Abstract
Selv om uttrykket av cellesignalering proteiner blir brukt som prognostisk og prediktiv biomarkør, variasjon av protein nivåer innenfor svulster er ikke godt undersøkt. Vi vurderte intratumoral heterogenitet av protein uttrykk innenfor primær eggstokkreft. Full-lengde proteiner ble hentet fra 88 formalinfiksert og parafin-embedded prøver av 13 primær høyverdig serøs ovariekarsinomer med 5-9 prøver hver vev. I tillegg, 14 prøver av normal egglederen epitel tjente som referanse. Kvantitative reversfaseprotein matriser ble brukt til å analysere ekspresjonen av 36 cellesignaliseringsproteiner, inkludert HER2, EGFR, PI3K /akt, og angiogene trasé samt 15 aktivert (fosforylerte) proteiner. Vi har funnet betydelig intratumoral heterogenitet i ekspresjon av proteiner med en gjennomsnittlig variasjonskoeffisient fra 25% (fra 17-53%). Omfanget av intratumoral heterogenitet skilte mellom proteiner (p 0,005). Interessant, var det ingen signifikante forskjeller i omfanget av heterogenitet mellom fosforylerte og ikke-fosforylerte proteiner. Til sammenligning, vurdert vi variasjonen i proteinnivåer blant svulster fra forskjellige pasienter, som avslørte en liknende gjennomsnittlig variasjonskoeffisient fra 21% (fra 12-48%). Basert på hierarkisk clustering, prøver fra samme pasient gruppert tettere forhold til prøver fra ulike pasienter. Men et klart skille mellom tumor mot normalt vev ved clustering ble bare oppnås når bety uttrykk verdier av alle individuelle prøver per svulst ble analysert. Selv om differensial ekspresjon av noen proteiner ble detektert uavhengig av prøvetakingsmetoden som brukes, de fleste av proteinene bare vist differensial uttrykk når middelverdiene for ekspresjon av flere prøver pr tumor ble analysert. Våre data tyder på at vurderingen av etablerte og nye cellesignalering proteiner som diagnostiske eller prognostiske markører kan kreve prøvetaking av serøse eggstokkreft på flere forskjellige steder for å unngå prøvetaking skjevhet
Citation. Mittermeyer G, Malinowsky K, Beese C, Höfler H, Schmalfeldt B, Becker KF, et al. (2013) Variasjon i Cell Signaling Protein Expression kan innføre Sampling Bias i Primær ovarialcancer. PLoS ONE 8 (10): e77825. doi: 10,1371 /journal.pone.0077825
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, India
mottatt: 04.07.2013; Godkjent: 05.09.2013; Publisert: 28 oktober 2013
Copyright: © 2013 Mittermeyer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av interne tilskudd fra Avdeling for patologi og Institutt for obstetrikk og gynekologi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den nest vanligste gynekologisk kreft og den med høyest dødelighet i den vestlige verden [1]. Under tidlige stadier av sykdommen er hovedsakelig asymptomatisk og dermed de fleste pasientene er diagnostisert med fremskredne stadier som resulterer i en dårlig fem års total overlevelse rate på mindre enn 40% [2]. Standard behandling for pasienter med eggstokkreft kirurgi etterfulgt av platina og taxan baserte kombinasjonskjemoterapi. Selv om de fleste pasienter viser innledende respons på kjemoterapi, senere utvikler flertall motstand og 50-75% av pasientene som får tilbakefall i løpet av fem år [3]. Vurderingen av cellesignalering proteiner gir mulighet til å identifisere potensielle nye narkotika mål samt å forutsi respons på behandling og hjelp i individualisert behandling beslutninger [4]. For å kunne fungere som en biomarkør for en optimal målrettet terapi nærmer identifikasjon og kvantitativ analyse av målet strukturer og /eller respektive nedstrøms signal kaskader er av høy relevans. Imidlertid potensiell intratumoral heterogenitet av cellesignalisering protein ekspresjon kan innføre en sampling forspenning, og har ikke blitt grundig undersøkt i eggstokkreft.
