Abstract
Bakgrunn
epitelcelledifferensiering trans sekvens 2 (ECT2) er en guanin nukleotid utveksling faktor for Rho familien GTPase, som har vært innblandet i den ondartede fenotype av kreft hos mennesker. Lite er kjent om effekten av et høyt nivå av ECT2 i å regulere munnhulekreft celle atferd. I denne studien undersøkte vi involvering av ECT2 i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC).
metodikk /hovedfunnene
Vi analyserte ECT2 uttrykk i OSCC-avledede cellelinjer og primære OSCCs sammenlignet med matchet normalt vev (n = 96) ved kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon, Western blot, og immunhistokjemi. Vi vurderte deretter sammenhengen mellom ECT2 uttrykk status i grunnskolen OSCCs og clinicopathological funksjoner. ECT2 uttrykk var signifikant oppregulert i OSCCs
in vitro Hotell og
in vivo product: (
p
0,05). Blant de kliniske variabler analysert, også høyere ECT2 uttrykket var forbundet med TNM stadium gradering (
p
0,05). Når vi utførte funksjonelle analyser av ECT2 i OSCC-avledede celler ved hjelp av shRNA system, nedsatt celleformering av ECT2 knockdown-celler i betydelig grad sammenlignet med kontrollceller (
p
0,05). Cellesyklus analyse av flowcytometri viste arrestasjonen av cellesyklusprogresjon på G1 fase i ECT2 knockdown celler. Vi har også funnet opp-regulering av Cip /Kip familie av cyklin-avhengige kinase-inhibitorer, p21
cip1 og p27
kip1, og nedregulering av cyclin D1, cyklin E, og CDK4. Disse data antydet at den forhøyede Cip /Kip familie indusert hemming av cyklin D1-CDK-kompleks-aktivitet som fører til cellesyklus-stans i G1 fase.
Konklusjoner /Betydningen
Våre resultater foreslått for første gang at ECT2 er en indikator på mobilnettet spredning i OSCCs og at ECT2 kan være et potensielt terapeutisk mål for utvikling av nye behandlingsmetoder for OSCCs
Citation. Iyoda M, Kasamatsu A, Ishigami T, Nakashima D, endo-Sakamoto Y, Ogawara K, et al. (2010) epitelcelledifferensiering Trans Sequence 2 i Human Oral Cancer. PLoS ONE 5 (11): e14082. doi: 10,1371 /journal.pone.0014082
Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 18 juni 2010; Godkjent: 28 oktober 2010; Publisert: 29.11.2010
Copyright: © 2010 Iyoda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid Scientific Research (nr 20592353) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet globalt, sto for 275.000 nye tilfeller og mer enn 120.000 dødsfall årlig [1]. Mange risikofaktorer er identifisert, inkludert tobakk og alkohol [2], [3], [4]. Men noen pasienter utvikler OSCC uten risikofaktorer, som tyder på at verten mottakelighet spiller en viktig rolle. Molekylære endringer i en rekke onkogener og tumor suppressor gener assosiert med utvikling av OSCC kan være viktige ledetråder for å forebygge denne sykdommen [4], [5].
Microarray teknologien har vært nyttig for å analysere endringer i tusenvis av gener og avdekke vesentlige mønstre. Vi har tidligere rapportert genuttrykk profilering av OSCC å identifisere kreftrelaterte gener [6]. Blant genene, epitelial celletrans sekvens 2 (ECT2) var signifikant oppregulert i OSCC. ECT2 er et guanin nukleotid utveksling faktor (GEF) for Rho familie GTPase relatert til cytokinese [7], [8], [9], [10], [11]. GEFs kata utveksling av BNP for GTP, og dermed aktivere Rho GTPases i signaltransduksjon. ECT2 uttrykk er dynamisk styrt gjennom cellesyklusen. Ved nedbrytning av kjerne konvolutten under mitose, er ECT2 dispergert i cytoplasma, deretter ECT2 blir lokalisert til de mitotiske spindler under metafase, spaltingen fure under telophase, og midten av kroppen ved enden av cytokinese [8]. De Rho GTPases har vært implisert i maligne fenotypen av kreft hos mennesker som et resultat av deres deltagelse i avvikende signalisering på tumorceller [12], [13], [14], [15], [16], [17].
i denne studien ble ECT2 ofte overexpressed i OSCC-avledede cellelinjer og primære OSCCs. I tillegg er en shRNA eksperiment viste at ECT2 nedregulering resulterte i redusert cellulær proliferasjon av cellesyklus-stans av G1 fase. Derfor foreslo vi at ECT2 kan være en biomarkør for spredning og potensiell terapeutisk mål for OSCCs.
