uttrykt forskjellig mellom tumorprøver fra livmorkreftpasienter med eller uten lymfeknutemetastase [35]. Mer nylig ble det funnet i en stor serie av pasienter som RKIP protein er vesentlig nedregulert i livmorhalskreft og lymfeknutemetastase [36]. I tillegg er en annen studie med HeLa-cervical kreft celler viste at RKIP, gjennom regulering av ERK-reaksjonsveien, har en viktig rolle i mitotisk sjekkpunkt regulering [37]. Derfor de tidligere funn, bedt oss om å belyse biologiske rolle RKIP i livmorhalskreft ondartet progresjon og kjemoterapi respons. Derfor må vi først vurderes uttrykket nivåer av RKIP protein i både godartede og tumorlivmorhalsprøver, og vurdert sin rolle i den kliniske utfallet av livmorhalskreftpasienter. For det andre, vi vurderte
in vitro Hotell og
in vivo
biologiske funksjon RKIP downregulation i cervical kreft og kjemoterapi respons.
Materialer og metoder
vevsprøver
For dette arbeidet, ble 259 cervical vev analysert, som inkluderte 45 cervicitt, 47 lavgradige plateepitel intraepitelial lesjoner (LSIL), 43 høyverdig plateepitel intraepitelial lesjoner (HSIL), 70 plateepitelkarsinom (SCC), 41 adenokarsinomer (AC) og 13 adenosquamous karsinom (ASC) (tabell 1). Parafinprøver som inneholder cervical non-maligne lesjoner ble hentet fra arkivene i patologi delingen av Adolfo Lutz Institute São Paulo, Brasil, og invasiv livmorhalskreftprøver ble hentet fra Araújo Jorge Hospital og School of Medicine i Federal University of Goiás (Goiânia, Goias stat, Brasil). Alle histopatologiske diagnoser ble gjennomgått av forfatterne og kategorisert i henhold til WHO klassifisering. Alle pasienter med livmorhalskreft var hunner av brasiliansk opprinnelse, med en gjennomsnittsalder på 49 år (23-74 år). Oppfølgingsdata var tilgjengelig for 72 pasienter, og samlet inn gjennom direkte intervju med pasienter eller pårørende, og ved gjennomgang av i-sykehuset pasientjournaler. Median oppfølgingstid (total overlevelse) var 35,5 ± 42,0 måneder (range, 2-144 måneder).
Alle prøvene som deltok i denne studien var opphevet og uidentifisert fra sine givere. På grunn av den retrospektive natur studie ble det ikke skriftlig informert samtykke fra pasienter oppnådd. De lokale etiske komiteer i de involverte institusjoner (etikkutvalg i Human Forskning av Adolfo Lutz Institute São Paulo og Araújo Jorge Hospital fra School of Medicine i Federal University of Goiás, Brasil) godkjennelse av arbeidet og fravikes behovet for skriftlig informert samtykke .
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
For denne studien ble det brukt tre livmorhalskreft cellelinjer: HeLa cellelinje, vennlig levert av Dr
a Elsa Logarinho (IBMC, Portugal) [38] , Siha og C-33A cellelinjer som ber ble gitt av Dr
en Luisa Villa (INCT-HPV, Brasil) [39]. Alle cellelinjer ble dyrket og opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM 1 x, høy glukose, Gibco, Invitrogen) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco, Invitrogen ) og 1% penicillin /streptomycin løsning (Gibco, Invitrogen) (DMEM-10).
Drugs
Cisplatin (cis-Diammineplatinum (II) klorid) ble hentet fra Sigma-Aldrich og utvannet i 0,9% NaCl til en stamløsning av 10 mM. Stoffet ble deretter fremstilt som intermediated fortynninger for å oppnå en lik mengde av medikament bærer (1% endelig konsentrasjon) i hver av de betingelser som ble studert. I alle eksperimentelle forhold medikamentene ble fortynnet i 0,5% FBS dyrkingsmedium (DMEM-0.5).
