Abstract
Aberrant cytosin 5-metylering ligger til grunn for mange deregulerte elementer av kreft. Blant sammenkoblede ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), søkte vi å profilere DNA 5-metyl-cytosin funksjoner som kan ligger til grunn genom-wide deregulering. I en av de mer tette avhørene av methylome samplet vi 1,2 millioner CpG nettsider 20-4 NSCLC tumor (T) non-tumor (NT) parene ved hjelp av en metylering følsom begrensning enzym basert HELP-microarray analyse. Vi fant 225,350 ulikt denaturert (DM) områder i adenokarsinomer
versus
tilstøtende ikke-svulstvev som varierer i frekvens over genomisk rommet, spesielt merkbar i genet organer (GB; p 2.2E-16). Videre, når DM ble koblet til differensial transkriptomet (DE) i de samme prøvene, 37056 differensial loci i adenokarsinom dukket opp. Omtrent 90% av DM-DE relasjoner var ikke-kanoniske; for eksempel promoter DM forbundet med DE i samme retning. Av de kanoniske endringene nevnt, promoter (PR) DM loci med gjensidige endringer i uttrykk i adenokarsinomer inkludert
HBEGF
,
AGER
,
PTPRM
,
DPT
,
CST1
,
MELK;
DM GB loci med samstemmige endringer i uttrykk inkludert
FOXM1
,
FERMT1
,
SLC7A5
, og
FAP
gener. IPA-analyser viste adenokarsinom-promoter DMxDE overlegg identifisert kjente lungekreft noder [
TP53
,
Akt
] samt mindre kjente noder [
HBEGF
,
NQO1
,
GRK5
,
VWF
,
HPGD
,
CDH5
,
CTNNAL1
,
PTPN13
,
DACH1
,
SMAD6
,
LAMA3
,
AR
]. De unike funnene fra denne studien omfatter oppdagelsen av en rekke kandidat de unike funnene fra denne studien omfatter oppdagelsen av mange kandidat metylering områder i både PR og GB regioner som ikke tidligere er identifisert i NSCLC, og mange ikke-kanoniske relasjoner til genuttrykk. Disse DNA metylering funksjonene kan potensielt bli utviklet som risiko eller diagnostiske biomarkører, eller som kandidat mål for nyere metylering locus målrettede forebyggende eller terapeutisk middel
Citation. Mullapudi N, Ye B, Suzuki M, Fazzari M, Han W, Shi MK, et al. (2015) Genome Wide Methylome Endringer i lungekreft. PLoS ONE 10 (12): e0143826. doi: 10,1371 /journal.pone.0143826
Redaktør: Osman El-Maarri, Universitetet i Bonn, Institut of Experimental Hematologi og transfusjonsmedisin, TYSKLAND
mottatt: 18 august 2015; Godkjent: 10 november 2015; Publisert: 18.12.2015
Copyright: © 2015 Mullapudi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Relevante data kan finnes på GEO depot-GSE315520, GSE 31552.
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av NCI 1RC1 CA145422-01 (SDS); 1K24-CA139054-01 (SDS); Stony-Wold Herbert Foundation (NM); 1R01-CA180126-01 (SDS Co-PI); P30 CA013330 (Albert Einstein Cancer Center kjerne stipend)
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er ansvarlig for den høyeste antall kreftdødsfall i USA [1]. Kreft er preget av genom-wide endringer i CpG metylering, inkludert en generalisert genom-wide hypometylering (tap av metylering) inkludert i onkogener og gjensidig hypermethylation på bestemte loci (økt metylering), inkludert tumor suppressor genet arrangører [2,3]. Nyere studier har vist at den funksjonelle konsekvens av 5-metylering av cytosin er avhengig av det genomiske kontekst og spesifikk sekvens der det skjer [4,5]. Metylering av CG rester innenfor CG øyene (CGI) i gen-arrangører er assosiert med genet demping. Imidlertid er metylering av CGI innenfor genet legemer funnet å være forbundet med vev-spesifikk ekspresjon og genaktivering hos kreft genomer [6-8].