Resultater
Evaluering av
ECT2
mRNA uttrykk i OSCC-avledede cellelinjer
for å undersøke mRNA uttrykk for
ECT2
identifisert som en kreft-relaterte genet ved vår microarray analyse [6], vi utført kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR) analyser ved hjelp av seks OSCC-avledet celle linjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, og SA3) og humane normale orale keratinocytter (HNOKs). mRNA-ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH.
ECT2
mRNA var signifikant oppregulert i alle OSCC cellelinjer sammenlignet med HNOKs (Figur 1A, *
p
0,05).
(A) Kvantifisering av
ECT2
mRNA nivåer i OSCC-avledede cellelinjer ved QRT-PCR-analyse. For å bestemme mRNA uttrykk for
ECT2
i Oral kreft, utførte vi QRT-PCR analyse ved hjelp av seks OSCC-avledede cellelinjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, og SA3 ) og HNOKs. Betydelig oppregulering av
ECT2
mRNA er sett på seks OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med den i HNOKs. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene (*
p
0,05, Mann-Whitney
U
test). (B) Western blot-analyse av ECT2 protein i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs. For å undersøke protein ekspresjon av ECT2 i oral cancer, utførte vi Western blot-analyse ved hjelp av seks OSCC-avledede cellelinjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, H1, Ca9-22, og SA3) og HNOKs. ECT2 proteinekspresjon er oppregulert i OSCC-avledede cellelinjer sammenlignet med HNOKs. Densitometriske ECT2 protein data er normalisert til a-tubulin protein nivåer. Verdiene er uttrykt som en prosentandel av HNOKs.
Evaluering av ECT2 protein uttrykk i OSCC-avledede cellelinjer
Vi utførte Western blot analyse for å undersøke ECT2 protein uttrykk status i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs (figur 1B). Molekylvekten av den ECT2 var 112 kDa. En betydelig økning i ECT2 protein-ekspresjon ble observert i alle OSCC cellelinjer sammenlignet med HNOKs. Expression analyse indikerte at både transkripsjon og oversettelse produkter av dette molekylet ble sterkt uttrykt i OSCC-avledede cellelinjer.
Evaluering av ECT2 uttrykk i primær OSCCs
Vi målte
ECT2
mRNA uttrykk nivåer i grunnskolen OSCCs og sammenkoblede normale muntlige vev fra 96 pasienter. I likhet med dataene fra de OSCC-avledede cellelinjer, QRT-PCR-analyse viste at
ECT2
mRNA-ekspresjon var oppregulert i 75 (78%) av 96 primære OSCCs sammenlignet med matchede normale orale vev. De relative mRNA-ekspresjonsnivåer i den normale orale vev og primære OSCCs varierte 0,003 til 1,632 (median, 0,081) og 0,005 til 4,39 (median, 0,289), henholdsvis (figur 2,
p
0,05).
For å undersøke
ECT2
mRNA uttrykk nivåer i grunnskolen OSCCs og sammenkoblede normale muntlige vev fra 96 pasienter, utførte vi QRT-PCR-analyse. De relative mRNA uttrykk nivåer i grunnskolen OSCCs og matchet orale vev (n = 96) spenner 0,005 til 4,39 (median, 0,289) og 0,003 til 1,632 (median, 0,081), henholdsvis.
ECT2
mRNA uttrykk ble oppregulert i 75 (78%) av 96 primær OSCCs sammenlignet med matchede normale muntlige vev. Betydelig høyere
ECT2
mRNA ekspresjon ble observert i primær OSCCs enn matchet normale orale vev (
P
0,05, Mann-Whitney
U
test).