Immunohistochemistry og Immunocytochemistry Analyse av RKIP
Histologiske lysbilder med 4 mikrometer tykke vevssnitt ble utsatt for immunhistokjemisk analyse i henhold til den streptavidin-biotin-peroksidasekompleks system (Ultra stort volum Deteksjonssystem system~~POS=HEADCOMP Anti-Polyvalent, HRP; LabVision Corporation), ved hjelp av det primære antistoff dannet mot RKIP (Millipore henvisnings 07-137) fortynnet 1:600, inkubering 1H hos RT, som tidligere beskrevet [18], [25], [40], [41]
Snittene ble mottok en dobbel-blind for cytoplasmatic uttrykket etter en semi-kvantitativ kriterium:. (
–
), 0% av immunreaktive celler; (+),
5% av immunreaktive celler; (++), 5-50% av immunreaktive celler; og (+++),
50% av immunreaktive celler. Prøver med score (
–
) og (+) ble vurdert som negative, og de med score (++) og (+++) ble vurdert som positive
For RKIP immunocytokjemisk analyse av livmorhals. karsinom-cellelinjer, ble cellene sådd ut på dekkglass plasseres i 12-brønners plater og tillatt å følge natten over. Den immunocytochemistry prosedyren ble utført som tidligere beskrevet [41].
Generering av shRKIP stabilt uttrykker cellelinjer
For generasjon av cellelinjer som stabilt uttrykker shRKIP brukte vi PQY15 vektor, som inneholder en 19 bp shRNA for RKIP, som tidligere beskrevet [37], [41], [42]. Transfeksjon ble utført ved hjelp av Fugene HD-reagens (Roche) som anbefalt av fabrikanten, med 2 pg av plasmid i et forhold på 6:02 (Reagens: Plasmid). Cellene (2 x 10
5) ble utsådd på en 12-brønns plate inntil 80% konfluens og transfektert i DMEM-medium, uten FBS og antibiotika tilsetning, i løpet av 24 timer i [41]. Deretter ble stabile transfektanter valgt med 0,5 ug /ml (HeLa) eller 2 ug /ml (C-33A og Siha) av puromycin i DMEM-10. Den tomme vektor ble transfektert også som en kontroll.
Western Blot analyse
Cellene ble plate i en 6-brønns plate ved en densitet på 8 x 10
5 celler per brønn og tillatt å følge minst 24 timer. Cellene ble serum sultet i 6 timer før protein isolasjon. Når det er nødvendig, ble cellene også stimulert med 10 ng /ml EGF med 10 minutter før slutten av 6 timers sult. Også for cisplatin eksperimenter ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av cisplatin i en ytterligere periode på 24 timer i DMEM-0,5. Cellene ble skrapet i kald PBS og lysert i buffer inneholdende 50 mM Tris pH 7,6 til 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 10 mM NaPyrophosphate, 1% NP-40 og 1/7 av protease cocktail hemmere (Roche). Western blotting ble gjort ved hjelp av standard 12% SDS-PAGE gel, lasting 20 mikrogram protein per kjørefelt, med påvisning av forsterket kjemiluminescens (SuperSignal West Femto maksimal følsomhet Underlag, Pierce). RKIP ekspresjon ble målt ved anvendelse av et spesifikt antistoff mot RKIP (fortynning 1:2000, Upstate Biotechnology). Aktivert ERK og EGFR ble vurdert ved hjelp av antistoff fosfor-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) og fosfor-EGFR (Y1068) (fortynning 1:1000, Cell Signaling Technology). Den totale form av ERK og EGFR ble også vurdert med antistoffer P44 /42 MAPK (ERK1 /2) (klone 137F5, fortynning 1:1000, Cell Signaling Technology) og EGFR (fortynning 1:500, klone 31G7, Zymed Laboratories). For apoptose vurderingen ble det brukt antistoffer mot kløyvde PARP (klone Asp214, fortynning 1:1000, Cell Signaling Technology), kløyvde caspase-9 (klone Asp330, fortynning 1:1000, Cell Signaling Technology) og PARP (fortynning 1:1000, Cell Signaling Technology). For lasting kontroll vi brukte β-Tubulin (klone AA2, fortynning 1:5000, Upstate Millipore). Alle de primære antistoffene ble inkubert i en time ved RT.
