Abstract
heparanase (HPA), en endo-HD-glucuronidase som spalter heparansulfat kjede av heparan sulfat proteoglykaner, er overuttrykt i flertallet av kreft hos mennesker. Nyere bevis tyder på at små interfererende RNA (siRNA) induserer transkripsjonen genet Slå (TGS) i humane celler. I denne studien transfeksjon av siRNA mot -9 /+ 10 bp (siH3), men ikke -174 /-155 bp (siH1) eller -134 /-115 bp (siH2) region i forhold til transkripsjon start hotellet (TSS) finne på 101 bp oppstrøms for translasjonsstartsetet, resulterte i TGS av heparanase i human prostatakreft, blærekreft, og magekreftceller i en sekvens-spesifikk måte. Metylering spesifikke PCR og bisulfite sekvensering viste ingen DNA metylering av CpG øyer innen heparanase promoter i siH3-transfekterte celler. TGS av heparanase ikke medføre endringer av epigenetisk markører histon H3 lysin 9 dimetylering (H3K9me2), histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) eller aktiv kromatin markør acetylert histon H3 (AcH3). Reguleringen av alternativ spleising var ikke involvert i siH3-mediert TGS. I stedet siH3 forstyrret transkripsjonsinitiering via reduksjon av bindingen av både RNA-polymerase II og transkripsjonsfaktor II B (TFIIB), men ikke binding av transkripsjonsfaktorene Sp1 eller tidlig vekstrespons 1, på heparanase-promoteren. Videre argonaute en og argonaute 2 tilrettelagt redusert binding av RNA polymerase II og TFIIB på heparanase promoter, og var nødvendig i siH3-indusert TGS av heparanase. Stabil transfeksjon av kort hårnål RNA konstruere målretting heparanase TSS (-9 /+ 10 bp) seg til kreftceller, resulterte i redusert spredning, invasjon, metastase og angiogenese av kreftceller
in vitro Hotell og i atymiske mus modeller. Disse resultatene antyder at små RNA som målretter TSS kan indusere TGS av heparanase via interferens med transkripsjonen initiering, og i betydelig grad undertrykke tumorvekst, invasjon, metastase og angiogenese av kreftceller
relasjon:. Jiang G, L Zheng, Pu J, Mei H, Zhao J, Huang K, et al. (2012) Små RNA målretting transkripsjonsstartSideFrem heparanase lyddemping gjennom Interferens med transkripsjon Initiation i humane kreftceller. PLoS ONE 7 (2): e31379. doi: 10,1371 /journal.pone.0031379
Redaktør: Sebastien Pfeffer, fransk National Center for Scientific Research – Institut de biologie moléculaire et cellulaire, Frankrike
mottatt: May 23, 2011; Godkjent: 06.01.2012; Publisert: 20 februar 2012
Copyright: © 2012 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 30200284, nr 30600278, nr 30772359, nr 30972980, nr 81071997, nr 81072073), Program for New Century gode talenter i University (NCET-06-0641) , Scientific Research Foundation for den returnerte Overseas Chinese Scholars (2008-889), og grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (2010JC025). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
heparanase er en endo-hD-glukuronidase som har evnen til å spalte den heparansulfat-kjeden til heparinsulfat-proteoglykaner [1], og letter invasjon og metastase av tumorceller ved forverrede basalmembranen (BM) og ekstracellulære matrise barrierer [2]. Heparanase bidrar også til angiogenese ved å frigjøre og aktivere ulike heparansulfat-bindende vekstfaktorer [3], [4]. Videre er høy ekspresjon av heparanase hyppig observert i et økende antall av primære humane tumorer, slik som prostatakreft, blærekreft og magekreft, og den heparanase-tilrettelagt invasjon og metastase indusere dårlige resultater hos kreftpasienter [5] – [8] . Disse studiene tyder på at heparanase kan serveres som en molekylær mål for kreftbehandling.