Vi deretter analysert ECT2 protein uttrykk ved immunhistokjemi (IHC). Representative resultater for IHC ECT2-protein i normal oralt vev og primære OSCC er vist i figur 3A og B. Positiv immunoreaksjon for ECT2 ble påvist i kjernen og cytoplasmaet. Sterke ECT2 immunreaksjoner ble påvist i OSCCs, mens normale muntlige vev viste negativ farging. De ECT2 IHC score til normale orale vev og OSCCs varierte 8,33 til 85,33 (median, 44.00) og 55,67 til 211,33 (median, 163,33), henholdsvis. De ECT2 IHC score i primær OSCCs var betydelig høyere enn i normalt vev (figur 3C,
p
0,001). Sammenhenger mellom clinicopathologic kjennetegn ved pasientene med OSCC og status for ECT2 protein uttrykk ved hjelp av IHC scoring system er vist i tabell 1. Blant de kliniske klassifikasjoner, ble ECT2-positive OSCCs korrelert med tumorstørrelse (
p
= 0,043) og TNM staging av OSCC (
p
= 0,044) (tabell 1).
(A, B) representant IHC resultatene av ECT2 i normal oral vev og primær OSCC. (A) Normal oral vev har ingen ECT2 protein uttrykk. Original forstørrelse, × 100. Skala barer, 50 mikrometer. (B) ECT2-positive tilfeller av OSCC. Positiv immunoreaksjonsprodukt for ECT2 er oppdaget i kjernen og cytoplasma. Original forstørrelse, × 400. Skala barer, 10 mikrometer. (C) State of ECT2 protein uttrykk i utstyrsleverandørene muntlig vev og primær OSCC. For å undersøke protein uttrykk for ECT2 i grunnskolen OSCCs, gjennomførte vi IHC. De ECT2 IHC score er beregnet som følger: IHC poengsum = 1 x (antall svake fargede celler i felten) + 2 x (antall moderat fargede celler i felten) + 3 x (antall intenst fargede celler i feltet) . De ECT2 IHC score for OSCCs og normale muntlige vev varierer 55,67 til 211,33 (median, 163,33) og 8,33 til 85,33 (median, 44.00), henholdsvis. Den ECT2 protein uttrykk nivå i OSCCs er betydelig høyere enn i vanlige orale vev (
p
0,001; Mann-Whitney
U
test).
Etablering av ECT2 knockdown celler
for å oppnå stabil ECT2 knockdown transfektanter, brukte vi ECT2 shRNA (shECT2) plasmid og kontroll shRNA (Mock) plasmid. Å vurdere ECT2 mRNA og protein uttrykk i shECT2-transfekterte celler, utførte vi QRT-PCR og Western blot analyser. Figur 4A viser at
ECT2
mRNA uttrykk i shECT2-transfekterte celler var betydelig lavere enn i Mock-transfekterte celler. ECT2 protein nivåer i shECT2-transfekterte celler også redusert markant sammenlignet med Mock-transfekterte celler (figur 4B). ECT2 protein uttrykk nivåer var i samsvar med mRNA uttrykk i transfektanter.
For å oppnå stabile ECT2 knockdown transfektanter, vi utførte transfeksjon av ECT2 shRNA (shECT2) og kontroll shRNA (Mock) i OSCC cellelinjer (Sa3 og H1). Vi utførte QRT-PCR og Western blot analyser for å undersøke ECT2 mRNA og protein uttrykk i shECT2-transfekterte celler. (A) Uttrykk for
ECT2
mRNA i shECT2- og Mock-transfektert SA3 celler. (B) Western blot analyse av ECT2 protein i shECT2- og Mock-transfekterte celler. Den ECT2 mRNA og proteiner er betydelig nedregulert i shECT2-transfekterte celler.
Redusert cellevekst i ECT2 knockdown celler
For å undersøke antiproliferative effekter i shECT2-transfekterte celler, cellular veksten ble overvåket i 7 dager. De shECT2-transfekterte celler viste en signifikant reduksjon i cellevekst sammenlignet med Mock-transfekterte celler (figur 5).
