Abstract
Thyroid cancer-en (TC-1), en innfødt uordnede protein, er mye uttrykt i virveldyr og overuttrykt i mange typer svulster. Men den eksakte rolle og reguleringsmekanisme i menneske ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er fortsatt uklart. I denne studien fant vi at TC-1 er sterkt uttrykt i NSCLC og at avvikende uttrykk er sterkt assosiert med NSCLC celleproliferasjon. Eksogent TC-1 overekspresjon fremmer celle proliferasjon, akselererer celle G1-til-S-fase-overgang, og reduserer apoptose i NSCLC. Knockdown til TC-1 inhiberer imidlertid NSCLC celleproliferasjon, syklus overgang, og apoptose motstand. Videre viste også vi at PD173074, som virker som en inhibitor av TC-1 i NSCLC, reduserer ekspresjon av TC-1 og inhiberer TC-1 overekspresjon mediert celleformering
in vitro
og
i vivo
. Likevel ble inhiberingen funksjon av PD173074 på NSCLC celleproliferasjon eliminert i celler med TC-1 knockdown. Disse resultatene antyder at PD173074 spiller en betydelig rolle i TC-1 overekspresjon mediert NSCLC celleproliferasjon, og kan være et potensielt mål for intervensjon forebygging av celleproliferasjon i NSCLC
relasjon:. Lei J, Li W, Yang Y Lu Q, Zhang N, Bai G, et al. (2014) TC-1 Overuttrykte Fremmer Cell Proliferation i Human Ikke-småcellet lungekreft som kan bli hemmet av PD173074. PLoS ONE 9 (6): e100075. doi: 10,1371 /journal.pone.0100075
Editor: Philip C. Trackman, Boston University Goldman School of Dental Medicine, USA
mottatt: 20 januar 2014; Godkjent: 21 mai 2014; Publisert: 18 juni 2014
Copyright: © 2014 Lei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til sykelighet verdensomspennende. I 2013 er ca 228 190 nye tilfeller forventes å skje i USA, sto for 13,74% av alle nye krefttilfeller. Enda mer faretruende, til tross for bruk av en multi-modalitet behandling, herunder kirurgiske inngrep, kjemoterapi og radioterapi, forblir lungekreft den ledende årsak til kreft dødelighet hos både menn og kvinner; faktisk, ca 159 480 pasienter dør av lungekreftrelaterte sykdommer i USA [1]. Derfor er nye behandlingsformer som oppstår fra en bedre forståelse av molekylære regulatorer av tumorvekst presserende behov. I de senere år har mange biomarkører som er involvert i utviklingen av lungekreft blitt undersøkt, men få studier har vurdert de funksjonene TC-en i lungekreft utvikling.
TC-en ble opprinnelig klonet fra subtraktiv hybridisering mellom en papillær thyroideakarsinom og dens omkringliggende normale tyroideavev [2]. Den uttrykkes ubikvitært over et bredt spekter av virveldyr som har høyest bevaring tvers arter fokusert på den åpne leserammen (ORF). Dets ekspresjon allestedsnærværende og sekvenskonservering antyder at TC-1 kan spille en viktig rolle i cellebiologi [3]. Det koder for et protein på 106 aminosyrer uten en identifisert funksjonelt domene, noe som indikerer at TC-1-protein er et medlem av nativt uordnede proteinet gruppe som har vist seg å utføre svinge funksjoner i cellesykluskontroll, spredning, metastase, og signaltransduksjon [3], [4]. Et økende antall studier har vist at TC-1 er sterkt uttrykt i flere karsinomer, og dens avvikende ekspresjon ble implisert i proliferasjonen av normale celler og kreftceller [5] – [9]. Margaret Sunde et al. bekreftet at TC-1 er en ny tumorigen protein forbundet med tyreoideacancer, og fant at overekspresjon av TC-1 i normale skjoldbrusk-celler økte deres formeringshastigheten, forbedret deres forankringsuavhengig vekst i myk agar, og reduserte deres apoptose hastighet [3] . TC-1, som ligger i den brystkreft følsomme genomisk region (8 p
11-12), ble funnet å være signifikant oppregulert på humane brystcancercellelinjer og vev, hvilket peker på dette proteinet i utvikling av brystkreft [8]. I magekreft, ble TC-1 funnet å være en av de oppregulert genene i begge cellelinjer og karsinom vev, og dets ekspresjon var sterkt korrelert med nesten alle clinicopathological variabler av aggressiv biologisk oppførsel av kreftformer, inkludert størrelse, avansert stadium, og dårlig overlevelse [10], [11]. Med uttrykket nivå og den biologiske funksjonen til TC-1 i NSCLC har hittil ikke vært klarlagt.
