Abstract
Bakgrunn
ovarialcancer (EOC) er morfologisk heterogent vesen klassifisert som serøs , endometrioid, klarcellet eller mucinous. Molekylær genetisk analyse har foreslått en rolle for tumorsuppressorgener plassert på kromosom 3p i serøs EOC patogenesen. Vårt mål var å evaluere uttrykk for
HYAL1
, som ligger på kromosom 3p21.3, i disse EOC subtyper, og for å undersøke dens korrelasjon med uttrykk for steroidhormonreseptorer.
Metodikk /Principal funn
Vi bestemt mRNA uttrykk for
HYAL1
, østrogen reseptor (ER) -α, ERβ og progesteron reseptor (PR) i EOC tumorprøver og cellelinjer ved hjelp av kvantitativ RT-PCR. Vi undersøkte også uttrykket av disse genene i en offentlig tilgjengelig microarray datasett. Hyal-en enzymaktiviteten ble målt i EOC cellelinjer og i plasmaprøver fra pasienter. Vi fant ut at
HYAL1
mRNA uttrykk ble forhøyet i klarcellet og mucinkjertler prøver EOC vev, men ikke i serøse og endometrioid prøver, normale eggstokker eller godartede svulster. Lignende resultater ble oppnådd ved to forskjellige teknikker, og med vevsprøve kullene fra to uavhengige institusjoner. Concordantly,
HYAL1
mRNA nivåer og enzymatisk aktivitet ble høyere bare i EOC cellelinjer avledet fra klarcellet og mucinkjertler subtyper. Vi viste også at
HYAL1
mRNA ble omvendt korrelert til at av ERα spesielt i klart celle og mucinkjertler EOCs. I tillegg ektopisk uttrykk for ERα i en klar celle EOC cellelinje (ER- og PR-negativ) induserte 50% reduksjon av
HYAL1
mRNA uttrykk, som støtter en rolle ERα i
HYAL1
genet regulering. Betydelig, Hyal-en aktivitet var også høy i plasma hos pasienter med disse EOC undergrupper.
Konklusjon /Betydning
Dette er den første rapporten som viser høye Hyal-1-nivå i EOC og demonstrere
HYAL1
gen undertrykkelse av ERα. Våre resultater identifisere Hyaluronidase-en som et potensielt mål /biomarkør for klare celle og mucinkjertler EOCs og spesielt i svulster med lave ERα nivåer
Citation. Yoffou PH, Edjekouane L, Meunier L, Tremblay A, Provencher DM, Mes-Masson AM, et al. (2011) Undertype Spesifikk Forhøyet Uttrykk for Hyaluronidase-en (Hyal-1) i ovarialcancer. PLoS ONE seks (6): e20705. doi: 10,1371 /journal.pone.0020705
Redaktør: Nai Sum Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 15 desember 2010; Godkjent: 08.05.2011; Publisert: 10 juni 2011
Copyright: © 2011 Yoffou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada (tilskudd # 262142 EC). Tumor bank ble støttet av Banque de vev et de données av Réseau de recherche sur le kreft i Fonds de la recherche en santé du Québec tilknyttet den kanadiske Tumor Repository Network. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er den ledende dødsårsaken fra gynekologisk kreft i de fleste vestlige land [1]. På grunn av sin asymptomatiske vekst og mangel på effektive metoder for screening, blir omtrent 70% av alle tilfeller diagnostisert i et avansert stadium, med bare beskjedne forbedringer i overlevelse i løpet av de siste 40 årene [1]. Selv om de fleste pasienter responderer på kjemoterapi i utgangspunktet, er tilbakefallsprosent svært høy resulterer i generell dårlig prognose sett hos disse pasientene [2]. Videre EOCs er morfologisk heterogene, og ulike histopatologiske undergrupper har forskjellige molekylære egenskaper og diverse behandlingsrespons [3]. EOC kan klassifiseres som serøs, endometrioid, klar celle eller mucinous som svarer til de forskjellige typer av epitel som er tilstede i det kvinnelige reproduksjonskanalen [4]. Forskjeller i kjemoterapi respons og pasientens utfall trolig resultere fra den molekylære heterogenitet av disse morfologisk distinkte EOCs [3]. For eksempel
TP53
mutasjoner er ofte observert i serøse og endometrioid kreft, men er knapt påvist i klarcellet og mucinkjertler EOCs [3]. Det er også kjent at hyppigheten av kromosomal ustabilitet er høyere i serøs EOC enn i de andre undertypene [3].