Et antall cellesignalisering proteiner har blitt tidligere identifisert som mulige terapeutiske mål, eller som potensiell prognostisk eller prediktive biomarkører. Disse inkluderer VEGF, VEGFR, PDGFR, EGFR eller HER2, PI3K, Akt, mTOR og andre [5], [6], [7], [8]. Tilsvarende viktig er aktivering av cellesignalveier som reflekteres av de fosforylerte formene av target proteiner eller komponenter for sine respektive nedstrøms signalveier [9], [10], [11].
Det overordnede målet med denne studien var å vurdere graden av heterogenitet av cellesignale protein uttrykk i serøs eggstokkreft. Vi analyserte 36 cellesignalering proteiner, inkludert 15 fosforylerte proteiner som representerer spredning og angiogenese relatert veier. Vi i tillegg undersøkt den potensielle effekten av heterogenitet på påvisning av differensial protein uttrykk mellom tumor og normalt vev eller mellom tumor undergrupper.
Til sammenligning vi vurdert den fysiologiske variant av protein uttrykk i normal serøs epitelvev mellom ulike pasienter. Egglederen epitel fra friske individer og fra uninvolved kontralaterale rør av kreftpasienter ble brukt som en referanse vev, siden tidligere studier har vist at serøs kreft er molekylært mest knyttet til tubal epitel. Egglederen epitelceller har blitt foreslått som cellene opprinnelsesland, for i det minste noen høyverdig serøs karsinom [12], [13].
For analyse av et stort antall prøver og target proteiner som er benyttet i denne studien, er konvensjonell immunoblot metodikk ikke egnet som en trenger mer enn 3500 Western blot baner til å gjennomføre en enkel analyse av alle prøver og antistoffer. Den reversfase-proteinet array (RPPA) tillater den samtidige analyse av multiple prøver for ekspresjon av flere proteiner under de samme eksperimentelle betingelser [14], [15]. Analyse av proteiner i duplikater og seriefortynninger muliggjør reproduserbar kvantitativ påvisning av protein ekspresjon. RPPA har vidt demonstrert sin heten for analyse av kryo-konservert kliniske prøver [16], [17], [18]. Flere nylig, vår gruppe og andre fastslått at RPPA teknologien gir også en pålitelig analyse av formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) vevsprøver [19], [20], [21], [22] og er et tilstrekkelig verktøy for å adresse protein heterogenitet innenfor slike prøver [23].
Materialer og metoder
vevsprøver
En totalt 88 FFPE-prøver fra 13 pasienter med primær høyverdig serøs eggstokkreft ble studert. 14 prøver av normal eggleder epitel, inkludert 10 friske personer og 4 uninvolved kontralaterale rør fra kreftpasienter ble brukt som referanse. En skjematisk av pasientmateriale og valg av prøvene er vist i figur 1.
I alle 13 tilfeller, 5-9 vevsprøver var tilgjengelig. I ti pasienter med bilaterale svulster, ble prøver hentet fra begge eggstokkene
H . E farget deler av alle parafininnebygd prøver ble anmeldt av en erfaren patolog (SA) for å karakterisere histologisk subtype, prosentandel av levedyktig invasive svulster celler, fibrose eller nekrose, prosentandel av infiltrerende betennelsesceller, og hyppigheten av mitoser.
Protein Extraction
Alle vevsprøver fra samme pasient ble behandlet samtidig. Protein ekstraksjon ble utført som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt ble FFPE- vevssnitt deparaffinized, og proteinene ble hentet ved hjelp EXB Plus buffer og varmebehandling (Qiagen, Hilden, Tyskland). 2-7 deler av 10 mm tykkelse ble behandlet i 100-170 pl av ekstraksjon buffer. The Bradford proteinanalyse (BioRad, Hercules, USA) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner for å bestemme proteinkonsentrasjonen. Proteinkonsentrasjonene ble justert til 2 mg /ml med EXB Plus buffer. En Western blot sondering for β-actin ble utført fra tilfeldig utvalgte lysatene (n = 11) for å demonstrere vellykket protein utvinning og egnethet for omvendt fase protein rekke analyse. Alle proteinlysatene produsert en klar β-actin bånd på Western blot.