Paneler av kjente kandidat tumorsuppressorgener er kontrollert i klinisk lungekreft prøver å karakterisere promoter-metylering [9,10], hvilket ga konsise metylering signaturer [11], så vel som for å skille de forskjellige histologiske subtyper [12]. Metylering forandringer oppstå tidlig under utviklingen av lungekreft [13], og således kan brukes som prediktive markører for å oppdage mulige maligniteter [14,15]. Således kan identifisering av diskriminerende metylering merker bli videre utviklet til diagnostiske analyser for å hjelpe til risikovurdering og diagnostikk.
DNA metylering kan måles ved målrettet metoder som bisulfitt-sekvensering (tBGS) [16], methylation- spesifikk PCR (MSP) [17], og massespektrometri-baserte metoder (Epityper
®) [18]. Hver plattform analyser locus-spesifikk metylering ved høyere oppløsning, hvor et definert panel av gener kan vurderes for metylering status for et utvalgt antall CpG rester i dem. Men disse metodene er avhengige av forkunnskaper i spesifikke epigenomic loci å designe analysen.
Blant oppdagelse metoder for å oppdage metylering mønstre på et genom-wide skala, er en tilnærming til å ansette metylering-sensitive og resistente isoschizmer restriksjonsenzymer ( HJELP, RLM, andre). Andre tilnærminger inkluderer kromatin immunopresipitering med denaturert DNA-bindende antistoffer (MBD, MeDIP, andre), eller bisulfitt sekvensering av en redusert del av genomet (RRBGS, andre) [19]. Hver av disse metodene har sine egne fordommer og av nødvendigheten av skalaen, samples kun en liten del av det menneskelige methylome. Hele genomet bisulfitt sekvensering [20] er utformet for å tett søke i hele methylome ved enkelt base-spesifikk oppløsning. Men nå denne metoden er for kostbart og analytisk krevende å utføre på store utvalgsstørrelser.
Nyere studier har vurdert genome-wide metylering i lungekreft for å oppdage svulsten bestemt metylering signaturer av kreft genomer [13,21,22] . Selamat
et al product: [23] brukte Illumina infinium HumanMethylation27k plattform for å karakterisere genom-wide metylering av ~ 27.000 CpG sider i 59 matchet T /NT lunge adenokarsinom prøver, og kombinert det å transkriptom arrays. Omfattende molekylær profilering av 230 pasienter (adenokarsinom) og 178 pasienter (plateepitelkarsinom) ved TCGA [24,25] gjort bruk av en utvidet versjon av den samme plattformen, HM450k, som undersøker mer enn 480.000 CpG steder, på tvers av CpG øyer og strender i det menneskelige genom.
Vi antok at en objektiv genom-wide svulst vs ikke-tumor søk etter differensielt denaturert loci vil føre til identifisering av nye og kjente loci deregulert i lungekreft. I tillegg undersøker de samme prøvene for differensial genuttrykk ville tillate identifisering av høyere effekt DM loci, i kraft av mulige innvirkning på uttrykk. For å teste disse hypotesene, vi brukte HJELP analyse [26] for å bestemme den CpG metylering av 24 parene av tumor (T) og tilstøtende ikke-tumor (NT) humane prøver. Denne analysen spør 1.200.000 CCGG motiv definerte fragmenter over genomet av restriksjonsenzymer
Hpa
II (metylering bokstaver) og
Msp
I (metylering resistente) for å isolere ulikt denaturert fragmenter av genomet. Disse fragmentene er så adapter-ligert og forsterket og merket, etter som de er co-hybridisert til en microarray med høy tetthet. Metylering oppdages ved endene av enzym-genererte fragmenter (CCGG nettsteder) og målt som andel av
MSP
I-genererte fragmenter til
Hpa
II-genererte fragmenter. Resonnement som metylering-deregulert gener kan være mer tydelig hvis beslektet /plassen genuttrykk er endret, vi videre undersøkt sammenhengen av forskjellig metylert (DM) områder med forskjellig uttrykt (DE) gener, ved hjelp av mRNA uttrykk data fra samme paret T og NT kirurgisk reseksjon prøver.