stanse av genuttrykk ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA) representerer en potensiell strategi for terapeutisk produktutvikling [9]. I tillegg til å posttranskripsjonelt genet Slå i en rekke organismer, kan siRNA samvirke med DNA-metyltransferase 3A (DNMT3A) og direkte transkripsjonen genet Slå (TGS) i humane celler [10]. Promotormålrettet sirnas indusere CpG øya metylering av ubiquitin-genet [11], human immunsviktvirus type 1 lang terminal gjentagelse [12], Ras krets domene familie 1A [13], og interleukin-2 [14] i humane celler. I tillegg eksogene sirnas utløse TGS i humane celler gjennom heterochromatin dannelse på målet arrangøren, som involverer rekruttering av kromatin modifiserende enzymer til å resultere i dimetylering av histon H3 på lysin 9, trimethylation av histon H3 på lysin 27, og histon deacetylering [10], [11], [12]. Videre sirnas målretting intronic eller exonic sekvenser i nærheten av et alternativt ekson kan øke dimetylering av histon H3 lysin 9 og trimethylation av histon H3 lysin 27 ved målsetet, noe som resulterer i forskjellig spleising av dette exon [15]. Disse studiene tyder på at sirnas påvirke ikke bare transkripsjon men også skjøting prosessen med target gen, noe som tyder på en mulig tilnærming for å utvikle gen-spesifikke behandlingsformer.
transkripsjonsstartsider (TSS) er viktige brytere for å konvertere anerkjennelse av DNA genomet inn aktiv syntese av RNA kopier [16]. Vlodavsky
et al
. identifisert TSS av heparanase-genet ved nukleotidposisjon 99 bp oppstrøms for translasjonsstartsetet (ATG) av en tradisjonell hurtig amplifikasjon av cDNA-ender (RACE) analyse [17]. Ved å bruke den modifiserte RLM-RACE metode for å selektivt forsterke DNA fragment fra avkortet full-lengde mRNA, Jiang
et al
. rapporterte nøyaktig TSS på 101 bp oppstrøms for ATG [18]. Alternativt større heparanase-transkript er også blitt observert i humane immunsystem, men den nøyaktige plassering og oppstrøms promoter av dens TSS forblir stort sett ukjent [19] – [21]. I denne studien, viste vi at små RNA målretting heparanase TSS finne på 101 bp oppstrøms for oversettelse start stedet [18], inkludert siRNA og kort hårnål RNA (shRNA), indusert TGS av heparanase via forstyrre transkripsjonsstart, men ikke gjennom indusere heterochromatin formasjon eller epigenetiske forandringer, og svekket spredning, invasjon, metastase og angiogenese av ulike typer kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
.
Resultater
siRNA-indusert TGS av heparanase
for å undersøke om siRNA kan indusere TGS av heparanase, har vi designet og syntetisert tre sirnas rettet mot TSS (finne på 101 bp oppstrøms for ATG) eller mer oppstrøms regioner av heparanase promotor, -174 /-155 (siH1), -134 /-115 (siH2), og -9 /+ 10 bp (siH3) (fig. 1A og S1 fig.). SiRNA rettet mot koding regionen + 1496 /+ 1515 bp (SiH4) ble brukt som en kontroll (Fig. 1a). Cellelinjer for de fleste vanlige humane kreftformer, inkludert prostatakreft (PC-3), blærekreft (EJ) og mage kreft (SGC-7901) ble valgt som modell for denne studien. Transfeksjon av siH3 og SiH4, men ikke fra siH1, siH2 eller negativ kontroll siRNA (Sinc), svekket den heparanase uttrykk i PC-3, EJ og SGC-7901 celler (Fig. 1B). I tillegg transfeksjon av siH3, men ikke av sinc eller kryptert siRNA (siSCb), avskaffet transkripsjonelle og translasjonelle nivåer av heparanase i en doseavhengig måte (fig. 1C). Den siH3-indusert stanse av heparanase varte opp til 5 dager, og delvis gjenfunnet på dag 7 (Fig. 1 D). Transfeksjon av siM31 og siM32, to umake sirnas av siH3, ikke avskaffe heparanase uttrykk (Fig. 1E), viser at inngrepet ble utført av siH3 i en sekvens avhengig måte. Svikt i siM32 for å hemme transkripsjon også indikert at delvis komplementære til 5′-enden av mRNA var ikke tilstrekkelig for heparanase lyddemping (fig. 1E). DNA duplekser som er analog med siH3 ikke hemmer ekspresjon, noe som indikerer at gjenkjennelse må være mediert av RNA (fig. 1E). Arrangøren reporter-luciferase assay viste at transfeksjon av siH3, men ikke siScb, siM31 eller siM32, undertrykt heparanase promoter aktivitet og transkripsjon (Fig. 1 F), noe som tyder på at den reduserte heparanase uttrykk skyldtes transkripsjonen hemming av siH3. Videre er ekspresjon av ikke-nedstrøms gener av heparanase, prolifererende cell nuclear antigen (PCNA) og cyklin D1, ble ikke påvirket av transfeksjon av siH3 (fig. S2). Disse resultatene indikerte at siH3 selektivt rettet mot TSS TGS og indusert av heparanase i en sekvens-spesifikk måte i humane kreftceller.