I serøs EOC, molekylær genetisk analyse har foreslått en rolle for tumorsuppressorgener som ligger på den korte armen av kromosom 3 (3p) i patogenesen av sykdommen [5]. Transkriptomet analyse av kromosom 3 gener identifisert flere differensielt uttrykte gener i EOC cellelinjer og ovarietumorer i forhold til normal eggstokk overflaten epithelial (nese) celler [6], [7]. Kromosomavvik i 3p21.3 er ofte funnet i lunge, nyre og brystkreft, noe som tyder på at de havn tumorsuppressorgener [8]. Ligger på kromosom 3p21.3 er en klynge av gener, kalt hyaluronidases (
HYAL1
,
HYAL2 Hotell og
HYAL3
), som er den hyppigste målet for homozygot strykninger i lungekreft [8].
Pattedyr hyaluronidases (EC 3.2.1.35) er endo-
N
-acetylhexosaminidases som hydrolyserer glykosaminoglykanet hyaluronan. De består av en familie av gener 6-7 med ca. 40% identitet mellom hverandre, [9], [10]. Hos mennesker, de er gruppert i grupper på tre på kromosomer 3p21.3 (
HYAL1
,
HYAL2 Hotell og
HYAL3
) og 7q31.3 (
HYAL4
,
PH20 Twitter /
SPAM1 Hotell og
HYALP1
), med
HYALP1
være en pseudogen og
HYAL4
koding for et kondroitinase enzym [9], [11]. Derfor, hos mennesker, er det fire hyaluronidases, Hyal-1, -2, -3 og PH20 /Spam1, idet sistnevnte er hovedsakelig uttrykt i den mannlige forplantningskanalen og som har en viktig rolle i fertilisering [12]. På den annen side, er hyaluronidases lokalisert på kromosom 3 ubikvitært uttrykt. Hyal-1 og Hyal-2 er de viktigste somatiske hyaluronidases som er ansvarlige for hyaluronan omsetning og er kjent for å ha en rekke fysiologiske og patologiske roller [9], [13], som sårheling, inflammasjon og osteoartritt. I motsetning til dette, har Hyal-3 blitt beskrevet å være blottet for hyaluronan enzymatisk aktivitet [14] og dets fysiologiske rolle fremdeles gjenstår å bli bestemt.
i eggstokk-kreft, allelisk ubalanse av disse tre genene (
HYAL1
,
HYAL2 Hotell og
HYAL3
) har vært vist i tumor og stroma vev [15]. Spesielt
Hyal-1
mRNA-ekspresjon ble funnet å være vesentlig redusert i serøs EOC når sammenlignet med normale eggstokkene [16], mens uforandret eller en tendens til redusert Hyal-1-aktiviteten ble rapportert i EOC vevsekstrakter [ ,,,0],16], [17]. I overensstemmelse med denne observasjon, er ekstracellulære akkumulering av hyaluronan ofte observert i ovarial tumor stroma og pericellulær matrise, og er assosiert med dårlig resultat sykdom [17], [18]. I tillegg har flere rapporter vist interaksjoner mellom hyaluronan og membranreseptorer, slik som CD44, som fremmer foreningen av CD44 med visse cytoskeletal proteiner (f.eks ankyrin, RhoGTPases, Cdc42) generere spesifikke signal hendelser fremme eggstokkreft celle adhesjon, migrasjon og overlevelse [ ,,,0],19]
i motsetning til dette nivåer av både hyaluronan og Hyal-1 er blitt rapportert å være økt i blære, prostata og hode- og nakkekreft, og for å være implisert i tumorprogresjon og metastase [20] -. [ ,,,0],22]. Interessant er forhøyet ekstracellulære hyaluronan i hovedsak funnet i tumor stroma mens forhøyede Hyal-1-nivåer er registrert i tumorvev, noe som tyder på en cross-talk mellom disse to vevstyper. Høye nivåer av Hyal-1-ekspresjonen er også funnet i brystkreft og glioblastomer, og er korrelert med metastatiske tumorer [22], [23]. Interessant, østrogen reseptor (ER) negative brystkreftcellelinjer, som har en tendens til å være mer aggressive, har forbedret hyaluronidase aktivitet sammenlignet med ER positiv cellelinjer [24]. Ved en mekanisme ennå ukjent, Hyal-1 induserer cellesyklus overgang og opp-regulerer nivåene av positive regulatorer av G2-M overgang (f.eks cdc25c, cyclin B1, cdk10) i blære, prostata og muntlig squamous kreftcellelinjer [25] – [27]. Hyal-1 forbedrer også angiogenese, sannsynligvis ved å generere hyaluronan fragmenter av forskjellige størrelser som har evnen til å stimulere endotelial celleproliferasjon og kapillær formasjon [28].