Analyse av Protein Expression ved reversfase Protein Arrays (RPPA)
uttrykk nivåer av 36 proteiner inkludert 15 fosforylerte proteiner var bestemmes av RPPA. Antistoffer og eksperimentelle forhold er oppsummert i tabell S1. RPPAs ble generert ved hjelp av SpotBot® Extreme Microarray Spotter i henhold til produsentens instruksjoner (Arrayit, Sunnyvale, CA 94089, USA). For hver lysat og fortynning (justert (2 mg /ml), 01:02, 01:04, 01:08, 01:16, utvinning buffer), ble 2 replikater påført på et nitrocellulose belagt glass-slide (Grace Bio-Labs, bend, USA), som produserte 12 datapunkter per sample.
immundeteksjon ble utført tilsvarende Western blot-analyse, og som tidligere beskrevet [25]. For estimering av totale proteinmengder, ble arrays farget parallelt med Sypro Ruby Protein Blot Stain (Molecular Probes, Eugene, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Ytterligere detaljer om RPPA metodikk, validering, og teknisk reproduserbarhet har tidligere blitt beskrevet [23], [25]. Alle antistoffene som anvendes i denne studien ble validert for spesifisitet ved Western blot-analyse.
Statistical Analysis
intratumoral heterogeniteten, så vel som omfanget av proteinekspresjon blant forskjellige pasienter (inter-pasient variasjon), og variasjonen av protein uttrykk mellom eggleder epitel fra friske individer ble vurdert ved hjelp av
variasjonskoeffisient product: (CV). CV, definert som forholdet av standardavviket til middelverdien multiplisert med 100, gir et relativt mål for variasjon uavhengig av de absolutte verdier, og derfor gjør det mulig å sammenligne variasjon av proteiner med forskjellige absolutte ekspresjonsnivåer.
intratumoral heterogenitet ble vurdert separat for hvert protein ved å beregne CV av alle primærtumorprøver fra samme pasient. Som oppsummering statistikk, rot-middel-kvadrat (RMS) gjennomsnitt av CV [26] ble beregnet til å omfatte alle 13 pasienter for å vurdere den samlede intratumoral heterogenitet for et gitt protein.
Variasjonen blant svulster fra forskjellige pasienter ble vurdert for hvert enkelt protein ved å beregne CV middeluttrykksverdier blant de ulike pasienter. Resultatene vises grafisk ved hjelp av boks-plott som viser median uttrykk verdi, 25
th og 75
th kvartiler, og værhår (1,5 ganger interkvartilt område) for hver pasient.
Friedman test var brukes til å sammenligne CV for ulike proteiner og Mann Whitney test ble brukt for å sammenligne protein uttrykk mellom ubeslektede utvalgsgrupper på en tosidig 5% signifikansnivå. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av IBM Statistics (IBM Corporation, versjon 19.0).
For å sammenligne protein uttrykk mellom normale og tumorvev og visualisere variasjon mellom prøver fra enkeltpasienter, ikke-overvåket hierarkisk clustering ble utført ved hjelp Cluster og Treeview programvare [27]. Etter logg transformasjon og sentre til medianverdier, ble gjennomsnittlig hierarkisk clustering utført for beregning av Spearman rank korrelasjon.