Blot påvisning ble utført ved kjemiluminescens (ECL Western Blotting Detection reagenser, RPN2109, GE Healthcare) i Imagequant ™ LAS 4000 mini (GE Healthcare) eller ved hjelp av X100 Hyperfilm ECL (Amersham, GE Healthcare).
celleviabilitet og proliferasjonsanalyser
cellene ble sådd ut i 96-brønners plater i triplikat ved en tetthet på 3 x 10
3 celler pr brønn og lov til å følge over natten i DMEM-10. Etter 6 timer med serum sult levedyktig eller proliferative celler ble kvantifisert ved hjelp av Cell Titer96 Aqueous celleproliferasjonsanalyse (Promega) eller med Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolo, Roche Applied Science) og brukes for tiden 0 verdi. Deretter ble cellene inkubert i DMEM-medium uten serum i løpet av 24, 48 og 72 timer og cellelevedyktigheten og proliferasjon ble igjen vurdert ved Cell Titer96 Vandig celleproliferasjonsanalyse and Cell Proliferation ELISA, BrdU (kolorimetrisk), respektivt. Resultatene ble kalibrert til startverdi (tid 0 h, regnet som 100% av levedyktighet /proliferasjon) og uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analysen ble utført in triplo i minst tre ganger.
For å bestemme konsentrasjonen ved hvilken 50% av celleveksten hemmes ved cisplatinbehandling (IC
50 konsentrasjon), ble cellene sådd ut i 96- brønns plater ved en tetthet på 3 x 10
3-5 x 10
3-celler per brønn og tillatt å over over natten i DMEM-10. Deretter ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av medikamentet fortynnet i DMEM-0,5. Etter 48 timer ble cellenes levedyktighet kvantifisert ved hjelp av Cell Titer96 Vandig celleproliferasjonsanalyse (MTS) (Promega). Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av levedyktige celler i forhold til medikament bærer alene (regnet som 100% levedyktighet). IC
50 konsentrasjonen ble beregnet ved ikke-lineær regresjonsanalyse ved bruk av GraphPad Prism software.
Wound Healing Migration Assay
Cellene ble sådd ut i 6-brønners plater og dyrket i minst 95% av samløpet. Monolags Cellene ble vasket med PBS og skrapt med en plast 200 ul pipettespiss og deretter inkubert med friskt DMEM-medium uten serum. De «sårede» områder ble fotografert av fasekontrastmikroskop på 12, 24 eller 48 timers tidspunkter. Den relative migrering avstand ble beregnet ved hjelp av følgende formel: Prosent for sårheling (%) = 100 (A-B) /A, hvor A er bredden av celle sår før inkubering, og b er bredden av celle sårene etter inkubering [ ,,,0],41]. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analysen ble utført in triplo i minst tre ganger.
Cell Cycle Analysis
Cellene ble sådd ut i en 6-brønns plate ved en densitet på 2 x 10
5 celler pr brønn og lov til å følge over natten. Etter 6 timer med serum sult cellene ble inkubert med friskt DMEM-medium uten serum i løpet av 24 timer. Celler ble tripsinized og fiksert i 70% etanol i minst 30 minutter, og deretter farget i løpet av en time ved 50 ° C med en propidiumjodid (PI) løsning (20 ug /ml PI og 250 ug /ml RNase i en oppløsning av 0,1 % Triton X-100 i PBS). Cellesyklus analyse av PI fargede celler ble utført av flowcytometri (LSRII, BD Biosciences). Prosentandelen av celler i hver fase av cellesyklusen ble bestemt med programvaren FlowJo versjon 7.6.3. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av prosentandelen av celler i G1 fase eller i G2 /M fase plus S [41]. Analysen ble utført in triplo i minst tre ganger.