Nylig, Olivier E. Pardo et al. rapportert at selektive fibroblast-vekstfaktor-reseptor (FGFR) inhibitor PD173074 blokker spredning og vekst av klonogene to små celle lungecancercellelinjer (H69 og H510) i en doseavhengig måte og forhindrer at FGF-2-indusert chemoresistance. Overraskende, i H510 xenotransplantater, ble tumorvekst nedsatt med PD173074 behandling, noe som resulterer i en økning i median overlevelse sammenlignet med kontrollnarrebehandlede dyr, på samme måte som den effekt som observeres med den mono administrering av cisplatin; i H69 xenografter, PD173074 induserte en fullstendig respons som varte i minst 6 måneder i 50% av musene. I tillegg ble effekt av cisplatin signifikant potensert av sin samadministrering med PD173074. Disse effektene ble forklart ved det funn at PD173074 behandling minsket intratumoral proliferasjon og øke apoptose celle med en høy utseende av apoptotisk celledød markør caspase-3 [12]. Disse oppmuntrende funn fremme videre undersøkelser av effekten av PD173074 på NSCLC celler.
For å studere rollen til TC-1 i celle spredning og for å vurdere effekten av PD173074 på TC-1-mediert celleproliferasjon, i dette studien undersøkte vi forholdet mellom TC-1-ekspresjonen og celleproliferasjon i NSCLC ved immunhistokjemi, og effekten av PD173074 på TC-1-mediert celleproliferasjon ved hjelp av en rekke
in vitro
og
i vivo
tap-av-funksjon og få-of-funksjon studier.
Materialer og metoder
2.1 Etikk erklæringen
den menneskelige studien ble godkjent av Tangdu Hospital institusjonelle etikkomiteen, og forskningen studien ble gjennomført i henhold til bestemmelsene i Helsinki-deklarasjonen av 2008. Alle deltakerne gitt skriftlig informert samtykke før du deltar i studien.
Alle dyrestudier ble gjennomført med en protokoll godkjent av Tangdu Hospital Animal Care og bruk komité.
2,2 Immunohistochemistry og evaluering
Umiddelbart etter kirurgisk fjerning, prøver fra 122 pasienter med NSCLC ble dissekert av patologer og snap-frosset i flytende nitrogen. Kreftprøver ble tatt fra midten av knuter, og de vanlige prøvene ble hentet fra et område 5 cm fjernt fra knuter. Hver av prøvene ble fiksert med 4% paraformaldehyde og innebygd med parafin. Vevene ble oppskåret for å oppnå 4-mikrometer tykke seksjoner, og seksjonene ble avvokset med en serie av xylen og rehydrert gjennom en gradert serie av alkohol. Mikrobølgeovn antigen gjenfinning ble utført ved 750 V i 10 minutter i citrat-buffer (pH 6,0) for å forsterke immunreaktivitet. Endogen peroksidaseaktivitet av seksjonene ble blokkert med 3% hydrogenperoksidase i 30 minutter, og delene ble deretter inkubert med 5% normalt geiteserum i PBS i 30 minutter ved 25 ° C for å blokkere ikke-spesifikk antistoffreaksjon. Seksjonene ble vasket tre ganger med PBS i 10 minutter, inkubert med primære antistoffer (TC-1, 1:100, Gene Tex, USA; Ki-67, 1:300, Neomarkers Lab Vision Corp, CA, USA) over natten ved 4 ° C, og deretter farget med en Envision ™ Detection Kit (Dako, Danmark) etter produsentens anvisninger. Seksjonene ble deretter behandlet med 0,003% 3, 30-diaminobenzidin og kontra med hematoksylin.