Derfor nivåer av hyaluronidase ekspresjon kan variere avhengig av tumortype og på sin aggressive oppførsel. I det foreliggende arbeidet som utføres vi en detaljert studie på ekspresjon av Hyal-1 in ovarian cancer vevsprøver som representerer fire forskjellige histopatologiske subtyper og viste forhøyede nivåer av dette enzymet i klare celle og mucinkjertler EOCs, men ikke i serøs eller endometrioid. Vi viste også at nivåene av
HYAL1
mRNA i klarcellet og mucinkjertler EOCs ble omvendt korrelert med de av ERα. Betydelig, viste vi at ektopisk uttrykk for ERα induserte en 50% reduksjon i
HYAL1
mRNA uttrykk i en klar celle EOC cellelinje. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten: i) demonstrerer økt Hyal-1 uttrykk i spesifikke morfologiske EOC subtyper, ii) viser en invers korrelasjon mellom
HYAL1 Hotell og steroidhormoner i vevsprøver, og iii) impliserer
HYAL1
genet som ERα mål for gen undertrykkelse. Til slutt viste vi en 2,1-2,8 ganger økning i plasmanivåene av dette enzymet hos pasienter med klarcellet og mucinous EOC, men ikke i de med serøs eller endometrioid svulster, sammenlignet med pasienter med godartede cyster. Våre nåværende resultater identifisere Hyal-en som en potensiell biomarkør for påvisning av disse to distinkte EOC subtyper.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Tissue tumorprøver og EDTA- innsamlet plasma ble oppnådd, med informert samtykke fra deltakerne gjennomgår operasjoner utført ved Centre hospitalier de l’Université de Montréal (kompis) Hôpital Notre-Dame. Retningslinjene for innsamling og bruk av vev og blodprøver ble godkjent av forskningsetiske komité for kompis. Bare svulster fra kjemoterapi naive pasienter ble brukt. Histopatologi, grad og stadium av svulster ble tildelt i henhold til International Federation of gynekologi og fødselshjelp (Figo) kriterier. Som normal ovarie har liten epitelial innhold, ble benigne serøse ovarietumorer anvendt som en kontroll. Informasjon vedrørende prøvene anvendt i foreliggende studie er sammenfattet i tabell 1.
Cellelinjer
Primære kulturer av normal ovarie flate epitel (nese) celler ble avledet, som tidligere beskrevet [ ,,,0],29], fra eggstokkene av tre deltakere uten tidligere historie med eggstokkreft, etter profilactic oophorectomy på kompis Hôpital Notre-Dame og informert samtykke. EOC cellelinjer ble etablert som tidligere beskrevet [29] – [31], og ble hentet fra serøs epiteliale ovarietumorer (TOV81D, TOV2223, TOV1946) eller ascites væske (OV1946, OV866), fra en endometrioid ovarial tumor (TOV112D), en klarcellet karsinom (TOV21G), og en mucinous ovarialcancer (TOV2444). Celler ble dyrket i OSE medium (Wisent Inc., St. Bruno, QC, Canada) inneholdende 2,5 ug /ml amfotericin B og 50 ug /ml gentamicin (begge fra Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Kulturmediet ble supplert med 15% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) for nesen kulturene og 10% FBS for EOC-cellelinjer.