Resultater
Genome-wide undersøkelse av forskjellig metylert loci i lungetumor versus ikke-tumor
Blant 24 NSCLC lunge reseksjon donorer (S1 Table), som bruker HELP-microarray-analysen vi identifisert 452,754 HpaII fragmenter signifikant forskjellig metylert (DM; p 0,05, FDR-justerte) i tumor mot tilstøtende ikke-tumor (tabell 1). Av disse DM områdene, ble 57% funnet i koding regioner (som omfatter 38% av disse CCGG nettstedene representert på tabellen). (Fig 1) En annen 39% av disse ble funnet i intergeniske regioner (48% av disse nettstedene representert i matrisen) og var for det meste hypomethylated i svulster. Omtrent 7% ble funnet i promotorområdene (26% av disse nettstedene på array). Gene arrangører (PR) og gen organer (GB) viste både hyper- og hypo-metylering. (Tabell 1). Arrangøren hypometylering skredet hypermethylation i antall (tabell 1). Basert på en permutasjon test utført ved hjelp av stikkprøver innenfor avdelinger (PR /GB /IG) fant vi at DM loci er betydelig overrepresentert i genet kroppsregioner (p 2.2E-16).
452754 loci signifikant forskjellig metylert (DM) mellom T og NT basert på en FDR 0,05. Flertallet av DM loci er hypomethylated i T vs NT.
(A) Omtrent 91% av de 1,2 millioner loci representert i HELP microarray er lokalisert i genet kroppen (GB) og intergeniske (IG) regioner, med et lite mindretall (9%) av loci ligger innenfor arrangører (PR). (B) Statistisk signifikans (Y-aksen) vs. delta (X-aksen) (magnitude) av DM. Delta (X-aksen) indikerer forskjellen i metyleringen mellom tumor (T) mot ikke-tumor (NT) ved et gitt locus. Loci hypermethylated i T i forhold til NT ha deltaet 0. P-verdi (Y-aksen) er beregnet basert på Benjamini Hochberg justert FDR. På FDR p 0,05, 433505 loci på tvers av alle genomiske avdelinger er funnet å være forskjellig metylert i T vs NT. Røde prikker angir statistisk signifikant DM loci.
Størrelsen differensial metylering (delta) varieres ved rommet og retning av endring. Moderate /store grader av DM hypermethylation i PR og GB (delta 1; PR = 74%, GB = 63%) var mer vanlig enn små grader (1 Delta 0,5; PR = 24%, GB = 33%) av hypermethylation endringer i disse kamrene (fig 2). Størrelsen av moderate /store hypermethylation forandringer var forskjellig fra hypometylering endringer, hvor den moderat /stor fordeling av genomiske region var PR = 12%, N = 14%, IG = 17%. Innenfor tumorpromotere, CG øyene (CGI) og CG bredden (CGS) ble oftere hypermethylated enn hypomethylated (Fig 2B). Samlet fordeling av DM loci varieres ved å PR genomisk plassering (CGI, CGS, andre) blant alle NSCLC histologier (ChiSquare p = 2.2E-16) og blant adenokarsinom-only (ChiSquare1.9E-4). Det var betydelig DM utenfor CGI og CGS.
(A) Alle NSCLC histologier DM ble klassifisert som ubetydelig, liten eller moderat basert på absoluttverdien. (1 abs deltaet 2 er Moderat /Large; 1 abs deltaet 0,5 er liten; 0,5 abs deltaet 0 er ubetydelig). DM loci med FDR p 0,05 basert på paret T-test ble vurdert for denne analysen. Majoriteten av hypermethylation i tumorer er observert å være av moderat /stor størrelsesorden i promotorer og gen-organer, mens i den intergeniske regionene, små endringene er mest hyppig. Flertallet av hypometylering er observert å være av liten størrelsesorden i alle de tre delene. En betydelig fraksjon av hypometylering endringer er av ubetydelig størrelse, men statistisk signifikant. (B) Retning på DM og fordelingen innen arrangører kategorisert basert på plassering i CG-øyene og CG-kysten. Innenfor kategorien av DM promoter loci, er hypermethylation hyppigere i svulster i forhold til hypometylering for disse loci innenfor CG-øyene og CG-kysten. Totalt DM forskjeller varierer fra PR genomisk plassering (CGI, CGS, annet); alle NSCLC histologier var ChiSquare p = 2.2E-16; adenokarsinom-bare histologi ChiSquare p = 1.9E-4.