Evalueringen av TC-1 uttrykk ble utført av to patologer uten tilgang til de kliniske data og var basert på både graden av TC-1 merking og intensiteten av TC-1-farging. Graden av TC-1 merking ble målt i henhold til prosentandelen av positive celler: 0 = 0-5%, 1 = 6-25%, 2 = 26-50%, 3 = 51-75% og 4 = 76- 100%. Intensiteten til TC-1-farging ble vurdert visuelt og stratifisert i fire grupper: 0 = negativ; 1 = svak; 2 = moderat; og 3 = intens. TC-1-stillingen ble bestemt som graden av TC-1 merking multiplisert med intensiteten av TC-1-farging: 0 = 0, = 1 + 1-4, 2 + = 5-8, 3+ = 9-12. De tumorer med en score på 0 ble ansett for å være TC-1-negative, mens de andre (1+ til 3+) ble betraktet som positive. Prosentandelene av Ki-67-reaktive tumorceller ble evaluert i en høyeffekts-feltet (400 x) ved telling mer enn 1000 tumorceller i tilfeldig utvalgte representative deler av tumoren [13].
2,3 Cell Culture
NSCLC A549, SPC-A-1, 95d, og NCI-H520-celler og tunica mucosa bronchiorum epitel 16HBE celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og holdt i vårt laboratorium . Cellene ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) og 100 enheter /ml streptomycin /penicillin og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2. For PD173074 forsøk ble A549 og A549- pLenti-shRNA1 celler dyrket i serumfritt og epidermal vekstfaktor (EGF) -fri medium (SITA: RPMI 1640 supplert med 5 ug /ml insulin, 10 ug /ml transferrin, 30 nmol /l natriumselenitt, og 0,25% bovint serumalbumin) supplert med PD173074 (oppløst i DMSO, Cayman, USA) ved en sluttkonsentrasjon på 1 μΜ. Den vekstmedier for kontrollcellene ble supplert med tilsvarende mengder DMSO uten inhibitor.
2,4 knockdown av TC-1 av RNA interferens
Fire RNAi kandidat målsekvenser til menneskelig TC-1 (tabell 1) ble designet og klonet inn i pGCSIL-GFP vektor av Shanghai GeneChem Co., Ltd (Kina). TC-1 shRNA1 (tabell 1) viste den beste knockdown effektivitet i 293T-celler kotransfektert med TC-1 og shRNA ekspresjonskonstruksjoner, som vist ved Western blot og immunofluorescens-analyser, og er således valgt for knockdown av det endogene TC-1 i NSCLC celler. Non-stanse-shRNA (NSRNA) ble brukt som en negativ kontroll. Oligonukleotidene som koder for TC-1 shRNA1 eller NSRNA sekvens og en løkke sekvens separere de komplementære domenene ble syntetisert og satt inn i pGCSIL-GFP ved Shanghai GeneChem Co., Ltd. (Kina). Det rekombinante virus ble pakket ved hjelp Lentivector Expression Systems (Shanghai GeneChem Co., Ltd., Kina). A549-celler ble infisert med en forbedret infeksjon løsning og dyrket i RPMI-1640 medium. En uke etter infeksjon, ble GFP-positive celler sorteres ved hjelp av et strømningscytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Den sortert GFP
+ celler (renhet 97%) ble deretter brukt i de påfølgende forsøkene
2,5 Lentivirus Bygging og transduksjon av celler
HA-TC1 konstruere. i pLenti-MÅL vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble beskrevet tidligere [14]. Kort fortalt, en oppføring klone inneholder full-lengde TC-1 ble først opprettet av vårt team med pENTR retnings TOPO kloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Etter oppføringen klon ble generert, ble LR rekombinasjon reaksjonen utført for å overføre genet i pLenti-MÅL-vektor for å skape uttrykket klonen. Den konstruksjon ble sekvensert for å sikre at sekvensene og orientering var riktige. Den lentivirus ble produsert av co-trans 293T celler med pLenti uttrykk konstruere ved hjelp av optimalisert emballasjen mix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). NCI-H520-celler ble transdusert med lentivirus, og den pLenti-LacZ-virus ble anvendt som en kontroll. Seleksjon ble initiert 48 timer etter infeksjon i RPMI-1640 medium med 10 pg /ml blasticidin i fravær av insulin eller EGF. Ved å nå samløpet, ble de valgte cellene passeres og serielt kultivert.