soft agar-kolonidannelse Assay
soft-agar-kolonidannelse analyse ble gjort ved hjelp av standardmetoder, som tidligere beskrevet av oss [43]. Kort sagt ble 1 ml barrierelag (basis agar-lag) bestående av 0,6% agar medium fremstilt i 6-brønners plater ved å kombinere like volumer av 1,2% Noble agar med enten 2x DMEM-medium med 20% FBS. Cellene ble trypsinert, sentrifugert, og ressuspended i 0,35% agar medium (topp agar lag, like volumer av 0,7% Noble agar og 2 x DMEM med 20% FBS); 2 x 10
3-celler ble deretter platet ut på de tidligere fremstilte basen agar-lag. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære i 15 dager og koloniene dannet farget med 0,05% krystallfiolett i 15 min. Stained kolonier ble fotografert med en stereomikroskop (Olympus S2 × 16) og et digitalt kamera (Olympus DP71) og regnet med bilde J Software. Bare koloniene med en størrelse som er større enn 775 um
2 (ca. 31,4 um diameter) ble tellet [43]. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analysen ble utført i tre eksemplarer minst tre ganger.
Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Analyse
For å vurdere
in vivo
tumor spredning og angiogenese vi brukte CAM-analysen som tidligere beskrevet [41], [43]. Befruktede kyllingegg ble inkubert ved 37 ° C og 70% fuktighet, og på dag 3 av utviklingen, ble et vindu laget inn i skallet, som ble forseglet med tape, og eggene ble returnert til inkubatoren. På dag 9 av utviklingen, ble små plastringer plassert på CAM og på dag 10 av utviklingen 3 × 10
6 celler, resuspendert i 20 pl DMEM medium, ble injisert i ringene over CAM. På dag 17 av utviklingen, ble svulsten dannet fotografert
i ovo
ved hjelp av en stereomikroskop (Olympus S2 × 16), og omkretsen av svulsten ble målt ved hjelp av Cell B-programvare (Olympus). Resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Til slutt, kylling egg ble avlivet ved -80 ° C i 10 minutter, og CAM og tumorer ble fiksert med paraformaldehyd ved 4% og fotografert
ex ovo
for blodkar telling. Svulstene ble dyppet i parafin og behandlet for histologisk analyse.
Statistical Analysis
Korrelasjon mellom RKIP uttrykk og kliniske data fra pasienter ble utført ved hjelp av chi-kvadrat test (χ2-test). Kumulative overlevelsessannsynlighet ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Forskjeller mellom overlevelse ble testet med log-rank test. Den statistiske analysen ble utført ved hjelp av SPSS programvare for Windows, versjon 17.0. For
in vitro Hotell og
in vivo
analyser, enkle sammenligninger mellom de ulike forholdene studert ble gjort ved hjelp av Student t test, og forskjeller mellom gruppene ble testet ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA) . Statistisk analyse ble gjort ved hjelp av grafen Pad Prism versjon 5. Signifikansnivået i all den statistiske analysen ble satt til p. 0,05
Resultater
RKIP Expression i Cervical Vev
en immunhistokjemi tilnærmingen ble gjort for å påvise RKIP protein uttrykk og distribusjon i livmorhalskreft (fig. 1).
A) Positiv uttrykk i en cervisitt. B) Høy grad av plateepitel intraepitelial lesjon med negative uttrykk. C) Adenocarcinoma vev som viser positiv uttrykk. D) Negativ adenokarsinom (*) med tilstøtende normale celler (pil) som viser positiv farging. Alle bildene ble tatt med 200 x forstørrelse.