For å bestemme effekten av shECT2 på celleproliferasjon, shECT2- og Mock-transfekterte celler ble sådd i 6 -vel plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler per brønn. shECT2- og Mock-transfekterte celler telles på 7 dager på rad. Veksten av shECT2-transfekterte celler er betydelig hemmet sammenlignet med Mock-transfekterte celler etter 7 dager. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom Mock- og shECT2-transfekterte celler (
p
0,01; Mann-Whitney
U
test).
knockdown av ECT2 fremmer cellesyklus arrest
for å undersøke mekanismen som ECT2 er relatert til cellesyklusprogresjon, utførte vi FACS analyse av shECT2-transfekterte celler. Prosentandelen av G1 fase i shECT2-transfekterte celler var signifikant høyere enn i Mock-transfekterte celler (figur 6A,
p
0,05), noe som tyder på at nedregulering av ECT2 inhiberte cellulær proliferasjon ved induksjon av G1 arrestere. Å identifisere mekanismen som ECT2 blokker G1 progresjon, vurdert vi uttrykket nivået av cyclin-avhengig kinase hemmere (p16
INK4A, p21
cip1, p27
kip1), cyclin D1, cyclin E, og CDK4 (Figur 6B). PCR-data viste oppregulering av
p21
cip1 Hotell og
p27
kip1 Hotell og nedregulering av
cyclin D1
,
cyclin E
,
og CDK4
i shECT2-transfekterte celler.
for å undersøke cellecyklusprogresjonen, analyserte vi Flowcytometrisk bestemmelse av DNA innhold av en FACSCalibur i G0-G1, S, og, G2-M faser. Deretter bestemmes ekspresjonsnivået av cyclin-avhengige kinaser (p16
INK4A, p21
cip1, og p27
kip1), cyklin D1, cyklin E, og CDK4 for å identifisere den mekanismen som ECT2 blokker G1 progresjon. (A) flowcytometrisk analyse ble utført for å undersøke cellesyklus i shECT2- og Mock-transfekterte celler. Antallet celler i G1 har økt markert de ECT2 knockdown celler. (B) QRT-PCR ble utført for å undersøke mRNA-nivåer av cellesyklusrelaterte gener. PCR viser oppregulering av
p21
cip1 Hotell og
p27
kip1 Hotell og nedregulering av
cyclin D1
,
cyclin E
,
og CDK4
. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene (*
p
0,05, Mann-Whitney
U
test).
Diskusjoner
Våre tidligere microarray data [6] viste signifikant oppregulering av
ECT2
i OSCC-avledede cellelinjer. I denne studien ble ECT2 mRNA og protein sterkt uttrykt
in vitro Hotell og
in vivo
i OSCC. Regional kopiantallet av 3q26 økninger i en rekke kreftformer, som hode og nakke, lunge, cervix og [18], [19]. Denne regionen har kreftrelaterte gener (PRKC1 og SOX2) samt ECT2. Derfor ville genomisk ubalanse være årsaken til ECT2 overekspresjon i OSCC. De ECT2 protein uttrykk nivåer i grunnskolen OSCCs ble korrelert med TNM stadium gradering (tabell 1) (
p
0,05). Disse resultatene antydet at ECT2 har en viktig rolle i OSCC utvikling og progresjon. Men lite er kjent om mekanismen for ECT2 i OSCC progresjon. For å avgjøre om ECT2 funksjonen er relevant for OSCC progresjon, utførte vi shECT2 eksperiment og funnet ut at mobilnettet spredning sunket betraktelig som følge av cellesyklus arrest i G1 fasen i ECT2 knockdown celler med oppregulering av p21
cip1 og p27
kip1 og nedregulering av cyclin D1, cyklin E, og CDK4, noe som indikerer at ECT2 funksjon er knyttet tett til OSCC progresjon.