2,6 Real Time-Polymerase Chain Reaction
Den totale RNA ble ekstrahert ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , og cDNA ble syntetisert ved bruk av PrimeScript RT Master Mix (Takara, Japan). Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av en kontinuerlig fluorescens deteksjon av termosykler ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (ABI, CA, USA) med SYBR Premiks Ex Taq II (Takara, Japan). Målingene ble utført in triplo ved bruk av GAPDH som en endogen kontroll. QRT-PCR ble utført ved anvendelse av primere for TC-1 (5-AGCCACCAAGCCATC ATCAT-3, 5-TGTGTCGAAGTGGTAGCCATG-3) og GAPDH (5-AGGTCCACC ACTGACACGTT-3, 5-GCCTCAAGATCATCAGCA AT-3).
2.7 Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [10]. Celler ble høstet og vasket med PBS etter dyrkning i 48 timer med MG-132 (oppløst i DMSO, Cayman, USA) ved en sluttkonsentrasjon på 500 nM. Like protein mengder av prøvene ble separert ved 10% SDS-PAGE. Etter blotting på en nitrocellulosemembran (Amersham Biosciences, Piscataway, New York, USA), ble membranen inkubert i blokkeringsbuffer [Tris-bufret saltvann (TBS) inneholdende 0,1% Tween 20 og 5% skummet melk] i 1 time ved 25 ° C, og deretter med det primære antistoff (TC-1, 1:300, Gene Tex, USA, p-aktin, 1:500, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) ved 4 ° C over natten. Deretter ble membranen vasket tre ganger med TBS-T og inkubert med pepperrot-peroksidase-merket sekundære antistoffer i 2 timer ved 25 ° C. De immunreaktive bånd ble avslørt ved hjelp av en forbedret chemiluminescence system (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), og fotografier av båndene ble analysert ved hjelp FluorChemTMIS-8900 (Alpha Innotech Co, San Leandro, CA, USA).
2,8 MTT analysen
Cells (1 × 10
3 celler /brønn) ble sådd på 96-brønners plater. Ved en serie tidspunkter, ble 20 ul av MTT tilsatt til hver brønn, og cellene ble deretter inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Deretter, 150 ul dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma, USA) ble tilsatt til hver brønn. Platene ble ristet i 10 minutter, og den optiske tetthet (OD) verdi ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Bio-Rad Model 680, USA). Cellevekstkurver ble deretter trukket. Alle forsøkene ble gjentatt tre ganger, og gjennomsnittsverdiene ble vedtatt.
2,9 Plate kolonidannelse analysen
Cells (4 × 10
2 celler /brønn) ble sådd på seks -vel plater og spredt jevnt med litt risting platene. Cellene ble inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 til synlige kolonier ble vist. Koloniene ble fiksert med 95% etanol og farget med krystallfiolett farging løsning. De kolonier med mer enn 40 celler ble tellet ved bruk av et invertert mikroskop, og den kolonidannelse ble beregnet ved den følgende formel: Platekolonidannelse effektivitet = (antall kolonier /antall celler er innprentet) x 100%. Alle eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og gjennomsnittsverdiene ble tatt i bruk.
2,10 Flow Cytometry Analyse av cellesyklusen
Cellene ble høstet ved trypsinering og oppsamlet i sentrifugerør (2 x 10
6 celler /tube). Deretter ble 1 ml PBS og 2 ml dehydrert alkohol tilsatt til hvert rør (4 ° C over natten) for å fiksere cellene. Etter RNase og PI behandling, ble prosentandelen av celler i S-fase målt ved hjelp av en BD FACSAria flowcytometer (Franklin Lakes, NJ, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av ModFit LT programvare (Verity Software House, USA).
2,11 flowcytometrisystemer Analysis of Cell apoptose
Cellene ble høstet ved trypsinering og samlet i sentrifugerør (1 x 10
6 celler /tube). Etter to gangers vask med iskald PBS, ble cellene inkubert i 15 minutter ved romtemperatur i mørke i en oppløsning inneholdende PE-A og percp-cy5.5 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) for fluorescens-aktivert celle sorter (FACS) analyse ved hjelp av en FACS instrument utstyrt med en dublett diskriminerende modul (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest-programvare (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Ti tusen til 20 tusen celler ble analysert per prøve.