Resultater
Morfologisk Vurdering av vevsprøver
Alle prøvene viste en tumor celletall 70% og 10% betennelsesceller. Det var ingen signifikante forskjeller i epitelial tumor celleinnhold og tumor stroma eller betennelses celleinfiltrater mellom prøver fra samme pasient. I tillegg ble det ingen regionale forskjeller identifisert i mitotisk aktivitet mellom prøver fra samme pasient.
intratumorale heterogenitet av protein nivåer
Alle 36 proteiner som analyseres i denne studien viste betydelig intratumoral heterogenitet med en gjennomsnittlig CV 25% (range 17-53%) (tabell 1 og tabell S2). Omfanget av intratumoral heterogenitet skilte seg blant de 36 proteiner analysert (p = 0,005), med p4EBP1, pp44 /42 MAPK og VEGF som viser størst variasjon, og EGFR, JNK /SAPK og p38MPK viser minst variasjon innenfor den enkelte svulster. Det var ingen signifikant forskjell i graden av heterogenitet intratumoral mellom fosforylert (gjennomsnitt CV 28%) og ikke-fosforylert (gjennomsnitt CV 23%) proteiner (p = 0,252). Den intratumoral heterogenitet av alle proteiner er oppsummert i Tabell S2. Figur 2 viser intratumoral heterogenitet for eksemplarisk proteiner VEGF, VEGFR p1068EGFR og EGFR.
Boksplott viser median (linje i boksen), 25. og 75-persentiler, og værhår viser 1,5 ganger interkvartile området.
variasjon av protein nivåer blant pasienter
variasjonen av protein uttrykk mellom ulike pasienter var lik omfanget av intratumoral heterogenitet med en gjennomsnittlig CV på 21% (range 12- 48%). Den inter-pasient variabilitet signifikant forskjellig mellom proteiner analysert. Mens Hif1α, PDGF og PI3K demonstrert lav variasjon mellom alle pasienter som ble analysert, p4EBP1, pp44 /42 MAPK og p1068EGFR viste en svært høy inter-pasient variabilitet. Variasjon mellom forskjellige pasienter var ikke signifikant forskjellig for fosforylert (gjennomsnitt CV 25%) og ikke-fosforylert (gjennomsnitt CV 18%) proteiner (p = 0,072). Tabell S2 oppsummerer variasjonen mellom ulike pasienter for alle proteiner. Figur 2 illustrerer variasjonen blant pasienter for eksemplarisk proteiner VEGF, VEGFR, EGFR og p1068EGFR.
Inter-pasient variasjon i protein uttrykk ble også vurdert for normal serøs epitel av egglederne fra friske individer og for morfologisk normal kontralateral rør av kreftpasienter. Den inter-pasient variasjon av tubal epitel fra friske individer (gjennomsnittlig CV 27%, range 14-47%) var lik inter-pasient variasjon i kontralaterale rør fra kreftpasienter (gjennomsnittlig CV 31%, range 3-78%). Total, variasjon av normal epitel serøs mellom ulike individer var i et lignende område i forhold til variasjonen mellom svulster fra forskjellige pasienter (21%). Variasjon var ikke forskjellig mellom fosforylerte og ikke-fosforylerte proteiner i begge typer referanse vev. Resultatene er oppsummert i Tabell 1.
variasjon mellom individuelle tumorprøver vurderes av hierarkisk Clustering
For å vurdere variasjon mellom individuelle tumorprøver vi har utført ikke-overvåket hierarkisk clustering av alle 88 individuelt tatt tumorprøver fra 13 pasienter basert på ekspresjon av alle 36 proteinene analysert (figur 3). Prøver fra samme pasient gruppert tettere sammenlignet med prøver fra forskjellige pasienter. Ikke desto mindre ble prøver av fire pasienter (pasienter 3, 4, 6, 11) spredt utover alle klynger, og for de gjenværende pasienter to eller flere prøver per pasient ikke klynge med resten. Det var ingen pasienter for hvem alle prøvene gruppert sammen (figur 3).
Ulike pasienter er fargekodet som vist i figuren legende. Høy relativ uttrykk av proteiner er vist i rødt og lavt uttrykk i grønn farge. Grå områder indikerer mangler datapunkter.
Relevansen av heterogenitet for Skillet mellom tumor mot normalt vev
Clustering av tumor mot normalt vev.