A, ordning av sirnas målrettet mot TSS (lokalisering på 101 bp oppstrøms for translasjonsstartsetet) , oppstrøms promoter og koding regioner i heparanase, inkludert siH1 (-174 /-155 bp), siH2 (-134 /-115 bp), siH3 (-9 /+ 10 bp) og SiH4 (+ 1496 /+ 1515 bp). Automatisert nucleotide grunnleggende lokal justering søkeverktøy (BLAST) søk viste at det var ingen sekvens lik siH1, siH2, eller siH3 i transkribert sekvens av heparanase. B, 72 timer etter transfeksjon av siRNAs i PC-3, EJ og SGC-7901 celler, 100 nmol /L siH3 eller SiH4, men ikke fra siH1, siH2 eller sinc, svekket den heparanase uttrykk i kreftceller. C, 72 timer post-transfeksjon av siH3, men ikke av sinc eller siScb, resulterte i avskaffet heparanase ekspresjon av kreftceller i en doseavhengig måte. D, siH3 (100 nmol /L) indusert genet Slå av heparanase i kreftceller varte opp til 5 dager, og delvis restaurert på dag 7. E, 72 timer etter transfeksjon av 100 nmol /L DNA tomannsboliger analog til siH3, siM31 eller siM32 (to umake sirnas av siH3), ikke avskaffe heparanase uttrykk i kreftceller. F, dual-luciferase reporter analysen viste at 72 timer etter transfeksjon av siH3, men ikke av siScb, siM31 eller siM32, undertrykt heparanase promoter aktivitet og transkripsjon i kreftceller. Symbolene (# og A) viser en betydelig nedgang fra utransfekterte kontroll (uekte) og en betydelig økning fra pGL3 /Basic, henholdsvis.
siRNA-indusert hemming av transkripsjonsstart heparanase
Siden TGS er forbundet med epigenetiske forandringer av promotor, slik som DNA-metylering, histon metylering, og histon deacetylering [10], [11], [12], vi først analysert epigenetisk status av oppstrøms regioner av heparanase-promoteren. CPG Øyene var unmethylated i utransfekterte PC-3, EJ og SGC-7901 celler (mock) og i de transfektert med sinc (data ikke vist). Transfeksjon av siH1, siH2 eller siH3, ikke indusere metylering av CpG øyene heparanase promoter i kreftceller (Fig. 2A og 2B fig.). Uttrykket og DNA binding av histon H3 lysin 9 dimetylering (H3K9me2) og histon H3 lysin 27 trimethylation (H3K27me3) på heparanase promoter, to undertrykkende epigenetiske merker involvert i TGS [10], endret ikke på transfeksjon av siH2, siH3, SiH4 eller siScb (fig. S3 og 2C fig.). Dessuten, bindingen av acetylert histon H3 (AcH3), en markør for transkripsjonelt aktive kromatin [22], var upåvirket ved transfeksjon med disse sirnas (Fig. 2C). I mellomtiden var det ingen PCR-produkter for «no-antistoff» kontroll i kromatin immunutfelling (chip) assay (fig. 2C). Bindingen av H3K9me2 og H3K27me3 var anriket på promotoren av transkripsjonelt taushet genene p16 og retinsyre-reseptor-beta 2 (RARβ2) [23], sammenlignet med den på heparanase promoter i PC-3-celler (fig. 2D), og bindingen av AcH3 på heparanase arrangøren betydelig økt etter pan histone deacetylases (HDAC) hemmer trichostatin A (TSA) behandling (fig. 2E), bekrefter tilstrekkelige chip analysebetingelser. Det kan dessuten behandling av kreftceller med DNMT inhibitoren 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-CDR) eller TSA ikke påvirke heparanase stanse, noe som indikerer at DNMTs og HDACs var usannsynlig å være involvert i denne prosess (fig. 2F). Videre ChIP analysen viste ingen endringer i binding av transkripsjonsfaktorer