Kvantitativ sanntids RT-PCR (Q-PCR)
Total RNA ble ekstrahert med Trizol reagens (Invitrogen) fra frosne tumorprøver eller direkte fra celler dyrket til 80% konfluens, som beskrevet tidligere [32]. RNA kvalitet ble rutinemessig overvåket ved agarosegel-elektroforese, og med 2100 Bioanalyzer, ved hjelp av RNA 6000 Nano LabChip kit (Agilent Technologies, Waldbronn, Tyskland). CDNA-syntese ble utført i henhold til protokollen til QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada) ved anvendelse av 1 pg av total RNA. Den erholdte cDNA-oppløsning ble fortynnet ti ganger og 5 pl aliquoter ble benyttet i hver Q-PCR-reaksjonen. Kvantitative amplifikasjoner ble oppnådd ved bruk av Platinum® SYBR® grønne Q-PCR SuperMix UDG (Invitrogen) og følgende par av primere: 5′-AAGCCCTCCTCCTCCTTAACC-3 «og 5′-AGCCAGGGTAGCATCGAC-3» for
HYAL1
, 5′-CGCGCTCTACCCTGCACTC-3 «og 5′-TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT-3′ for ERα, 5»-TGGGCTTACTGACCAACCTG-3 «og 5′-CCTGATCATGGAGGGTCAAA-3′ for ERβ, 5»-AGAGTCCCTGGTGTGAAGCAA-3 «og 5»-GACAGCGCAGAAGTGAGCATC-3- «for progesteronreseptoren (PR), 5′-GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3′ og 5»-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3 «for
ERK1
. De ovennevnte ERα, ERβ og PR-primer-sekvensene ble erholdt fra en tidligere publikasjon [33].
ERK1
ble valgt som kontroll genet basert på dens stabil ekspresjon i eggstokkene prøver, bestående av normale og forskjellige EOC subtyper [34], [35], og som tidligere beskrevet [34]. Fluorescens ble tatt ved hjelp av iCycler iQ sporing i sanntid system (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Amplifikasjoner ble utført ved 50 ° C i 2 minutter (UDG ruge), 95 ° C i 3 minutter (denaturering), og 50 sykluser med 95 ° C /30 sek, 58 ° C /30 sek og 72 ° C /45 sek , etterfulgt av en smeltekurve for 70 sykluser med 0,5 ° C økning /syklus som starter ved 60 ° C. Positive og negative kontroller ble innført i alle forsøk, og renhet og spesifisiteten av PCR-produktene ble sporadisk overvåket ved agarosegelelektroforese. PCR-reaksjoner ble utført minst tre ganger for hver cDNA-prøve i separate forsøk. Relativ ekspresjon verdi ble oppnådd ved 1/2
ΔCt metode ved hjelp av
ERK1
som kontroll genet. I denne fremgangsmåten, er forskjellen i C
T (A C
T) mellom målet og styre genene ble anvendt for å bestemme genekspresjon med formelen 2
ΔCT. Et normalisert verdi av uttrykk for målgenet med henvisning til kontroll-genet ble deretter oppnådd ved beregning 1/2
ΔCT. Alle mRNA uttrykk verdiene var forhold sammenlignet med kontrollgruppen
ERK1
genet.
For å overvåke biologisk respons av ERα ektopisk uttrykk på TOV21G celler (se nedenfor), Q-PCR ble utført for å måle mRNA nivåer av kjente ERα mål, f.eks
GREB1 plakater (vekstregulering av østrogen i brystkreft 1) og
TFF1 plakater (trekløver faktor 1, også kjent som pS2 genet) [36], [37]. PCR-reaksjoner ble utført som ovenfor beskrevet ved hjelp av de følgende par av primere: 5′-TTCCCCGAAGTGCCAACAAC-3 «og 5′-ATGGAGATTCTGGAGACCACCC-3» for
GREB1
, og 5′-TGGAGAACAAGGTGATCTGCG-3 «og 5»- CGAAACAGCAGCCCTTATTTGC-3 «for
TFF1
.
GEO datasett Analyse
genuttrykk profiler av flere vevsprøver av de fire morfologisk distinkte eggstokkreft og normal eggstokkene er utført ved hjelp av den Affymetrix HG_U133A matrisen [35] og ble gjort tilgjengelig gjennom Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI) (GEO datasett GSE6008). I denne studien har vi lastet opp rå bordet for hver tumorprøve og valgt de normaliserte verdier [quantile-normalisert trimmet gjennomsnitt, log-transformert med log (max (x + 50,0) 50] for hybridisering av sondene av interesse. i tilfelle av
HYAL1
og PR, den Affymetrix HG_U133A matrisen inneholdt bare en sonde for hver av disse genene (210619_s_at og 208305_at, henholdsvis). Derfor er disse verdiene ble benyttet som sådan i vår analyse for å . behandle uttrykket av disse genene i de enkelte vevsprøver Men for ERα og ERβ flere sonder var tilgjengelige (205225_at, 211233_x_at, 211234_x_at, 211235_s_at, 211627_x_at, 215551_at, 215552_s_at, 217163_at, 217190_x_at for ERα, og 210780_at, 211117_x_at, 211118_x_at, 211119_at , 211120_x_at for ERβ), og gjennomsnittet av de normaliserte verdier for sondene av hvert gen ble anvendt i vårt arbeid for å analysere ekspresjon av disse genene i de enkelte vevsprøver. Opplysninger om histologi, grad og fasen av disse prøvene ble oppnådd fra tilgjengelig supplerende materiale [35] og er oppsummert i Tabell 1.