GEFs, inkludert ECT2, katalysere utveksling av BNP for GTP, for derved å aktivere Rho GTPases i signaltransduksjon [7], [8], [9], [10], [11]. Aktiverte Rho GTPases binde seg til og aktivere flere nedstrøms effektorer, noe som fører til multiple biologiske prosesser, slik som cellestørrelse, cellesyklusprogresjon, apoptose, overlevelse, morfologi, cellulær polaritet, cellulær adhesjon, og membranen handel [20], [21]. Oppregulering av Rho GTPase-aktivitet, ofte forbundet med tumorgenese [22], er blitt påvist i en rekke humane tumorer, inkludert kreft i bukspyttkjertelen, brystkreft, melanom, lungekreft, tykktarmskreft, og magekreft [12], [23]. På den annen side, Rho GTPases spille en viktig rolle i å fremme G1-S progresjon gjennom modulering av cyclin og cyklinavhengige kinase inhibitorer (CDKIs) [24], [25]. Yamamoto et al. rapportert at når Rho GTPase ble hemmet av
Clostridium botulinum
C3 toksin eller en dominant negativ mutant, ble G1-S cellecyklusprogresjonen betydelig svekket [26]. Den svekket aktivering av GTPases er forbundet med konstitutivt forhøyede nivåer av p21
cip1 og p27
kip1, forårsaker cellene til å akkumulere i G1 fase [27], [28], [29], [30], [31 ], [32]. Vi spekulert i at ECT2 knockdown fører til nedsatt aktivering av Rho GTPase, og konsistent med det, fant vi ikke bare oppregulering av Cip /Kip familie (p21
cip1 og p27
kip1), men også nedregulering av cyklin D1, cyklin E, og CDK4, som fører til cellesyklus-stans i G1 fase, i ECT2 knockdown-celler.
Cyclin D1, cyklin E, og CDK4 er også en viktig regulator av G1 progresjon og G1-S- overgang. Hemming av cyklin D1, cyklin E, og CDK4 uttrykk blokker G1-S-overgang i cellesyklusen [33], [34], [35], [36]. Cykliner D1-D3 og E familier og deres respektive kinase partnere, CDK4 /6 og CDK2, er ansvarlig for å regulere overgangen fra G1 til S-fasen. Virksomheten til cyclin-CDK-komplekser moduleres av to typer CDKIs, Cip /Kip (p21
Cip1, p27
Kip1, og p57
Kip2) og INK4 (p15
INK4B, p16
INK4A, p18
INK4C, og p19
INK4D) familier, som begge regulerer cellesyklusprogresjon [37]. Medlemmer av Cip /Kip familie bind til cyclin-CDK-komplekser og hemmer deres aktiviteter, noe som fører til redusert fosforylert retinoblastom protein og G1 cellesyklus arrest.
I konklusjonen, våre resultater indikerte at ECT2 er overuttrykt ofte i OSCC . Videre ECT2 knockdown hemmet celledeling
in vitro
ved å arrestere cellecyklusprogresjonen på G1 fase ved å modulere uttrykk av cellesyklusrelaterte molekyler, som til slutt fører til hemming av cyclin D1-CDK kompleks aktivitet. Disse data antydet at ECT2 spiller en viktig rolle i OSCC celleproliferasjon. ECT2 uttrykk er sannsynlig å være en biomarkør for spredning og en potensiell terapeutisk mål for utvikling av kreft narkotika i grunnskolen OSCCs.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle pasienter gitt informert samtykke for en protokoll gjennomgått og godkjent av Institutional Review board of Chiba University. De skrift informert samtykke ble oppnådd fra alle pasienter.
OSCC-avledede cellelinjer og vev-prøver
HSC-2, HSC-3, HSC-4, og Ca9-22 cellelinjer, avledet fra menneskelige OSCCs, ble kjøpt fra human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan). H1 og SA3 cellelinjer ble vennlig levert av Dr. S. Fujita ved Wakayama Medical University (Wakayama, Japan). Primære dyrkede HNOKs ble oppnådd fra tre friske donorer [38], [39]. Alle celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium /F-12 HAM (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO) supplementert med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheter /ml penicillin og streptomycin (Sigma).
Vevsprøver fra 96 urelaterte japanske pasienter med primær OSCC som ble behandlet ved Chiba universitetssykehus ble oppnådd i løpet av kirurgisk reseksjon. De resekterte Vevene ble delt i to deler, hvorav den ene ble frosset umiddelbart og lagret ved -80 ° C inntil RNA isolering, og den andre som ble løst i 10% bufret formaldehyd-oppløsning for patologisk diagnose og IHC. Histopatologisk analyse av vev ble utført i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier ved Avdeling for patologi, Chiba universitetssykehus. Clinicopathologic iscenesettelse ble bestemt av TNM-klassifikasjon av International Union mot kreft. Alle pasientene hadde OSCC som var histologisk bekreftet, og tumorprøver ble sjekket for å sikre at tumorvevet var til stede i mer enn 90% av prøven.