tidlig vekstrespons 1 (EGR1) og SP1 på heparanase promoter regionen rundt siH3 målrettede stedet, utelukker deres potensielle roller i siH3-indusert TGS av heparanase (Fig. 2G). Imidlertid reduserte bindingen av RNA-polymerase II (RNA-Pol II) på heparanase promoter ble notert i siH3-transfekterte celler, men ikke i siH2-, siH4- eller siScb-transfekterte celler (Fig. 2 H). Videre er binding av transkripsjonsfaktor II B (TFIIB) som dirigerer RNA-Pol II til kjernen promoteren, ble også redusert i siH3-transfekterte celler (Fig. 2 H). Chip data på RNA Pol II eller TFIIB binding ble bekreftet av sanntids kvantitativ PCR (qPCR) med primere som strekker seg over TSS (fig. 2 H). Redusert RNA-Pol II eller TFIIB binding ble observert opptil 7 dager etter transfeksjon (fig. 2I). I tillegg gjorde den relative inkludering til utelukkelse forholdet mellom første ekson av heparanase, som var et alternativ ekson nær siH3-målrettede området, ikke endres etter transfeksjon av siH2, siH3, SiH4 eller siScb i kreftceller (Fig. 2J ), noe som tyder på at reguleringen av alternativ spleising ikke var involvert i siH3-mediert TGS. Disse resultatene viste at transkripsjon initiering av heparanase ble forstyrret av den siH3 målretting TSS.
A og B, bisulfitt sekvensering og MSP avslørte at transfeksjon av sirnas (100 nmol /L), siH1, siH2 og siH3, ikke gjorde indusere metylering av CpG øyene heparanase arrangøren i kreftceller. C, 72 timer post-transfeksjon, brikke med distinkte primersettene indikerte at det ikke var noen PCR-produkter for «no-antistoff» (No Ab) kontroll, og bindingen av H3K9me2, H3K27me3 og AcH3 på heparanase-promoteren ble ikke endret etter transfeksjon av siH2, siH3, SiH4 eller siScb i kreftceller. D, bindingen av H3K9me2 og H3K27me3 var anriket på promotoren av p16 og RARβ2 sammenlignet med den på heparanase-promoteren i PC-3-celler, respektivt. E, behandling av siH3- eller siScb-transfekterte kreftceller med TSA (200 nmol /L), resulterte i en betydelig økning i bindingen av AcH3 på heparanase-promoteren, når sammenlignet med de som ble behandlet med DMSO oppløsningsmiddel kontroll. F, kreftceller ble transfektert med sirnas og behandlet med 5-Aza-CDR (5 umol /L) eller TSA (200 nmol /L), som resulterer i ingen endringer i siH3-indusert heparanase demping. G, 72 timer post-transfeksjon, spon analyse indikerte at bindingen av Sp1 og EGR1 på heparanase-promoteren, ikke forandret etter transfeksjon av siH2, siH3, SiH4 eller siScb i kreftceller. antydet H, chip analysen med forskjellige primersett redusert binding av RNA-Pol II og TFIIB på heparanase promoter i siH3-transfekterte kreftceller, men ikke i siH2- eller SiH4-transfekterte celler. I, indikerte analyse at ChIP redusert RNA-Pol II eller TFIIB binding ble sett på reproduserbar måte og opp til 7 dager etter transfeksjon av siH3 i kreftceller. J, QRT-PCR deteksjon viste at den relative inkludering-til-utelukkelse forholdet mellom den første ekson av heparanase ikke forandret etter transfeksjon av siH2, siH3, SiH4 eller siScb i kreftceller. Symbolet (#) viser en betydelig nedgang fra utransfekterte kontroll (mock) eller siScb. Symbolet (▴) viser en betydelig økning fra bindingen på heparanase promoter. Symbolet (Δ) viser en betydelig økning fra DMSO kontroll.