Hyaluronan zymografi
for å overvåke hyaluronidase aktivitet av cellelysatene fra eggstokkreft cellelinjer, hyaluronan zymografi ble utført som tidligere beskrevet [38] . Celler høstes fra 80% konfluente kulturer ble resuspendert i lyseringsbuffer (10 mM imidazol, 0,25 M sukrose), ultralydbehandlet kort og deres proteininnhold bestemt ved BioRad protein-reagens. Prøver (inneholdende 30 ug protein) ble separert ved nativ PAGE (20 mA, 4 ° C) på en 8% gel inneholdende 0,25 mg /ml human navlestreng hyaluronsyre (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada). Gelen ble deretter kort ekvilibrert i analysebufferen spesifikk for hyaluronidase-1-deteksjon (100 mM natrium-formiat, 150 mM NaCl, pH 3,7) og deretter inkubert over natten i den samme buffer ved 37 ° C. Etter inkubering ble gelene ble behandlet med 0,01 mg /ml pronase (Sigma-Aldrich) i en 20 mM Tris buffer (pH 8,0) i 4 timer, skyllet med destillert vann, og farget sekvensielt med 0,5% Alcian blått og 0,1% Coomassie blue R- , både i 30% methanol:10% eddiksyre. Geler ble de-farget før var tydelig å fjerne band av fordøyd hyaluronan. Gel zymografi ble gjentatt tre ganger for hver cellelinje ved hjelp av celleekstrakter fra ulike kulturer.
Hyal-en enzymatisk aktivitet av plasmaprøver
Kvantifisering av Hyal-en aktivitet i plasma prøven ble analysert ved en kolorimetrisk metode for estimering av
N
acetyl-D-glukosamin (NADG) løslatt etter hyaluronan fordøyelsen [39], [40]. I korthet ble alikvoter av EDTA-behandlet plasma (rundt 4 ul, inneholdende 30 ug proteiner, som bestemt ved Bio-Rad Protein Reagent) ble inkubert med 40 ug av hyaluronan fra human navlestreng (Sigma-Aldrich) i 200 ul sluttvolum på reaksjonsbuffer (79 mM natriumformiat, 150 mM NaCl, 0,2 mg /ml BSA, pH 3,9) ved 37 ° C i 24 timer. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 40 ul 1,2 M kaliumtetraborat, pH 9,1 og kokt i 3 min. Fargedannelse er avdekket ved tilsetning av 1,2 ml av
p
-dimethylaminobenzaldehyde-reagens (fremstilt som tidligere beskrevet [39], [40]), og inkubasjon ved 37 ° C i 20 minutter i det sure miljø av denne reagensen . Prøvene ble umiddelbart lese på 585 nm. Hyaluronidase-aktivitet ble anslått fra en NADG (Sigma-Aldrich) standardkurve (1 til 10 nmols), og ble uttrykt som nmol /ug protein. Plasmaproteininnholdet ble bestemt ved BioRad proteinanalyse. Blanks ble oppnådd ved å utelate plasmaprøvene. Hver plasmaprøve ble målt minst tre ganger i separate forsøk.