Vi vurderte påvirkning av heterogenitet på molekylær klassifisering av ulike vevsprøver som kreft eller normale basert på hierarkisk clustering. Det var ingen klar atskillelse av tumorprøver versus normal serøs epitel ved bruk av alle individuelle tumorprøver per sak (data ikke vist). I kontrast, analyse av gjennomsnitts uttrykk verdier for hver svulst resulterte i meget god separasjon av normale og tumorvev (figur S1).
Differensial protein uttrykk i tumor mot normalt vev.
Vi neste vurdert forskjeller i proteinuttrykk mellom eggstokkreft og normal serøs epitel ved enten å ta tilfeldig valgt enkle prøver per sak eller mener protein expression verdier. Analysen ble gjentatt tre ganger med tre forskjellige tilfeldig valgte enkle prøver for hvert tilfelle og resultatene ble sammenlignet med dem oppnådd ved anvendelse av den midlere ekspresjonsnivåer verdier per tilfelle som referansestandard.
Seksten proteinene identifisert som differensielt uttrykt ved bety uttrykk verdier av alle prøver per svulst (AKT, Pakt, Angiopoietin 2, B-Raf, p1068EGFR, p1148EGFR, FAK, pGSK-3β, pGSK-3β, HIF-1α, JNK /SAPK, mTOR, pmTOR, p38 MAPK, pPRAS40, PRAS40, PTEN , pPDGFR, S6RP) ble ikke oppdaget når analysere tilfeldig valgt enkeltprøver per sak. Ti proteiner, nemlig PB-Raf, EGFR, HER2, 4E-BP1, pPTEN, pVEGFR, VEGF, VEGFR, pS6RP, og VHL ble identifisert som forskjellig uttrykt av alle fire tilnærminger. PI3K og pHER2 ble identifisert som forskjellig uttrykt bare i enkeltprøver. P-verdier for alle proteiner som er identifisert som uttrykkes differensielt i det minste en tilnærming er oppsummert i tabell 2.
diskusjon
Vi har funnet betydelig intratumoral heterogenitet i ekspresjonen av protein biomarkører relatert til celle signalveier i høyverdig serøs ovarialcancer. Alle 36 proteiner ble analysert ved revers fase-protein array (RPPA) viste en betydelig heterogenitet i primær eggstokkreft med en gjennomsnittlig variasjonskoeffisient (CV) på 25% (fra 17-53%) i løpet av en enkelt svulst. En lignende grad av variasjon ble funnet hos forskjellige pasienter med en gjennomsnittlig CV på 21% (fra 12-48%). Våre resultater tyder på at betydelige prøvetaking skjevhet kan innføres ved analyse av enkeltprøver av en primærtumor for vurdering av protein biomarkører. Selv om alle 36 kandidatproteiner viste betydelig intratumoral heterogenitet, det totale omfanget av heterogenitet var annerledes for spesifikke proteiner med p4EBP1, pp44 /42 MAPK og VEGF som viser størst variasjon og EGFR, JNK /SAPK og p38MPK viser minst variasjon. Det var ingen forskjell i graden av heterogenitet mellom fosforylerte og ikke-fosforylerte proteiner, noe som tyder på at aktiverte former av cellesignaleringsproteiner kan vurderes med tilsvarende pålitelighet.
En tidligere studie i brystkreft har oppdaget en tilsvarende grad av intratumoral heterogenitet i proteinekspresjon (gjennomsnitt CV 31%) [23]. I motsetning til dette, variasjonen av protein ekspresjon hos forskjellige pasienter var betydelig lavere i ovarialkreft sammenlignet med brystkreft (gjennomsnitt CV 21% vs. 51%). En mulig forklaring er en mer homogen pasientgruppe i vår studie bestående utelukkende høyverdige serøs karsinom, som deler en felles patogenetisk sti og er derfor genetisk mindre heterogen enn forskjellige typer bryst kreft [28]. brystkreft studien inkluderte ulike morfologiske og molekylære undergrupper, slik som hormonreseptor positive, HER2 positive og trippel negative brystkreft, som kan ha stått for en høyere variasjon i proteinuttrykk mellom svulster fra ulike pasienter.