Cytoplasmatic positivt uttrykk for RKIP ble observert hos 64,5% (29/45) av cervicitis prøvene, i 44,7% (21/47) av LSIL og 53,5% (23/43) av HSIL (tabell 1) (fig. 1A og B). Ingen signifikante forskjeller ble observert i uttrykket nivåer av RKIP mellom LSIL og HSIL (
p
= 0,404), og også mellom cervicitt og plateepitel intraepitelial lesjoner (SIL) generelt (
p
= 0,087 ), tabell 1). Når det gjelder maligne lesjoner, RKIP var til stede i små mengder, med bare 19,5% (8/41) av AC, 12,9% (9/70) av SCC og 15,4% (2/13) av ASC som viser positiv farging (tabell 1) ( fig. 1C og D). Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom RKIP uttrykk i de ulike maligne lesjoner studert (
p
= 0,643, Tabell 1). Men når gruppere godartede lesjoner (cervicitis og SIL) og maligne lesjoner (AC, SCC og ASC), ble en statistisk signifikant reduksjon av RKIP uttrykk observert i livmorhalskreft prøver (
p
0,001) når sammenlignet med benigne lesjoner (Tabell 1)
Ingen korrelasjon ble funnet mellom RKIP uttrykk og kliniske trekk ved pasientene, slik som alder, tilstedeværelse av metastaser og oppfølgingsdata, uavhengig av histologisk type (p 0.05, tabell 2).
RKIP Expression og Modulation av ERK Pathway i livmorhalskreft cellelinjer
for å studere rollen til RKIP i livmorhalskreft, vi først screenet for RKIP uttrykk i menneskelige livmorhalskreft cellelinjer (HeLa, Siha og C-33A) av immunocytokjemi og western blot (fig. 2). Vi fant at RKIP blir uttrykt ved høye nivåer i alle cellelinjer, og er til stede på både cytoplasma og cellekjernen av cellene (fig. 2A), slik som allerede tidligere beskrevet [37]. Alle cellelinjer ble brukt for å knockdown ekspresjon av RKIP ved stabil transfeksjon med PQY15 vektor inneholdende et kort hårnål-RNA for RKIP (shRKIP). Den tomme vektor ble transfektert også som kontroll. De RKIP proteinnivåer i disse stabile transfekterte celler ble bestemt ved western blot-analyse. Som vist på fig. 2B, RKIP protein nivåer ble effektivt hemmet i shRKIP transfekterte celler sammenlignet med tom vektor transfekterte celler.
A) Immunocytochemistry analyse for RKIP i HeLa, Siha og C-33A celler som viser både kjernekraft og cytoplasmatic uttrykk. B) For RKIP hemning, cellelinjene ble stabilt transfektert med et shRNA for RKIP og med de respektive tom vektor for kontroll. RKIP uttrykk nivåer ble vurdert av western blot. Videre ble cellene stimulert med 10 ng /ml EGF etter 10 minutter, og EGFR og ERK-aktivering (fosforylering) ble undersøkt ved western blot for fosfo-ERK1 /2 og fosfo-EGFR-ekspresjon, men ble ikke observert noen signifikante forskjeller. E: Tom vektor; Sh. ShRKIP
For å undersøke hvilken rolle RKIP i modulering av EGF stimulert ERK signal i livmorhalskreft, ble de transfekterte cellene stimulert med EGF, og EGFR og ERK fosforylering nivåene ble vurdert av western blot . Som det kan observeres i fig. 2B, gjorde EGF stimulering ikke føre til vesentlige effekter i aktivering av ERK signalisering i disse cellene, uavhengig av RKIP status.
Rolle RKIP Expression i livmorhalskreft cellelinjer Biologisk Opptreden
For å vurdere om modulering av RKIP uttrykk påvirket tumorigen egenskapene til cellene, vi valgte cellelinje med høyeste grad av RKIP hemming av shRKIP, HeLa og målt
in vitro
sin levedyktighet, spredning, forankringsuavhengig vekst og migrasjon evner (fig. 3). Vi har observert at shRKIP transfekterte celler har en betydelig fordel levedyktighet over tid (fig 3A.), Sammenlignet med tom vektor transfekterte celler (p 0,05). Denne forskjellen kan være en refleksjon av et økt celle nummer eller det kan reflektere økt cellenes stoffskifte. For å se om dette levedyktighet fordel skyldes økte spredning priser, studerte vi effekten av RKIP på BrdU innlemmelse, cellesyklus distribusjon og forankring uavhengig vekst. Den BrdU analysen bekreftet at shRKIP transfekterte celler har en betydelig fordel proliferativ over tid (fig. 3B). Den myke agar-kolonidannelse analysen viste en signifikant (p 0,05) økning i antall av koloniene dannet i shRKIP transfekterte celler når sammenlignet (figur 3C). Kontrollcellene. Ved cellesyklusanalyse, observerte vi at shRKIP transfekterte celler hadde et redusert G0 /G1 fase med en samtidig og signifikant (p 0,05) økning i G2 /M + S-fasen (Figur 3D.). Disse resultatene ble ytterligere validert i de andre to transfekterte cellelinjer, Siha og C-33A (fig. S1A-D).