Involvering av Ago1 og Ago2 i siH3-indusert transcriptional hemming av heparanase
Siden tidligere studier indikerte involvering av RNA interferens (RNAi) maskiner i TGS, vi videre utforsket påvirkning av argonaute 1 (Ago1) og argonaute 2 (Ago2), to integrerte komponenter av RNAi vei [24], [25], på siH3-indusert TGS av heparanase. Som vist på fig. 3A og fig. 3B, banket ned av Ago1 eller Ago2 undertrykte siH3-indusert TGS av heparanase. Videre transfeksjon av siH3, men ikke fra siScb økte sammenslutning av Ago1 og Ago2 på heparanase arrangøren, som ble henholdsvis avskaffet ved å slå ned på Ago1 og Ago2 (Fig. 3C og 3D fig.). I tillegg Ago1 eller Ago2 stanse økt binding av RNA Pol II og TFIIB på heparanase promoter, mens transfeksjon av sinc ikke hadde noen effekt (Fig. 3E). Nuclear kjøre-on assay ytterligere demonstrert at oppstrømstranskriberte mRNA (inneholdende Exon 1) presentert på et lavt nivå i forhold til total heparanase mRNA, og transfeksjon av siH3 attenuert den begynnende transkripsjon av total heparanase mRNA, men ikke mRNA initieres fra oppstrøms alternative TSS , som også ble gjenopprettet ved å slå ned fra Ago1 eller Ago2, noe som indikerer at den reduserte heparanase ekspresjonen var grunnet hemming av transkripsjonen initieres fra nedstrøms TSS (fig. 3F). Disse resultatene indikerte at Ago1 og Ago2 var nødvendige for siH3-indusert transcriptional inhibering av heparanase i humane kreftceller.
A og B, slå ned av Ago1 eller Ago2 gjenopprettet den siH3-indusert TGS av heparanase i kreftceller, henholdsvis. C og D, ChIP analysen viste at 72 timer etter transfeksjon av siH3, men ikke fra siScb, foreningen av Ago1 og Ago2 på heparanase arrangøren økt i kreftceller, som ble avskaffet ved å slå ned på henholdsvis Ago1 og Ago2,. E Chip analysen indikerte at stanse av Ago1 eller Ago2 restaurert bindingen av RNA Pol II og TFIIB på heparanase promoter i kreftceller. F, kjerneforsinkelses analyse indikerte at oppstrømstranskriberte mRNA (inneholdende Exon 1) presentert på et lavt nivå i forhold til total heparanase mRNA, og den begynnende transkripsjon av total heparanase mRNA, men ikke mRNA initieres fra oppstrøms alternative TSS, redusert etter transfeksjon av siH3 til kreftceller for 72 timer, som ble restaurert ved å slå ned på Ago1 eller Ago2. Symbolene (# og A) viser en betydelig nedgang, og en betydelig økning fra siScb hhv. Symbolet (*) viser en betydelig nedgang fra sinc.
RNAi maskiner samhandlet indirekte med transkripsjon preinitiation kompleks i siH3-indusert TGS av heparanase
Siden siste bevis viser et intrikat samspill mellom maskineriet RNAi og RNA Pol II i heterochromatic stanse i
Drosophila product: [26], hypotese vi at Ago1 eller Ago2 kan direkte kontakt med RNA Pol II eller TFIIB å delta i siH3-indusert TGS av heparanase. I samsvar med tidligere studier [27], [28], co-immunpresipitasjonsanalyse indikerte at RNA Pol II samhandlet med TFIIB i dyrkede celler. Transfeksjon av siH3 ikke dempe samspillet mellom RNA Pol II og TFIIB (fig. 4A). Imidlertid anti-RNA-Pol II eller anti-TFIIB antistoffer ikke ko-immunoprecipite Ago1 eller Ago2 fra siH3-transfekterte celler (Fig. 4A), noe som ble ytterligere bevist ved ko-immunoutfellingsanalyse med pull-down by anti-Ago1 eller anti -Ago2 antistoffer (fig. 4B). disse resultatene kombinere med ovennevnte bevis på at Ago1 og Ago2 påvirket bindingen av RNA Pol II og TFIIB på heparanase promoter, indikerte at RNAi maskiner og transkripsjon preinitiation kompleks ble forbundet, men ikke direkte interaktiv, i siH3-indusert TGS av heparanase i humane kreftceller .