tilstedeværelsen av forskjellige tumorcellekloner er en potensiell kilde for intratumoral heterogenitet i proteinekspresjon. En fersk studie viste betydelig klonal intratumoral heterogenitet for eggstokkreft basert på selvfornyelse og tumorigent differensiering av tumorceller fra en enkelt eggstokkene klar cellekreft [29]. En annen studie rapporterte klonal intratumoral heterogenitet og variasjon mellom primærsvulster og metastaser for tap av heterozygositet kromosomer VED BETJENING 17Q og 18q i avanserte serøs ovariekarsinomer [30]. Tilsvarende omfattende klonal heterogenitet ble nylig demonstrert for nyrecellekreft [31]. En omfattende analyse av tumorcelle klonalitet ville kreve integrerte data av DNA, RNA og proteinnivåer, som var utenfor rammen for denne studien. Imidlertid er mindre sannsynlig at en enkelt forklaring for de store forskjeller i ekspresjon av cellesignalisering proteiner som finnes i vårt studium. Høy grad av serøs karsinom er generelt preget av høy proliferativ og mitotisk aktivitet [28]. Selv om forskjeller i tumorvekst og celledeling kan ha til en viss grad bidratt til intratumoral heterogenitet, kan vi ikke identifisere regionale forskjeller i tumorcellevekst basert på morfologisk vurdering av mitoser. En annen mulig forklaring for intratumoral heterogenitet er den cellulære sammensetning av serøse eggstokkreft. Men vi fant ingen signifikante forskjeller i epitelial tumor celleinnhold og tumor stroma eller betennelsesceller infiltrerer mellom prøver fra samme pasient.
Tidligere studier har rapportert en lavere grad av intratumoral variant av protein uttrykk i eggstokkreft. To studier fra 1990-tallet fant lav variant av protein uttrykk mellom ulike områder av 9 primære ovariekarsinomer [32] eller mellom primære og metastaser av 12 epiteliale eggstokkreft [33] ved hjelp av to-dimensjonal elektroforese og immunhistokjemi, henholdsvis. Imidlertid er antallet av tumorer i begge studier var forholdsvis liten. En fersk serie inkludert 123 høyverdig serøs ovariekarsinomer med tilkoblede ovarietumorer og oment metastaser vurderes uttrykk for ti proteiner ved immunhistokjemi, inkludert markører for svulst subtype, mikromiljø, og celle adhesjon [34]. Forfatterne viste at mesteparten av proteinene, inklusive vanlig brukte diagnostiske markører, slik som p53, WT1, CA125, og p16 ikke viste signifikante forskjeller i ekspresjon mellom primær eggstokkreft og peritoneal eller omentfaktorene metastaser. To markører for stromal tumor respons (PDGFRB, SPARC) viste markant differensial uttrykk mellom primær eggstokk og metastatiske tumorprøver [28]. Imidlertid er en direkte sammenligning med vår studie med tidligere rapporter begrenset av mangelen på ensartet kriterier for vurdering av heterogenitet og mangel på statistiske mål for intratumoral variasjon. I tillegg har tidligere studier ofte sammenlignet primær eggstokkreft og metastatiske lesjoner mens vår studie utelukkende fokusert på variasjon innen en enkelt primær kreft. En mulig forklaring for den høyere graden av heterogenitet i intratumoral protein ekspresjon observert i denne studien kan være mer omfattende sampling av primære ovarietumorer i 5-9 forskjellige steder, så vel som høyere kvantitativ oppløsning av RPPA analyse.