Fremstilling av cDNA
Total RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert fra 5 mikrogram total RNA ved hjelp av Ready-To-Go You-Prime First-Strand Perler (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Sigma Genosys, Ishikari, Japan), i henhold til produsentens instruksjoner .
mRNA uttrykk analyse
Sanntids QRT-PCR ble utført for å evaluere uttrykket nivåer av målgener (
ECT2
,
p16
INK4A
,
p21
cip1
,
p27
kip1
,
cyclin D1
,
cyclin E
, og
CDK4
) i OSCC-deriverte celler og primære OSCCs. QRT-PCR ble utført med en metode som bruker en LightCycler Faststart DNA Master SYBR Grønn 1 Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). De følgende primere ble anvendt: ECT2, fremover 5′-ATTTTCATGTCGCCCGTTGT-3 «og 5′-revers CCCATGTGATGGACCAATGTC-3»; p16
INK4A, frem til 5′-CAGACATCCCCGATTGAAAGAAC-3 «og 5′-revers GGTAGTGGGGGAAGGCATATATCT-3»; p21
cip1, frem 5′-CCCAGTTCATTGCACTTTGATTAGC-3’and reversere 5′-CAGTCTAGGTGGAGAAACGGGAAC-3 «; p27
kip1, frem 5′-CCGGCTAACTCTGAGGACAC-3’and reversere 5′-AGAAGAATCGTCGGTTGCAG-3 «; cyklin D1, frem til 5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3’and revers 5»-CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3 «; cyclin E, frem til 5′-TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC-3’and revers 5»-TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC-3 «; CDK4, frem 5′-TGCAACACCTGTGGACATGTG-3’and reversere 5»-ATTTTGCCCAACTGGTCGG-3 «. Amplifiserte produkter ble analysert ved 3% agarosegel-elektroforese for å fastslå størrelse og renhet. PCR-reaksjonene ved hjelp av LightCycler anordningen ble utført i et sluttvolum på 20 ul av en reaksjonsblanding bestående av 2 pl av FirstStart DNA Master SYBR grønn I blande, 3 mM MgCl
2, og l pM av primere ifølge produsentens instruksjoner. Reaksjonsblandingen ble fylt i glass-kapillarrør og underkastet en innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 45 runder amplifisering ved 95 ° C (10 sek) for denaturering, 62 ° C (10 sek) for gløding og 72 ° C (10 sek) for forlengelse, med en temperatur helling på 20 ° C /sek. Transkripsjon beløp for de målgener ble estimert fra de respektive standardkurver og normalisert til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (forover 5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3’and reversere 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 «) avskrift beløp fastsettes i tilsvarende prøver.
Protein utvinning
cellene ble vasket to ganger med kald fosfat-bufret saltvann (PBS) og sentrifugeres kort. Cellepelletene ble inkubert ved 4 ° C i 30 minutter i en lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% w /v CHAPS og 10 mM Tris pH 7,4) med proteinase inhibitor cocktail (Roche). Proteinkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av BCA Protein Assay Kit (Thermo, Rockford, IL).
Western blot-analyse
Proteinekstrakter ble underkastet elektroforese på 4-12% Bis-Tris gel, overført til nitrocellulose membraner (Invitrogen), og blokkert i en time ved romtemperatur i Blocking One (Nacalai tesque, Kyoto, Japan). Membranene ble vasket tre ganger med 0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltløsning og inkubert med 2 ug /ml affinitetsrenset kanin anti-humant ECT2 polyklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) over natten ved 4 ° C. Membranene ble vasket igjen og inkubert med en 1:10,000 av geit-anti-kanin IgG (H + L) HRP-konjugat (Promega, Madison, WI) som et sekundært antistoff i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt ble membranene påvist ved anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo) og immunblotting ble visualisert ved å utsette membranene til Atto Lys-Capture II (Atto, Tokyo, Japan). Signal intensiteter ble kvantifisert ved hjelp av CS Analyzer versjon 3.0 software (ATTO).
Transfeksjon
OSCC cellelinjer (SA3 og H1) ble stabilt transfektert med ECT2 shRNA (shECT2) eller kontroll shRNA (Mock) (Santa Cruz Biotechnology) konstruere ved Lipofectamine LTX og Plus reagenser (Invitrogen). Etter transfeksjon ble cellene stabilt shECT2 ble isolert ved dyrkningsmedium inneholdende 2 ug /ml puromycin (Invitrogen). 2-3 uker etter transfeksjon, ble levedyktige kolonier plukkes opp og overføres til nye retter. shECT2- og Mock-transfekterte celler ble brukt for videre forsøk.