2.12
In vivo
tumorigenitet analysen
For tumorigenitet analysen, 4 til 6 uker gamle BALB /c athymiske nakne mus (Experimental Animal Center, The Forth Military Medical University, Xi’an, Kina) ble administrert subkutant 5 × 10
6 A549- pLenti-shRNA1, A549- pLenti-NSRNA, NCI-H520-pLenti-TC-1 eller NCI-H520-pLenti-lacZ celler. Dimensjonene av tumorene ble målt hver femte dag i en periode på 30 dager ved anvendelse av en lineær skyvelære. Svulsten volumet ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: V (mm
3) = a × b
2/2, hvor «a» er den største dimensjon og «b» er vinkelrett diameter. Hver gruppe inkluderte fem mus. Dyrene ble avlivet etter 30 dager, og svulstene ble målt og fjernet for videre studier.
2.13
In vivo
PD173074 Behandling analysen
Det er totalt 5 × 10
6 A549- pLenti-shRNA1 eller A549 celler (1:01 cellesuspensjon; Matrigel) ble implantert i flanken av 4- til 6-uker gamle Balb /c atymiske nakne mus. Når tumorene ble målbare, ble 50 mg /kg PD173074 /mus eller et tilsvarende volum av buffer alene administreres daglig i totalt 28 dager. I tillegg mottok musene eller ikke har fått to doser på 5 mg /kg cisplatin i.v. på dagene 1 og 15. tumorvolum ble overvåket ved bruk av en lineær skyvelære. Dyrene ble avlivet når tumorbyrde nådd 15 mm i alle dimensjoner, og overlevelse ble registrert ved hjelp av en Kaplan-Meier plot.
2,14 Statistical Analysis
Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil (SE). SPSS 13.0 programvarepakken (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) ble brukt for de statistiske analysene. Mann-Whitney U-test ble brukt for metriske data og Student
t
test ble brukt de sammenligninger av midlene mellom to grupper av måledata. Variansanalyse (ANOVA) ble brukt for sammenligninger av midler til flere grupper av måledata, og Student-Newman-Keuls (SNK) test ble brukt for videre sammenligninger av hver gruppe. Den log-rank (Mantel-Cox) test ble brukt til å analysere overlevelse kurven. AP verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
3,1 TC-1 er uttrykt på et høyt nivå og Associated sterkt med Cell Proliferation i Human Primary NSCLC
Å vurdere ekspresjon av TC-1 i humane primære NSCLC, immunohistokjemi ble utført under anvendelse av 122 prøver av NSCLC, inkludert 68 squamous cell carcinoma og 54 adenokarsinom prøver, som ble oppnådd fra 83 hanner og 39 hunner (tabell 2). TC-1 uttrykk var tydelig i 49 (72,06%) av plateepitelkarsinom prøver og 41 (75,93%) av adenokarsinom prøvene. Ekspresjonen av TC-1 ble hovedsakelig lokalisert i cytoplasma, men nukleær farging var også delvis til stede. I normalt lungevev, ikke-neoplastisk bronchial og alveolare epitel-celler var konsekvent ikke-reaktivt eller lav-reaktivt for TC-1 (fig. 1). I tillegg presenterte TC-1 uttrykk små forskjeller mellom kjønn, alder og histologiske undergrupper (P 0,05, tabell 2).
Intensiv immunhistokjemisk fargings for TC-1 i lunge adenokarsinomer (A) og plateepitelkarsinom (B). Ikke-reaktivitet for TC-1 i normale alveolære epitelceller (C). (Forstørrelse x 200).