Individuelle kreftgener identifisert ved differensial metylering
Den øverste 25 differensielt denaturert loci innen promoter regioner og gen institusjoner er oppført (S2 Bord). I korte trekk, for alle histologier ble observert sammen DM i mange arrangører (S2A Table) [hypermethylation i
C7orf54
,
DARS
,
SPTAN1
,
DOM3Z
,
PCNX
,
CTNNAL1
, andre; hypometylering i
NQO1
,
SIRP1B
,
UNC5CL
,
NFIA
,
CST1
, andre] og i genet organer [hypermethylation i
NOL10
,
ARHGEF12
,
UST
,
RGS3
,
MBNL2
, andre; hypometylering
FBXL7
,
RyR2
,
NTRK3
,
ADAMTS12
,
PARK2
, andre]. For adenokarsinom spesifikt, DM ble observert i arrangører [hypermethylated
RASL12; SPTAN1
,
mir-26a
, hypomethylated
NQO1
,
SIRPB1
,
NF1A
] og genet organer [hypermethylated
AKAP13
,
ANK familie
,
PRKCE
,
ROS1
; hypomethylated
FAM171A1
,
PARK2
,
BCAS3
,
RHOJ
] og mange andre.
Varme kart over topp 50 mest differentially metylert loci innenfor undergruppe av adenokarsinomer (figur 3A og 3B)
(A) Arrangøren regioner; og (B) Gene kroppen regioner. Flere gener viser differensial metylering (DM) på mer enn ett locus og vises flere ganger i heatmap. . Blå = Non Tumor, Rød = Tumor
De 50 mest DM loci (FDR justert p 0,05, rangert etter omfanget av delta), gjenspeiler separasjon av T og NT i de fleste av de sammenkoblede prøvene , bortsett fra i prøvene 603T, 653T og 542T. Flere loci innenfor det samme gen viser DM, noe som resulterer i tilbakefall av genet navn i varmen kartene. De multiple loci i et gen (f.eks PR:
TMEM88
,
GIMAP6
,
RUSC2
, andre; GB:
CDH13
,
CACNA203
,
NOMO3
, andre) hadde en tendens til å være overensstemmende, om enn ufullkomment, med retning av DM (hyper vs hypometylering).
CpG metylering validering
metylering tilstander av tre representative DM CCGG loci valgt på grunnlag av DM magnitude (en i formidler av DARS og to i formidler av RGS3) ble kvantitativt bestemmes av høyoppløselig Sequenom MassARRAY
® metoden, og sammenlignet med resultatene fra HELP microarray-baserte analysen ved hjelp av Spearman rangordnet sammenheng programvare [27]. Korrelasjonen (rho) var 0,72 (p = 0,0006), noe som indikerer at resultatene av HELP analysen signifikant korrelert med referanse resultatene av Sequenom MassARRAY
® referanse assay (S1 figur)
Identifikasjon av diskriminerende klassifikasjonsapparater
Den gjennomsnittlige nøyaktighet for topp 100 eller topp 25 DM loci tumor versus ikke-tumorklassifiseringsmodeller, alle NSCLC histologier i samlet, var henholdsvis 87% og 90%. På adenokarsinom data undergruppe, gjennomsnittlig nøyaktighet for topp 100 og topp 25 DM loci var 80% og 79% respectivelyIn Generelt klassifiserings modeller har en tendens til å være mer konkret enn sensitive. (S7 tabell). To loci (
LOXL4 Hotell og
LINC00841
) ble gjentatte ganger valgt innenfor topp DM loci i klassifiseringsprosessen.
Metylering x Expression Merge
DNA loci ble integrert med tidligere genererte mRNA transkriptomet microarray data blant de 21 T-NT par der begge datasett var tilgjengelig. (S2 fig). Denne analysen ga n = 433 666 DM loci i alle avdelinger (tabell 2). For eksempel, samle alle histologier identifiserte vi n = 75 loci som viste hypermethylation i PR regioner og samtidig nedregulering av mRNA uttrykk av microarray. Det var n = 219 loci innenfor GB regioner som viste samtidig hypermethylation og oppregulering av uttrykk.