IHC
IHC av 4-mikrometer deler av parafininnstøpte prøvene ble utført ved hjelp av kanin anti-ECT2 polyklonale antistoff (Santa Cruz Biotechnology ). I korthet, etter deparaffinization og hydrering ble endogen peroksydase-aktivitet ble stanset ved 30-minutters inkubasjon i en blanding av 0,3% hydrogenperoksidløsning i 100% metanol, hvoretter seksjonene ble blokkert i 2 timer ved romtemperatur med 1,5% blokkerende serum ( Santa Cruz Biotechnology) i PBS før reaksjon med anti-ECT2 antistoff (1:100 fortynning) ved 4 ° C i et fuktig kammer over natten. Etter inkubasjon med det primære antistoff, ble prøvene vasket tre ganger i PBS og ble behandlet med seg reagens (DAKO, Carpinteria, CA), etterfulgt av fargefremkalling i 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAKO). Skinnene ble deretter lett kontra med hematoxylin, dehydrert med etanol, renset med xylen, og montert. Ikke-spesifikk binding av et antistoff til andre proteiner enn antigenet noen ganger skjedde. For å unngå ikke-spesifikk binding, ble en immuniserende peptid-blokkerende eksperiment utført. Som en negativ kontroll ble triplikate seksjoner immunostained uten eksponering for primære antistoffer, som bekreftet fargings spesifisitet. For å kvantifisere tilstanden av ECT2 protein ekspresjon i disse komponentene, anvendte vi IHC resultater systemer som er beskrevet tidligere [6], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45] , [46], [47]. Kort fortalt ble de fargede celler bestemt i minst fem tilfeldige felt på 400 × forstørrelse i hver seksjon. Intensiteten av ECT2 immunoreaksjon i cellen ble gitt poeng som følger: 1 +, svak; 2+, moderat; og 3+, intense. Cellen nummer og fargeintensitet ble deretter multiplisert for å produsere en ECT2 IHC poengsum. Saker med en poengsum som overstiger 85,33 (høyeste poengsum for normalt vev) ble definert som ECT2-positive. To uavhengige patologer, som begge var maskert til pasientens kliniske status, gjort disse dommene.
Cellular spredning
For å undersøke effekten av shECT2 på celleproliferasjon, shECT2- og Mock-transfektert cellene ble sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler per brønn. På de angitte tidspunkter, ble cellene trypsinert og telles ved hjelp av en hemocytometer i tre eksemplarer.
Cell syklus analyse
For å bestemme cellesyklus distribusjon, ble cellene høstet, vasket med PBS, og analysert med CycleTEST Plus DNA reagenssett (Becton Dickinson, San Jose, California), i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble cellene konsentrert til 5,0 x 10
5-celler /ml ble sentrifugert ved 400 x g i 5 min ved romtemperatur. Deretter tilsatte vi 250 pl av løsning A (trypsin-buffer) til røret og forsiktig blandet. Vi lot trypsin for å reagere i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter la vi 200 ul Løsning B (trypsin inhibitor og RNase i en buffer) og forsiktig bland. Vi inkuberes med blandingen i 10 minutter ved romtemperatur. Til slutt la vi 200 ul Solution C (propidiumjodid- flekken løsning). Og vi forsiktig blandet som ovenfor, og inkuber i 10 min i mørke på is. Strømningscytometrisk bestemmelse av DNA-innholdet ble analysert ved et FACSCalibur (Becton-Dickinson). De fraksjoner av cellene i G0-G1, S og G2-M faser ble analysert ved hjelp av Flow Jo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon).
Statistisk analyse
statistisk signifikans av ECT2 uttrykk nivåer ble evaluert med Fishers eksakte test eller Mann-Whitney
U
test.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Takk
Vi takker Lynda C. Charters for redigering av dette manuskriptet, og legene. Hiroshi Nakajima og Hiroaki Tori, Institutt for molekylær genetikk, Graduate School of Medicine, Chiba University, for nyttige diskusjoner og kritisk gjennomgang av manuskriptet.