For ytterligere å vurdere variasjon mellom individuelle tumorprøver vi har utført ikke-overvåket hierarkisk clustering. Selv om vi hadde observert en lignende grad av heterogenitet i en tumor og mellom svulster fra forskjellige pasienter basert på variasjonskoeffisient, prøver fra den samme pasient gruppert tettere sammenlignet med prøver fra forskjellige pasienter. Dette kan tyde på at til tross for en høy grad av heterogenitet i kvantitative protein uttrykk verdier, en rangering basert tilnærming som gruppering kan bli mindre berørt. Tilsvarende vil en omfattende analyse av proteiner i en signaleringsnettverket, som tar hensyn til relativ uttrykk og rangering av individuelle proteiner, kan bli mindre påvirket av heterogenitet.
Uttrykk av cellesignalering proteiner blir også brukt som en diagnostisk biomarkør til skille tumor fra tilknyttede normalt vev. Vi har funnet ingen signifikant forskjell i cellesignalisering proteinekspresjon mellom eggstokk-kreft og normal serøs epitel. Når imidlertid uttrykk verdier for flere prøver pr tumor ble kombinert, er en betydelig forskjell i ekspresjonen mellom kreft og normal epitel ble påvist for de fleste proteiner. Dette understreker betydningen av flere prøvetaking. En praktisk tilnærming i fremtidige studier kan være å samle flere prøver fra ulike regioner i et individ svulst før analysen.
Til sammenligning har vi også vurdert den fysiologiske variant av protein uttrykk i normal serøs tubal epitel. Av tekniske årsaker og begrenset tilgjengelighet av normale vevsprøver, kan vi ikke sammenligne ulike prøver av samme pasient. Mellom normal serøs epitel fra forskjellige pasienter vi observert en lignende variant (gjennomsnittlig CV 27-31%) sammenlignet med variasjonen mellom eggstokkreft fra forskjellige pasienter (gjennomsnittlig CV 21%).
For å utelukke skjevhet på grunn av tekniske variasjoner vi tidligere vurdert den tekniske reproduserbarhet av protein kvantifisering. Høy reproduserbarhet av proteinmålinger fra uavhengige utdrag og fra uavhengige RPPA analysene ble demonstrert [23], og derfor fant vi ingen grunn til å tro at heterogenitet i protein uttrykk påvist i denne studien skyldtes tekniske varianter.
Begrensninger studien omfatter antall saker og individuelle tumorprøver (n = 88). Vi analyserte makroskopisk heterogenitet, mens forskjeller på cellenivå ikke ble vurdert. En viktig styrke er meget homogen pasientgruppen bestående utelukkende høy grad av serøse eggstokkreft som er kjent for å dele felles patogenetiske veier, samt omfattende utvalg av de tumorer i 5-9 ulike områder. Vi analyserte ulike regioner innenfor hver primær eggstokkreft og ikke sammenligne primære og metastatiske lesjoner.
I konklusjonen, kan intratumoral heterogenitet føre til sampling bias, og pålitelig vurdering av cellesignale protein uttrykk i eggstokkreft for vurdering av prognostisk eller prediktive biomarkører bør omfatte prøvetaking av primærtumor i flere forskjellige steder.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1. Host Sammenligning av tumor mot normalt vev av ikke-overvåket hierarkisk clustering av 13 svulster og 14 prøver av normal serøs epitel, basert på gjennomsnitts protein expression verdier per svulst. Ulike pasienter er fargekodet som vist i figuren legende. Hoved klynger identifiseres av programvaren er oppkalt klynger A og B. høy relativ uttrykk av proteiner er vist i rødt og lavt uttrykk i grønn farge. Grå områder indikerer manglende datapunkter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077825.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
Antistoffer og betingelser brukes for protein deteksjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077825.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
intratumoral heterogenitet og variasjon mellom pasienter for uttrykket av 36 proteiner vurderes ved omvendt fase protein arrays (CV, variasjonskoeffisient)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0077825.s003 plakater (DOC)
takk
forfatterne ønsker å takke München Biobank Alliansen av M4 klyngen og Claudia Wolff for nyttige diskusjoner og kommentarer og Simone Keller for å gi JNK /SAPK antistoff.