A, co-immunpresipitasjonsanalyse med pull-down av anti-RNA Pol II eller anti-TFIIB antistoffer indikerte at siH3 eller siScb ikke dempe samspillet mellom RNA Pol II og TFIIB i kreftceller. I tillegg gjorde Ago1 eller Ago2 ikke direkte kontakt med enten RNA Pol II eller TFIIB i siScb- og siH3-transfekterte kreftceller. B, co-immunpresipitasjonsanalyse med pull-down av anti-Ago1 eller anti-Ago2 antistoffer ikke co-immunoprecipite RNA Pol II eller TFIIB fra siScb- og siH3-transfekterte kreftceller.
heparanase TSS -targeted shRNA dempes spredning, vedheft, invasjon og angiogenese av kreft celler
in vitro
Fordi nyere studier indikerer muligheten for shRNA-mediert TGS i pattedyrceller [29], [30] , for ytterligere å undersøke effekten av heparanase TSS-målrettede siRNA på kreftceller, ble shRNA konstruksjonene etablert og transfektert inn i PC-3, EJ og SGC-7901 celler (fig. S4A). Stabil transfeksjon av shP3 (-9 /+ 10 bp) og shCd (+ 1496 /+ 1515 bp), men ikke fra shP2 (-134 /-115 bp) eller egge shRNA (shScb), resulterte i svekkede mRNA og proteinnivåer heparanase (fig. S4B, og S4C fig.) og redusert
in vitro
proliferasjon av kreftceller (fig. 5A fig. 5B og fig. 5C). Transwell-analyse viste at cellene transfektert med shP3 eller shCd, men ikke med shP2 eller shScb, presenteres en svekket invasjon kapasitet (fig. 5D og 5E fig.). I tillegg har kreftceller transfektert med shP3 eller shCd, men ikke med shP2 eller shScb, oppviste markert redusert evne i adhesjon til det forhåndspåførte Matrigel (fig. 5F). Røret dannelsen av endoteliale celler, ble undertrykt ved behandling med mediet preconditioned ved stabil transfeksjon av kreftceller med shP3 eller shCd, men ikke med shScb (fig. 5G og 5H fig.). Videre ble utgivelsen av grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF) fra kreftceller dempes etter stabil transfeksjon av shP3 eller shCd, men ikke fra shScb (Fig. 5I). Resultatene indikerte at stabil transfeksjon av heparanase TSS-målrettet shRNA bemerkelsesverdig redusert spredning, vedheft, invasjon og angiogenese av kreft celler
in vitro
.
A, MTT kolorimetri indikerte at stabil transfeksjon av shP3 eller shCd, men ikke fra shP2 eller shScb, svekket spredning av PC-3, EJ og SGC-7901 celler. B og C, kolonidannelse analysen indikerte at transfeksjon av shP3 og shCd, men ikke fra shP2 eller shScb, svekket
in vitro
spredning av PC-3, EJ og SGC-7901 celler. D og E, transwell analyse indikerte at PC-3, EJ og SGC-7901 celler transfektert med shP3 eller shCd, men ikke med shP2 eller shScb, besatt en svekket invasjon kapasitet. F, i adhesjonsassayet, PC-3, EJ og SGC-7901-celler transfektert med shP3 eller shCd, men ikke med shP2 eller shScb, oppviste markert redusert evne i adhesjon til forbelagt matrigel. G og H, endotelceller ble behandlet med mediet preconditioned ved stabil transfeksjon av PC-3, EJ og SGC-7901-celler med shP3 eller shCd, men ikke med shScb, noe som resulterer i undertrykt rør dannelse på matrigel. Jeg, frigjøring av bFGF fra PC-3, ble EJ og SGC-7901 celler svekket etter transfeksjon av shP3 eller shCd, men ikke fra shScb. Symbolet (#) viser en betydelig nedgang fra tomme vektor transfekterte celler (mock).
heparanase TSS-målrettet shRNA hemmet vekst, metastase og angiogenese av kreftceller
in vivo
Vi neste undersøkte effekten av shP3 mot tumorvekst, metastase og angiogenese
in vivo
. Stabil transfeksjon av shP3 eller shCd inn i PC-3-celler, resulterte i redusert vekst og vekten av subkutane xenografttumorer i atymiske nakne mus (Fig. 6A). I tillegg er stabil transfeksjon av shP3 eller shCd resulterte i reduksjon i CD31-positive mikrokar og bety fartøyet tettheten i tumorer (fig. 6B). Videre er ekspresjon av heparanase nedstrømsgener innenfor tumorer, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og matrise metallopeptidase 9 (MMP-9), ble også redusert med stabil transfeksjon av shP3 eller shCd (Fig. 6C og fig. 6D).