Alle histologier (21 par).
Arrangøren spesifikke subcompartment distribusjon (CGI CGS, annet) av kanoniske DMxGE relasjoner (
e
g
arrangøren hypermethylation:.. gen nedregulering)
versus
ikke-kanoniske relasjoner (
e
g
arrangøren hypermethylation:.. gen oppregulering) vises i figur 4. Totalt innen PR regioner, CGI mønstre tendens til å følge kanoniske DM: GE mønstre (første stolpe av hver av de lengst til venstre to søylediagram trillinger innenfor et panel) noe sjeldnere enn de andre promotor avdelinger. Bemerkelsesverdige er at ikke-kanonisk DM: DE forhold var omtrent lik i frekvensen til kanoniske relasjoner, som bestemt ved denne analyse. For alle 21 parene (alle NSCLC histologier, fig 4A), generelle fordelingen av DMxDE forskjeller varierer fra PR genomisk plassering (CGI, CGS, annet), ChiSquare p = 3.32E-4. På samme måte innenfor det sett av adenokarsinomer (fig 4B), har samlet DMxDE forskjellene varierer fra PR genomisk plassering (CGI, CGS, annet), ChiSquare p = 1.10E-7. Flertallet av PR DM loci er forbundet med hypermethylation når DM loci er innenfor CG øyer. Denne effekten er kjent blant de adenokarsinomer undersettet også, der det DM hypermethylated loci i CG øyene er for det meste assosiert med nedregulering av genet.
Analyse av DM geometriske steder innenfor promoter-regioner og deres overlapping med differensiell genekspresjon. (Venstre panel A) Alle 21 par (alle NSCLC histologier), generelle forskjeller gjør variere etter PR genomisk plassering (CGI, CGS, annet), ChiSquare p = 3.32E-4.
(høyre panel B)
Innenfor sett adenokarsinomer generelle forskjeller gjør variere etter PR genomisk plassering (CGI, CGS, annet), ChiSquare p = 1.10E-7. Flertallet av DM promoter loci er forbundet med hypermethylation når DM loci er innenfor CG øyer. Denne effekt er mer uttalt blant adenokarsinomer, hvor DM loci i CG øyene er for det meste assosiert med nedregulering av genet. NØKKEL: «M» = metylering, «E» = uttrykk. Oppover pil viser økning og pilen nedover indikerer nedgang.
Antall loci hentet fra vises i 3D uttrykk-metylering overlegg koordinater i panel A (S3 fig). Genomiske koordinater ble også vist av circos tomter; et eksempel på kromosom 3 er vist i panel B (S3 fig). Disse panelene betegne den generelle mønstre av genet kroppen og formidler metylering og tilhørende genuttrykk endringer. Overlappingen mellom DM og GE for GB var hyppigere enn PR (delvis på grunn av relativ overrepresentasjon av GB
versus
PR regioner på HELP microarray (tabell 1). Den kanoniske mønster oftest sett i GB var hypometylering og nedregulering (S3 figur).
Eksempler på kvantitative forholdet mellom DM til GE i arrangører og gen kropper vises i utvalgte spredningsplott (S4 fig). de fleste gener som var kvalitativt kanoniske for den DM⬄GE forholdet viste en tvetydig kvantitative forhold (vises ikke.), de genene som er valgt for visning trenger eksemplifisere en kanonisk forhold
den øverste åtte forskjellig uttrykt (dE) gener assosiert med arrangøren DM loci (S3 Tabell:
FILIP
,
HBEF
,
TMEM88
,
VWR
,
CASP12
,
NQO1
,
CST
,
XAGE1D
) gjennomgikk en kvantitativ verifikasjon av microarray-baserte GE uttrykk endringer, ved hjelp QRT-PCR skalert til
GAPDH
indre husmor. S5 figur viser disse resultatene, viser generelt samsvar med retningen av GE mellom de to plattformene (microarray og QRT-PCR;
r
2
= 0,9367815, p 0,0007), men med en komprimert dynamisk område av microarray data, som er vanlig i litteraturen [28].