Sammenhengen mellom TC-1 uttrykk og celleproliferasjon av NSCLC ble analysert ved å påvise uttrykk for Ki-67. Som oppsummert i tabell 2, var det en statistisk signifikant forskjell mellom de høy-spredning gruppe (Ki-67-merkeindeksen 10%), og den lave spredning gruppe (Ki-67-merkeindeksen ≤10%) i både lunge plateepitel cellekreft og adenokarsinom prøver (P 0,05), noe som tyder på at TC-1 uttrykk er sterkt korrelert med celleproliferasjon av NSCLC
3.2 Generering av Stabile kloner av NSCLC Cells overekspresjon eller Downregulating TC-1
.
for å studere effekten av TC-en avvikende uttrykk på NSCLC celler, qReal-Time PCR og western blotting ble utført ved hjelp av menneske NSCLC cellelinjer A549, SPC-A-1, 95D, og NCI-H520, og 16HBE -cellelinjen ble brukt som en kontrollgruppe. Som vist på fig. 2A, ekspresjonsnivået av TC-1 i A549, SPC-A-1, og 95d cellene var høyere enn den som oppnås i 16HBE cellene, og ekspresjonsnivået av TC-1 i NCI-H520-celler var lavere enn det som ble observert i de 16HBE celler. Basert på disse resultatene, ble A549 og NCI-H520 funnet å være representative celler som oppviser den høyeste og et lavere nivå av ekspresjon TC-1 og ble valgt for videre studier. Deretter ble pLenti-shRNA1 transfektert inn i A549-celler, og pLenti-TC-1 ble transfektert inn i NCI-H520-celler. Stabile kloner ble isolert etter klone screening av fluorescens-aktivert celle sortering eller blasticidin hhv. Den qReal-Time PCR og Western blotting resultater viste at TC-1-ekspresjon ble betydelig redusert eller økt i de behandlede celler sammenlignet med kontrollen, mens den negative kontroll fremviste ikke noen endring i nivået av TC-1-ekspresjon (Fig. 2B og 2C).
QRT-PCR og western-blotting viste at A549, SPC-A-1, og 95D-celler uttrykker høye nivåer av TC-1 mRNA og protein, og som NCI-H520-celler uttrykker lave nivåer av TC -1 mRNA og protein (A). QRT-PCR og Western blotting resultater som er vist i B og C, henholdsvis, viser at TC-1 mRNA og protein er betydelig nedregulert i A549-pLenti-shRNA1 celler og signifikant oppregulert i NCI-H520-pLenti-TC-1-celler sammenlignet med kontrollene. Kolonnene representerer gjennomsnittet av de relative mRNA mengde fra minst tre uavhengige eksperimenter. Søylene viser SE. * Indikerer statistisk signifikante endringer (P 0,05). Blant fem grupper (A) eller tre grupper (B, C)
3,3 TC-1 Fremmer celleproliferasjon og Cell Cycle Overgang og Hemmer Cell apoptose i NSCLC
in vitro
for å undersøke funksjonen av TC-1 uttrykk i NSCLC celleproliferasjon, tap-funksjon og få-av funksjon studier ble utført. Spesielt, i MTT-assayet, transfeksjon av pLenti-TC1 transfeksjon forbedret spredning av NCI-H520-celler sammenlignet med kontrollceller. Alternativt TC1 knockdown hjelp TC1-shRNA1 viste signifikant nedregulering av spredning i A549-pLenti-shRNA1 celler sammenlignet med NSRNA-transfekterte celler (fig. 3A). Videre er de koloninumrene til de pLenti-TC-1 og pLenti-NS-RNA-grupper var høyere enn de som oppnås for de pLenti-lacZ og pLenti-shRNA1 grupper, henholdsvis (fig. 3B). Disse resultater antyder at TC-1 fremmer celle proliferasjon i NSCLC
in vitro
.