A, sprøyte injeksjon av PC-3 celler i atymiske nakne mus etablert subkutane xenografttumorer. En måned senere ble mus (n = 6) fra hver gruppe ble avlivet. Stabil transfeksjon av kreftceller med shP3 eller shCd resulterte i redusert tumor-størrelse, og den gjennomsnittlige tumorvekt dannet fra shP3- eller shCd-transfekterte celler ble signifikant redusert. B, CD31 uttrykk og gjennomsnittlig fartøyet tettheten i svulster redusert etter stabil transfeksjon av shP3 eller shCd. C, HE og immunhistokjemisk farging viste at stabil transfeksjon av shP3 eller shCd resulterte i redusert uttrykk for heparanase, VEGF og MMP-9 inn i kreftsvulster. D, uttrykket av heparanase nedstrøms gener innenfor svulster, VEGF og MMP-9, ble redusert med stabil transfeksjon av shP3 eller shCd. E, 3 x 10
6 PC-3-celler ble injisert inn i bukhulen til to måneder gamle hann nakne mus (n = 5 i hver gruppe). Nude mus som fikk injeksjon av kreft celler stabilt transfektert med shCd eller shP3 viste relativt færre knuter. F, PC-3-celler ble injisert inn i halevenen til atymiske nakne mus (0,4 x 10
6 celler pr mus, n = 5 i hver gruppe). Kreftceller stabilt transfektert med shP3 eller shCd etablert betydelig færre metastatiske kolonier. Symbolet (#) viser en betydelig nedgang fra tom vektor (mock).
I peritoneal metastase studier, hårløse mus som fikk injeksjon av PC-3 celler stabilt transfektert med shCd eller shP3 viste relativt færre knuter (22 ± 9 og 17 ± 7, henholdsvis) enn tom vektor (mock) gruppen (106 ± 31) (fig. 6E). I de eksperimentelle metastase studier, PC-3 celler stabilt transfektert med shP3 eller shCd etablert statistisk færre lungemetastatiske kolonier enn mock gruppe (Fig. 6F). Kombinert med de tilsvarende funn i EJ og SGC-7901-celler (data ikke vist), disse resultatene antydet at heparanase TSS-målrettede shRNA kunne hemme vekst, metastase og angiogenese av kreftceller
in vivo
.
Diskusjoner
TGS veien ble først rapportert i tobakksplanter, som staten metylering og uttrykket av gener ble påvist å være påvirket av RNA [31]. Nylig, RNA har blitt rapportert å formidle TGS i pattedyrceller via DNA CpG metylering og heterochromatin formasjon [10], [11], [12], [32]. De silent-statlige epigenetiske modifikasjoner føre til tap av transkripsjonsfaktorer rekruttering [12], [33]. I mellomtiden, sirnas rettet mot interne genområder av humanfibronektin en kan hemme intern forlengelse og senere påvirke spleisesete utvalg [15]. Den menneskelige heparanase-promoteren er besto av en minimal grunnleggende region som spenner over 300-700 bp proksimalt til den TSS finne på 101 bp oppstrøms for ATG, som er kjennetegnet ved høyt GC-innhold, observerte /ventet CpG-forhold, og bindingssetene for flere grupper av transkripsjonsfaktorer [18]. Transkripsjonsfaktor EGR1 er relatert til den induserbare transkripsjons av heparanase-genet i T-celler [34], mens den allestedsnærværende transkripsjonsfaktor SP1 er forbundet med sin basal transkripsjon [18]. I denne studien har vi utviklet tre siRNAs rettet mot heparanase promoter regionen inneholder CpG loci og SP1 bindingssetet, mens siH3 målrettede region (-9 /+ 10 bp rundt heparanase TSS finne på 101 bp oppstrøms ATG) var også ved siden av bindingssete for EGR1. Men våre bevis viste at transfeksjon av disse siRNAs indusert verken metylering av CpG heller heterochromatin formasjon på heparanase promoter. ChIP analyse lenger utelukkes endringene i bindingen av Sp1 og EGR1 på heparanase-promotoren, og spleisevariant analyse utelukket forskjellig spleising av de nærmest ekson.