Individuelle gener avslørt av DM x GE Merge
Alle NSCLC histologier product:: overlegg av DM x DE overlegg (S3 tabell) ga ytterligere genomisk DM loci med kanoniske uttrykk mønstre (
e
g
PR hypermethylation:.. mRNA nedregulert og PR hypometylering: mRNA oppregulert, GB hypermethylated: mRNA oppregulert og hypomethylated: mRNA nedregulert) [PR n = 113; GB n = 3972] (tabell 2). Kjente hypermethylated PR loci med gjensidig redusert uttrykk GE var
HBEGF
,
DPT
,
AGER
,
SPARCL1
,
PTPRM
,
ARHGEF6
,
TMEM88
,
SEMA6A
. De PR hypomethylated loci med økt GE var
NQO1
,
CST1
,
TNS4
,
FUT2
,
MELK
,
FAM83A
,
MMP9
,
og SLCO1B3
. De GB loci med konkordant metylering og uttrykk inkludert: hypermethylated /økt GE:
FERMT1
,
SLC7A5
,
FAP
,
KRT15
,
ETV4
,
TFAP2a TPX2
,
FOXM1
; hypomethylated /redusert GE:
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8
,
ABCB1
,
SEMA5A
,
GPM6A
.
Innenfor kategorien av adenokarsinomer alene, fusjonerte vi resultatene av DM med dE, og oppdaget flere loci med differensial metylering i arrangører eller genet organer og beslektede genuttrykk endringer. Hypermethylated PR loci med GE downregulation inkluderer
RPL23AP32
,
CTNNAL1
,
HBEGF
,
TMEM88 og CASP12
. Loci viser PR hypometylering og oppregulering inkluderer
NQO1
,
CST1
,
XAGE1D
,
IGKC og AIM2
. GB loci viser hypermethylation og oppregulering inkluderer
FAP
,
NLN
,
TPX2
,
og KIF26B Hotell og andre. GB loci viser hypometylering og downregulation inkluderer
AGBL1
,
RHOJ
,
LDB2
,
GHR
,
ITGA8 * Hotell og andre ( S3 Table)
Metylering-Expression forhold i CG-øyene og CG-shores
Vi spurte sammenhengen mellom DM og dE for DM loci ligger innenfor promotor CG øyene (CGI) og CG bredden ( CGS, definert som 2 kb oppstrøms av en CG øy, fig 4, S5 Table). Vi har observert bare en liten prosentandel av loci (3-11%) som oppviste DM i CGI eller CGS forbundet med den forventede endring i gen-ekspresjon av det nærmeste genet. Disse inkluderer gener som
TMEM88
,
S1P1R
,
FZD4
,
GIPC2
,
DNAJB4
,
ADAMTS1
(hypermethylated i CGI og CGS og nedregulert) og BUB1 (hypomethylated og oppregulert).
Pathway analyserer
En oppsummering av IPA analyser tilbys i S6 tabell. All DM loci (Bejamini-Hochberg adj p 0,05), tilsvarende åtte kategorier (basert på genomisk rommet, histologi og med /uten genekspresjon merge) ble separat analysert ved hjelp av IPA, for å identifisere genet nettverk beriket innenfor sett av DM loci. I alle de åtte tilfellene «kreft» var den øverste sykdom forbundet med inngangsdatasettet, selv om de bærende gener var annerledes. Kanoniske trasé fra Oppfinnsomhet kunnskapsbase som ble funnet å være beriket innenfor gensettene med adj. p 0,05 er rapportert. Tre av nettverkene (Alle NSCLC histologier, DM bare, GB, adenokarsinomer DM bare, GB, og adenokarsinomer DM + DE begge deler, PR) ble blant de åtte kategorier funnet å ha en statistisk signifikant sammenheng med en kanonisk vei med adj. p 0,05, og er videre beskrevet nedenfor.
IPA Kreft-relatert Networks skildringer.
Nettverk analyse av de betydelige nettverk ordnet i S6 tabell oppsummeres i S6 fig. Skjermene viser at flere gener som spiller en viktig rolle i kreftrelaterte veier er forskjellig metylert i T i forhold til NT i ulike kategorier, og fremhever noen gener som ikke er kjent for å gjøre det. For eksempel samle alle NSCLC histologier viser S6a Fig kreftrelaterte nettverk avledet fra IPA av alle DM loci (adj p. 0,05) innen GB på tvers av alle de 24 T /NT par. Gener som
EZH2
,
CDH1
,
CDKN2A Hotell og
DNMT3A /3B
finnes på sentrale punkter i dette nettverket.