TOV21G celle transfeksjon
pcDNA-plasmidet (Invitrogen) inneholdende den humane østrogenreseptoren alfa-sekvens (kalt pERα) har blitt beskrevet [41] , [42]. TOV21G celler ble dyrket i fullstendig OSE (Wisent) medium som beskrevet ovenfor, inntil cellene var rundt 60% sammenflytende. Cellene ble transient transfektert med 1 mikrogram pERα i DMEM-F12 medium (Wisent) uten kosttilskudd bruker GeneJuice transfeksjon reagens (EMD Chemicals, Gibbs, New Jersey), i henhold til produsentens anvisninger. Etter en natts transfeksjon, ble mediet erstattet med fullstendig OSE medium, og cellene ble dyrket i en ekstra 24 timer for proteinekspresjon. Ved slutten av forsøket ble cellene høstet ved trypsin-EDTA-behandling (0,25% trypsin med 1 mm EDTA; Invitrogen), vasket i PBS og anvendt for RNA-ekstraksjon og Q-PCR eller for proteinekstraksjon og immunblotting. Transfeksjon Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Immunoblotting
Cellene ble lysert i Tris-bufret saltvann (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) (TBS) inneholdende 0,1% Triton X-100, 1 mM orthovanadate, 1 mM NaF, 0,1 mM PMSF og 1 x proteasehemmer cocktail (Complete-mini, Roche Diagnostics Canada, Laval, QC, Canada). Proteininnholdet ble bestemt ved BioRad protein Reagent ved anvendelse av en BSA-standardkurve. Prøver (lysater av omtrent 30 ug protein) ble underlagt 12% SDS-PAGE under reduserende betingelser, og elektrooverført til nitrocellulosemembraner. Ikke-spesifikk binding til membranen ble blokkert med 5% dehydrert skummet melk i TBS. Membranene ble deretter inkubert med primære antistoffer (4 ° C, over natten), vasket i TBS inneholdende 0,1% Tween og inkubert med pepperrot peroksidase konjugert sekundært antistoff. De primære IgG antistoffer som brukes i vårt arbeid var anti-ERα (H-184, 1:1000, kanin antistoff, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og anti-aktin (pan Ab-5, 1:1500, mus antistoff; Lab Vision Corp., Fremont, CA). Disse antistoffene ble testet i vårt forhold til å være spesifikk for sine mål proteiner. Peroksydase-konjugert anti-mus IgG (1:1000, geit antistoff; Sigma) og anti-kanin-IgG (1:3000, geit antistoff; Bio-Rad) ble brukt som sekundære antistoffer. Protein-antistoff anerkjennelse ble oppdaget av Western Lightning Chemiluminescence Reagens Plus (PerkinElmer, Boston, MA), i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyse
Fordi nivåene av Hyal-en og hormonreseptorer var ikke alltid normalfordelt, ble ikke-parametriske tester anvendt for å analysere genekspresjon i vevsprøver og enzymatisk aktivitet i plasma. Vi først utført en parametrisk Kruskal-Wallis-analyse av varians og når signifikante forskjeller ble observert, gjennomførte vi Mann-Whitney tester som sammenligner den gruppe av normale (for microarray) eller godartet (for Q-PCR og aktivitet) sampler med hver enkelt av tumorundertyper hver for seg . Statistisk signifikans ble ansett på
P
0,05. Spearmans rang korrelasjonskoeffisienter ble beregnet og ble ansett som statistisk signifikant når
P
0,05. Forskjeller i genuttrykk av transfekterte og ikke-transfekterte TOV21G celler ble analysert av Student
t
-test (to-tailed, lik-varians) og ble betraktet som signifikant når
P
0,05 . Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp Prism4 for Windows versjon 4 (GraphPad Software, Inc.).