A) Cellular levedyktighet og B) Proliferasjon ble målt ved 24, 48 og 72 timer etter MTS og BrdU analyser, henholdsvis. RKIP inhiberte celler hadde en statistisk signifikant levedyktighet og proliferativ fordel over tid, når sammenlignet med kontrollceller. C) Celler ble analysert for deres evne til å proliferere i vekstmedium inneholdende 0,35% agar og dannelsen av multi-cellulære kolonier fotografert ved x16 forstørrelse etter 14 dager. RKIP inhibering induserer en statistisk signifikant forankrings-uavhengig vekst av HeLa-celler i bløt agar. D) nedregulering av RKIP i HeLa-celler indusert en forskyvning på cellesyklusfordeling med en statistisk signifikant høyere prosentandel av celler i G2M + S-fasen når sammenlignet med kontrollceller. Cellesyklusanalyse ble foretatt ved 24 timers tidspunktet ved strømningscytometrisk analyse av propridium jodid fargede celler. E) En standardisert bunnen (sår) ble påført på monolag og digitale bilder ble tatt ved flere tidspunkter (0, 12, 24 og 48 timer). Det ble observert at shRKIP transfekterte celler hadde en statistisk signifikant migrering fordel over tid, sammenlignet med kontroll-celler (panel høyre). Representative bilder på 0 og 48 timer presenteres i venstre panel. Alle forsøkene ble utført in triplo i minst tre ganger. Data representert som gjennomsnitt ± SD og forskjeller med en
p
. 0,05 på to-veis ANOVA eller student t-testen ble ansett som statistisk signifikant (*)
Til slutt , for å ta virkningen av RKIP i HeLa-cellemigrering, utførte vi sårheling migrasjonsanalyse og observert at shRKIP transfekterte celler hadde en migrering fordel over tid, med en signifikant (p 0,05) høyere hastighet for sårheling sammenlignet med kontrollcellene (fig. 3E). Det samme ble observert i de andre to transfekterte cellelinjer, Siha og C-33A (fig. S1E-F).
In vivo
rolle RKIP Expression i Livmorhalskreft Vekst og Angiogenese
for å undersøke effekten av RKIP-mediert tumorvekst og angiogenese
in vivo
, utførte vi CAM-testen (fig. 4). De transfekterte celler ble implantert i CAM av kylling embryo (tom vektor-celler, n = 10; shRKIP celler, n = 10), og syv dager etter celle implantasjon ble kyllingembryoer ofret for å vurdere tumorvekst og angiogenese, som beskrevet i materialer og metoder delen. Den midlere omkrets av tumorene som dannes ved hjelp av styre og shRKIP transfekterte celler var 4335 ± 823 um og 4913 ± 1568 um, respektivt. Som vist på fig. 4B, størrelsen av svulstene dannet av shRKIP celler var ikke signifikant høyere sammenlignet med tumorene som dannes av de tomme vektor cellene.