EZH2 plakater (hypomethylated) er et medlem av Polycomb-gruppe familie og spiller en viktig rolle i celleproliferasjon, vekst, cellesyklusprogresjon, transcriptional undertrykkelse og invasjon.
DNMT3A
/3B (hypermethylated) koder for et DNA-metyl-transferase som er påstått å utføre de novo metylering og har en viktig rolle i transkripsjonen repressional signalering.
CDH1 plakater (hypermethylated) koder E-cadherin, en kjent overflate adhesjonsmolekyl nedregulert i kreft. CDKN2A (hypermethylated) er en inhibitor av CDK4 kinase og er en signifikant tumor suppressor-gen, kjent for å være mutert eller slettes i forskjellige kreftformer.
ZEB1
, GB hypomethylated, er også fremhevet som et sentralt knutepunkt i denne kreftrelaterte nettverk. Det koder en sink finger transkripsjonsfaktor (også kjent som
TCF8
) som er kjent for å være en induktor av epitelial-mesenchymale overgang i NSCLC [29].
Innenfor kategorien av adenokarsinomer spesifikt ( 16 par S6B Fig viser kreft-relaterte genet nettverk identifisert fra den mest betydningsfulle (justert p 0,05). DM loci (innen GB) Et sentralt knutepunkt for dette nettverket er genet
AR plakater (androgen reseptor) som er funnet å være GB hypomethylated i tumorer. AR er en transkripsjonsfaktor aktiveres av steroidhormon androgen. det spiller en viktig rolle i celle-vekst, proliferasjon, celle-død og invasjon. på grunn av en tilsynelatende sentrale i denne spesielle DM nettverk, vi ytterligere utforsket DM metylering mønster av AR som gjelder kjønn. Vi observerte at de to aktuelle DM fragmenter (innenfor GB) var kjent for hypermethylation i GB hos menn i forhold til kvinner i NT vev unikt (t-test FDR, fragment 1 = 0,041, fragment 2 = 3.76E-5). Supervillin
(SVIL)
, er også et gen på et knutepunkt for dette nettverket (S6B figur), og er GB hypomethylated i svulster.
SVIL
er en perifer membranprotein som regulerer cellemotilitet, spre og er kjent for å forbedre celle overlevelse ved å samhandle med tumor suppressor genet p53 og nedstrøms mål [30].
Adenocarcinoma spesifikke promoter DM x DE overlegg gjorde markere kjent (
SMAD6
,
TP53
,
CTNNB1
,
NQO1)
samt ukjente lungekreft IPA noder ( S6C fig). Kreften relaterte nettverk avledet fra denne analysen besto av en enkelt hypomethylated genet promoter (NQO1) ved node av en klynge i samspill med
TP53
,
HSP70 og NPM1
. Flere hypermethylated genet arrangører inkludert
HBEGF
,
SMAD6
,
PTPN13
,
CDH5 Hotell og
SFTPC
ble funnet i periferien av nettverket. Dette nettverk består av flere gener som ikke er identifisert som DM fra vårt studium, men danner en del av nettverket i kraft av sine tidligere publiserte interaksjoner med andre DM loci, som vist på åpne /hvite figurer.
Nåværende vs tidligere røykere
prøve~~POS=TRUNC settet~~POS=HEADCOMP av 24 fag bestod av 11 tidligere røykere og 10 nåværende røykere. Vi undersøkte tilstedeværelsen av forskjellig metylert loci basert på røykestatus. På justerte p 0,05 nivå, ble ingen loci funnet å være DM mellom nåværende og tidligere røykere
Diskusjoner
Vi rapporterer et methylome sammenligning undersøkelse for et sett med NSCLC svulster
mot
sammenkoblede røyk svulstvev i kirurgisk reseksjon prøver for å identifisere genom metylering signaturer i lungekreft, og filtrere dem for de relevante for genuttrykk endringer fra de samme prøvene. Målet er å informere diagnostisk biomarkør arbeidet allerede i gang i laboratoriet, [31] og målet identifikasjon for fremtidig utvikling i diagnostikk og forebyggende /terapeutiske studier [32,33].