Faktisk sirnas målretting promotorområdene ikke klarer å indusere TGS i viss eksempel [35]. Nyere studier viser at antigenaktivitet RNA (agRNAs) rettet mot TSS kan blokkere gentranskripsjon av menneskelig progesteron reseptor (PR) [36], [37], androgen reseptor (AR) [37], og huntingtin [37], noe som tyder på at TSS i kromosomal DNA gir forutsigbare mål for å hemme genekspresjon med RNA. I denne studien, viste vi at siRNA og shRNA rettet mot TSS indusert TGS av heparanase i humane kreftceller, mens de små RNA rettet mot oppstrøms promoter regionen inneholder CpG loci ikke undertrykke uttrykk for heparanase, noe som tyder på at loci de målrettede makt ikke være utsatt for TGS. Videre har vi også bemerket lignende effektiviteten av siH3 og koding region målrettet SiH4 i dempe uttrykk og funksjon heparanase. Disse resultatene indikerer at verdifull rolle i TSS-målrettede små RNA i reguleringen av genekspresjon av TGS, spesielt når RNA er målrettet mot oppstrøms promotorområde mislykkes i å frembringe en markert effekt.
En mekanisme i stedet for genetisk og epigenetisk regulering understreker TGS av heparanase indusert av TSS-målrettet siRNA i humane kreftceller. Likeledes er det ikke metylering observeres rundt TSS av AR og PR [34], og agRNAs-mediert TGS forekommer uavhengig av om promoteren inneholder et TATA-boks [36], [37]. Tidligere studier viser at TFIIB binder kjerne promoter DNA og dirigerer RNA Pol II til TSS, fremme montering av funksjonelle transkripsjon preinitiation kompleks (PIC) [38]. I denne studien viste vi at sirnas rettet mot den TSS finne på 101 bp oppstrøms for ATG forstyrret transkripsjon initiering av heparanase, og samtidig tap av TFIIB og RNA-Pol II antydet at sirnas redusert sammenstillingen av PIC formasjonen på denne TSS. Det har blitt antydet at når pattedyr-RNA-polymerase binder seg til DNA ved TSS, danner en åpen kompleks som baserer -9-2 er tilgjengelig for kjemiske midler som modifiserer enkelttrådet DNA, noe som tyder på at TSS kan være tilgjengelig for hybridisering [36 ], [37]. Nyere studier har indikert tilstedeværelse av ikke-kodende promoter-assosiert RNA (pRNA) og konsekvensene av deres målretting av sirnas i humane celler [39], [40]. Low-kopi pRNAs er anerkjent av antisense tråd av siRNA og fungere som en anerkjennelse motiv for å lede epigenetiske Slå complexes til tilsvarende målrettet arrangører å megle TGS i humane celler [39]. I tillegg er dannelsen av siRNA-pRNA kompleks med bidrag av Ago2 ansvarlig for den reduserte montering av funksjonell PIC og blokkering av transkripsjon initiering i c-myc-promoteren [40]. Så om vi pRNA finnes for å lede siH3-indusert TGS av heparanase warrants vår videre etterforskning. Fordi en åpen kompleks dannes under transkripsjonen av hvert gen, er det mulig å utforme direkte agRNAs til hvilket som helst gen som har en TSS karakterisert v [41]. Derfor tror vi at TGS strategi via TSS-målrettet siRNA kan også brukes til andre gener, som garanterer vår videre etterforskning.
Ago protein komplekser som inneholder enkelt-strandet små RNA kalles modne RNA-induced Slå kompleks (RISC) [42]. Siden proteiner er positivt ladet overflate som er godt egnet for binding siRNA og samkjøre den med komplementære target-sekvensen, noe som tyder på at siden proteiner kan spille en sentral rolle i dannelsen av RNA-induced oppstart av TGS kompleks som initierer heterochromatin formasjon [37] .