A) Representative bilder (16 x forstørrelse) av CAM-testen etter 7 dager etter tumor veksten
i ovo Hotell og
ex ovo
. B) Tumorvekst ble målt
in vivo
av CAM-analyse som beskrevet i materialer og metoder delen. Det ble observert en høyere omkrets (uM) av tumorene (
in ovo
) dannet av shRKIP celler, men forskjellen mellom kontrollcellene var ikke signifikant. C) Hematoxylin-eosin-farging av parafin innleiret tumorer som viser høyere vaskularisering indusert av RKIP inhibering. Representative bilder med 10 × og 20 × forstørrelse er representert i panelet til venstre. D) Telling av blodkarene
ex ovo
, ble det observert en statistisk signifikant økning i antall fartøy rekruttert i tumorene dannet av shRKIP celler når sammenlignet med kontrollen. I alt ble det analysert 20 egg (10 injisert med tom vektor og 10 med shRKIP celler). Dataene er representert som gjennomsnitt ± SD og forskjeller med en
p
0,05 på Student t-testen ble ansett som statistisk signifikant (*)
For å evaluere effekten av. RKIP i angiogenese modulasjon, vi telles
ex ovo
antall fartøy rundt svulster. Vi telles en middelverdi på 54 ± 16 og 83 ± 10 fartøy i tumorene som dannes av den tomme vektoren og shRKIP transfekterte celler, respektivt. RKIP inhiberte celler viste en statistisk signifikant (
p
0,05) økning i blodårer rekruttering når sammenlignet med kontrollceller (figur 4D.). Som vist på fig. 4C, den hematoxylin-eosin farging av parafininnebygd svulster og CAM konstaterte de rike vaskularisering av svulstene med kapillærer rundt svulsten og kapillærer spirende ut av CAM i svulstene. Høyere forekomst av vaskularisering ble observert i tumorer dannet av shRKIP transfekterte celler (fig. 4C).
Rolle RKIP i livmorhalskreftceller respons på kjemoterapi
For å finne ut om RKIP protein kan være involvert i modulering av livmorhalskreft pasientens respons på konvensjonell kjemoterapi, bestemt vi følsomhet av livmorhalskreft cellelinjer transfektert med shRKIP til cisplatin behandling. Som det kan observeres i de cytotoksiske analyser (fig. 5A), hele shRKIP transfekterte cellelinjer var mindre følsom overfor cisplatin behandling, når sammenlignet med kontrollcellelinjer transfektert med den tomme vektoren, blir denne forskjellen mindre tydelig for C-33A cellelinje. Som vist på fig. 5B, HeLa-celler transfektert med shRKIP viste en gjennomsnittlig IC
50 av 18,55 ± 2,06 mikrometer mot 5,91 ± 0,30 mikrometer nås av de tomme vektor celler. For C-33A cellelinje var verdiene mer lik mellom de to transfekterte cellelinjer, 10,37 ± 2,69 uM og 13,25 ± 1,98 uM for den tomme vektoren og shRKIP transfekterte celler, henholdsvis (fig. 5B). Den Siha cellelinjen var den mindre følsom overfor cisplatin med den tomme vektoren transfekterte celler nådde 25,99 ± 0,51 uM av gjennomsnittlig IC
50, mens shRKIP transfekterte celler nådde 40,69 ± 2,37 uM av gjennomsnittlig IC
50 for cisplatin (Fig . 5B).
A) Representative bilder av lineær regresjonsanalyse av livmorhalskreftcellelinjer som ble behandlet med cisplatin for bestemmelse av halvparten av maksimal hemmende konsentrasjoner (IC
50). B) Grafisk fremstilling av gjennomsnittlig IC
50 verdier for cisplatin i livmorhalskreft cellelinjer. De transfekterte celler med shRKIP var mindre følsom overfor cisplatin behandling i de tre forskjellige cellelinjer. C) HeLa transfekterte cellelinjene ble utsatt for økende konsentrasjoner av cisplatin ved 24 timer. Cisplatinbehandling indusert ERK-aktivering (p-ERK1 /2) og apoptose av celler som vurdert av PARP (total og cleaded spesifikke antistoffer) og caspase-9 spalting, hovedsakelig i tom vektor transfekterte celler. Alle forsøkene ble utført in triplo i minst tre ganger.