Bruke HELP analysen, kunne vi spør 1,2 millioner diskontinuerlig CCGG loci (~ 1% av methylome) på en måte som er representativt for alle tre genomisk (PR, GB, IG) regioner. Ved hjelp av en FDR justert p 0,05 som cutoff, 452754 loci på tvers av alle regioner og histologier viser statistisk signifikant differensial metylering i svulster. Fordelingen av disse DM nettstedene var særlig mer konsentrert i genet organer enn i promoter regioner, selv vurderer regional representasjon variasjoner på detektoren microarray, som støttes av en permutasjon test.
Studier hittil har vanligvis fokusert på arrangøren metylering i lungekreft, utnytte promoter-fokusert tilpassede mikromatriser [10,15,34] eller perle arrays [23,35] og dermed ofte spørring bare for forhåndsvalgte genomiske regioner og loci. Dette er en av de få studiene hittil at mer agnostically undersøker genome-wide metylering tvers av alle regioner av lungekreft genomet i flere prøver. Regionene i genomet analysert ved hjelp analysen er avhengig av forekomsten av CCGG områder innen genomet, og ikke ved noen tidligere funksjonell eller et segment-messig klassifisering av loci. HJELP analysen er mindre arrangøren partisk (GB og IG regioner er representert 3,5x ganger promoter regioner), og dermed åpner for oppdagelsen av nye hendelser assosiert med metylering i andre genomiske regioner i tumorprøver [36]. Men savner HELP analysen ikke-CCGG innebygde CpG nettsider samt de CCGGs som skulle definere en størrelsesområde utenfor målet fragment størrelsen rekkevidde (200-2000bp). HJELP (i motsetning infinium HM arrays) er ikke fokusert på å avdekke sammenhengende CPGs av forhåndsdefinerte genet arrangører. Mens størrelsen av de samlede DM forskjellene mellom tumorer og nontumor lungevev ved et gitt locus tendens til å være liten (vanligvis mindre enn 2-ganger), betryggende er at validering av forhåndsvalgte DM loci gunstig sammenlignet med det kvantitative henvisning teknikk ( Sequenom MassARRAY
®).
Ved å undersøke gense lister over topp DM loci oppdaget blant andre publiserte genomstudier i lungekreft til de som er rapportert i vår studie fant vi at, som forventet, grad av overlapping mellom våre studier og andre er beskjeden, muligens en indikasjon på forskjeller i HELP plattformen (som oppdager fragmenter avgrenset av private CpG områder, men ikke ekstra fragment interne CpG nettsteder), og målet regionene spørres (som i HELP er likt fordelt mellom PR, GB, og IG regioner av genomet. i tillegg ser vi at omfanget av overlapping over studier som brukte samme microarray-baserte metylering (for eksempel infinium array) ([23,24,35] var heller ikke stor. Dette kan stamme fra ulike fag og prøve heterogenitet faktorer, og kriterier som brukes til å rangere DM loci. For eksempel Sandoval
et al product: [35] identifisert en
HOXA7
regionen blant de beste mest variable CpG arrangører, mens det samme locus ikke er rapportert i TCGA studie [24] som benytter samme plattform. På den annen side, begge disse studiene rapporterer differensial metylering av
HOXA9
locus. Begge disse loci kommer ikke i listene over toppen DM loci fra vår studie
Totalt funn fra denne studien omfatter at:. Det er mange individuelle DM loci /gener, særlig i genet organer (S2 og S3 Bord ); det er mange ikke-kanoniske DMxDE forhold; og genelists og nettverksrelasjoner inkluderer både tidligere anerkjent og utallige tidligere ikke loci. Som tidligere anerkjent, er genomet samlet mer hypomethylated, men viser også arrangøren hypermethylation i kreft versus sammenkoblede røyk kreft vev, som var sant fra tidlig på genomstudier av differensial metylering i lungekreft [2,21-23]. Men mange funksjoner tydelig forskjellig;