Resultater
Hyaluronidase-1 uttrykk er forhøyet i klarcellet og mucinous men ikke i serøs og endometroid EOC
i det siste har det uttrykk for Hyaluronidase-en i eggstokkreft er beskrevet spesielt i serøs svulster [16], [17], sannsynligvis fordi dette er den hyppigste EOC subtype [4]. I den foreliggende undersøkelse har vi analysert mRNA-ekspresjon av dette enzym ved Q-PCR i eggstokkreft vevsprøver ble oppnådd fra pasienter med forskjellige morfologiske undergrupper av denne sykdommen, f.eks serøs (11 prøver), endometrioid (9 prøver), klar celle (11 prøver) og mucinkjertler (8 prøver). Ekspresjonsnivåer ble deretter sammenlignet med de av 15 godartet ovarietumorer. Godartede tumorer ble valgt for sammenligning på grunn av deres tallrike innhold av overflate epitelet som er meget få i normale eggstokkene. I tillegg ønsket vi å unngå mulige forstyrrelser av Hyal-1 uttrykk i andre eggstokkene celletyper. For eksempel har vi vist at dette enzymet er uttrykt i mus ovarial granulosa celler [38]. Som vist i figur 1A, er nivåer av
HYAL1
mRNA signifikant forhøyet i klar celle og mucinkjertler karsinomer (Mann-Whitney-test,
P
0,05)., Men ikke i serøse og endometrioid tumorer
A) Q-PCR for
HYAL1
mRNA uttrykk i godartet svulst (hvit bar), og i serøs (stiplet strek), endometrioid (klekket bar), klare celle (skyggelagt bar) og mucinous (sort strek) EOC vevsprøver fra pasienter. Barer representerer gjennomsnitt ± SEM av den relative
HYAL1
uttrykk normalisert til å kontrollere genet
ERK1
fra forskjellige pasienter i hver gruppe. Verdien for hver enkelt cDNA-prøve er gjennomsnittet av 3-4 separate Q-PCR-målinger. * Angir
P
0,05 på Mann Whitney test. B) Normaliserte verdier for
HYAL1
probe hybridisering av Affymetrix HG_U133A array (GEO datasett GSE6008) på RNA prøver av normal eggstokk vev (hvit strek), og av serøs (stiplet strek), endometrioid (klekket bar), klarcellet (skravert bar) og mucinkjertler (svart bar) EOCs. Barer representerer gjennomsnitt ± SEM av rå verdier av normalisert
HYAL1
hybridisering. * Angir
P
0,05 på Mann Whitney test. C) Q-PCR for
HYAL1
mRNA uttrykk i cellelinjer som stammer fra normal eggstokk epitel (NOV2667D, NOV2809D, NOV2206D, hvite søyler), og fra serøs (TOV81D, TOV2223, TOV1946, OV1946, OV866; strødd barer ), endometrioid (TOV112D; klekket bar), klare celle (TOV21G, skyggelagt bar) og mucinous (TOV2444, svart strek) EOCs. Barer representerer gjennomsnittet av den relative
HYAL1
uttrykk normalisert til å kontrollere genet
ERK1
for hver cellelinje. Q-PCR-målinger ble gjentatt minst tre ganger for hver cellelinje cDNA. Cellelinjer avledet fra forskjellige EOC subtyper er representert i adskilte barer derfor ikke feilfelt er representert. Vertikale piler indikerer klart celle og mucinkjertler cellelinjer med høy
HYAL1
mRNA uttrykk. D) Hyaluronan zymogram av cellelysatene fra de ovennevnte serøs, endometrioid, klarcellet og mucinkjertler eggstokkreft cellelinjer. Den horisontale pilen markerer den klare band av fordøyd hyaluronan. Bildet er representative for tre uavhengige zymogram eksperimenter.
På grunn av størrelsen på vårt utvalg årsklasse kan anses som liten, har vi besluttet å validere våre resultater ved å analysere
HYAL1
mRNA uttrykk i en offentlig tilgjengelig microarray datasett [35] (GEO datasett GSE6008) som inneholder 41 serøs, 37 endometrioid, 8 klarcellet og 13 mucinkjertler EOC prøver, og 4 normale prøver eggstokkvev. Figur 1B viser normaliserte verdier [quantile-normalisert trimmet gjennomsnitt, log-transformert med log (max (x + 50,0) 50] for hybridisering av hver prøve med
HYAL1
probe (210619_s_at) av Affymetrix HG_U133A matrisen. i samsvar med våre Q-PCR resultater, ble det ikke observert signifikant forskjell for
HYAL1
mRNA uttrykk mellom normale eggstokkene vev og at av serøs eller endometrioid tumorprøver (Figur 1b). klarcellet karsinom hadde en tendens til å uttrykke høyere nivåer av
HYAL1
mRNA enn normalt eggstokkvev men ingen statistisk signifikans ble oppnådd. i henhold til våre resultater, mucinkjertler prøver hadde statistisk signifikant høyere nivåer av
HYAL1
enn normalt vev (Mann Whitney test,
P
0,05). (figur 1B)
eggstokk-kreft-cellelinjer avledet fra tumor prøver av disse forskjellige morfologiske subtyper har tidligere blitt karakterisert og viste oppførsel ligner tumorprøve som de stammer [29] – [31] de gir kraftige verktøy for å undersøke de molekylære hendelser relatert til hverandre morfologisk distinkt eggstokkreft.. Derfor vårt neste skritt var å analysere nivået av uttrykk for
HYAL1
mRNA og protein i disse cellelinjene. Primære cellekulturer av normal ovarie flate epitel (nese) [29] ble anvendt som kontroller. Figur 1C viser at, som forventet, mRNA-ekspresjon av
HYAL1
var spesielt høy i cellelinjer TOV21G (avledet fra en klar karsinom) og TOV2444 (avledet fra en mucinous EOC). Et mellomliggende nivå på
HYAL1
mRNA-ekspresjon ble observert i cellelinjen TOV112D, som var avledet fra en endometrioid ovarial tumor. Cellelinjer avledet fra serøs ovarialcancer på det primære stedet (TOV81D, TOV2223, TOV1946) eller fra ascitesvæske (OV1946, OV866) viste lave nivåer av
HYAL1
uttrykk, kan sammenlignes med de av NESEcellelinjer. For å demonstrere at mRNA-ekspresjonsnivåer, målt kvantitativt ved vår sett av primere, reflekterte mengden av Hyal-1-protein i disse prøvene, målte vi Hyal-en enzymatisk aktivitet av et substrat-gel zymogram. Dette er en vanlig metode for å måle hyaluronidase-aktivitet og er spesifikk for Hyaluronidase-1 når analysert ved sur pH [38]. Figur 1D viser et tydelig bånd av spaltet substrat (hyaluronan) bare i cellelysatene av TOV21G og TOV2444 cellelinjer. Den Hyal-en enzymatisk aktivitet i serøs og endometrioid prøvene var under deteksjonsnivå analysen vår.
Fordi forhøyede Hyal-1 nivåer har tidligere blitt korrelert med høyere grad av blære og prostata svulster [21], [22 ], bestemte vi oss for å verifisere om nivåer av
HYAL1
mRNA i klarcellet og mucinkjertler ovarietumorer ville korrelerer med sykdoms klasse eller trinn (se tabell 1 for pasientenes informasjon). Men analyser Spearman korrelasjon viste ingen signifikant positiv korrelasjon mellom nivåer av
HYAL1
mRNA og enten klasse eller stadium i klar celle (r = 0,262 og -0,322 for henholdsvis klasse og stadium i vår datasettet, og r = 0,055 for scenen i microarray data, alt
P
0,05) eller mucinkjertler tumorprøver (r = -0.655 og -0.577 for klasse og scene henholdsvis i vårt datasett, og r = -0.094 og – 0,378 for klasse og scene i microarray data, alt
P
0,05). Global analyse inkludert alle undertyper ikke viser en signifikant positiv korrelasjon enten (r = -0,234 og -0,251 for henholdsvis klasse og stadium i vår datasettet, og r = 0,185 og 0,042 for grad og stadium i microarray data, alt
P
0,05). Disse resultater antyder at Hyal-1-ekspresjonen kan være en iboende fenotypisk egenskap av klar celle og mucinkjertler EOCs, og at det kunne bli anvendt som diagnostiske /gjenkjenning markør for disse eggstokkreft subtypene.
Hyaluronidase-1-aktivitet kan påvises i det kondisjonerte kulturmediet av TOV21G cellelinje, og er en potensiell serum /plasma biomarkør for klar celle og mucinous EOC
det har vist seg at Hyal-1 er til stede i kulturmediet av prostata og blærecancercellelinjer så vel som i urinen hos pasienter med blærekreft [21], [26], [27]. I det foreliggende arbeid, vi ønsket å verifisere hvorvidt Hyal-1 ble også utskilt av EOC cellelinjer, og om det kan brukes som et serum /plasma markør for de to morfologiske undertyper hvori uttrykket nivå er hevet, f.eks klarcellet og mucinous EOC. Figur 2A viser tilstedeværelsen av Hyal-1-aktivitet (klar båndet spaltet hyaluronan) i den konsentrerte serumfritt kondisjonert medium fra TOV21G cellekultur, så vel som i sin cellelysat. I motsetning til dette, kan ingen enzymatisk aktivitet påvises i konsentrert kondisjonert medium og cellelysat fra TOV1946 cellelinje (avledet fra en serøs EOC). Etter å ha fastslått at Hyal-1 blir utskilt av eggstokkreft celler som uttrykker dette enzymet, undersøkte vi hvorvidt denne enzymatiske aktivitet kan bli differensielt påvises i plasma hos pasienter med forskjellige morfologiske EOC subtyper.