(A) MTT-analyse. Den optiske tetthetsverdi ble påvist ved en rekke av tidspunkter for å evaluere celleproliferasjon. (B) Plate kolonidannelsesbestemmelsen. Koloniene ble farget med krystallfiolett farging løsning og telles, og klonen dannelseshastigheten ble deretter beregnet. (C) cellesyklusanalyse. Prosentandelen av celler i S-fasen ble målt ved anvendelse av et flowcytometer, og dataene ble analysert ved anvendelse av ModFit LT-programvaren. (D) Cell apoptose assay. Cellene ble inkubert i mørke i en oppløsning inneholdende PE-A og PerCP-Cy5.5. Prosentandelen av apoptotiske celler (nedre høyre kvadrant) ble analysert ved bruk av en FACS utstyrt med en dublett diskriminerende modul, og dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest-programvare. Kolonnene representerer gjennomsnittlig kolonidannelseshastigheten (B), S-fase cellerate (C), og apoptose cellehastighet (D) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Søylene viser SE. * Indikerer statistisk signifikante endringer (P 0,05) blant tre grupper
cellesyklus distribusjonsfase ble målt ved flowcytometri.. Resultatene viste at prosentandelen av celler i S-fasen ble signifikant økt etter behandling med pLenti-TC1, sammenlignet med det som ble oppnådd etter behandling med pLenti-LacZ. I motsetning til dette, prosentandelen av celler i S-fasen betydelig redusert etter behandling med pLenti- shRNA1 sammenlignet med den som oppnås med pLenti-NSRNA (Fig. 3C). Disse resultatene indikerer at TC-1 fremmer G1-til-S-faseovergangen.
Videre er effekten av TC-1 på NSCLC celle apoptose ble analysert ved flow-cytometri. Som vist på fig. 3D, cellene transfektert med pLenti-TC-1 som hadde lavere apoptotiske hastigheter sammenlignet med celler transfektert med pLenti-LacZ, og cellene transfektert med pLenti-shRNA1 vises høyere apoptotiske hastigheter sammenlignet med celler transfektert med pLenti-NSRNA, noe som tyder på at TC -1 hemmer celle apoptose i NSCLC.
3,4 TC-1 Fremmer NSCLC Cell Proliferation
in vivo
for å vurdere funksjonen av TC-1 uttrykk i NSCLC celleproliferasjon
in vivo
, en
in vivo
tumorigenicity analysen ble utført. Dimensjonene av tumorene ble målt hver femte dag i en periode på 30 dager (fig. 4B og 4D). Ved slutten av eksperimentet ble musene avlivet og tumorene ble fjernet og fotografert (Fig. 4A og 4C). Som vist på fig. 4, våre tumorgenisitet analyseresultatene tyder på at oppregulering av ekspresjonsnivået av TC-1 fremmer celle-proliferasjon
in vivo
, mens knockdown av ekspresjonsnivået av TC-1 inhiberer celleproliferasjon
in vivo
.
Subkutan tumormodell (n = 5). Cellene ble injisert subkutant i flanken av atymiske nakne mus, og tumorvolumet ble registrert hver fem dager (C, D). Musene ble avlivet 30 dager etter injeksjon, ble tumorene fjernet, og fotografier ble tatt (A, B).
Del av hver enkelt subkutan nodul ble seksjonert og utsatt for immunhistokjemi for Ki-67. Våre resultater viste at det var en signifikant forskjell i antallet Ki-67-reaktive tumorceller i de subkutane knuter mellom de to gruppene (Ki-67 indeksene til subkutane knuter var følgende: A549- pLenti-NSRNA, 68,98 ± 2,56%, A549- pLenti-shRNA1, 28,63 ± 2,38%, P 0,05; NCI-H520- pLenti-TC-1, 86,26 ± 3,16%, NCI-H520- pLenti-LacZ, 51,34 ± 1,78%, P 0,05) . Disse funnene tyder på at TC-en vesentlig bedre spredning kapasitet på NSCLC celler
in vivo
.
3,5 PD173074 Reduserer Uttrykk for TC-en i en dose-avhengig måte over en viss rekkevidde
for å teste om tilsetting av PD173074 påvirker uttrykket av TC-1 i NSCLC ble A549 og A549-pLenti-shRNA1 celler i SITA behandlet med PD173074. Resultatene av RT-PCR og western-blotting viste at ekspresjonsnivået av TC-1 ble redusert med en økning i konsentrasjonen av PD173074 og jevner ut når konsentrasjonen av PD173074 når 1 μΜ (Fig. 5). Konsentrasjonen av en μΜ ble dermed valgt for videre studier.
QRT-PCR og Western blotting resultater viser at ekspresjonsnivået av TC-1 ble redusert med en økning i konsentrasjonen av PD173074 og flater ut når konsentrasjonen av PD173074 når 1 μΜ i A549 (A) og A549-pLenti-shRNA1 (B) celler. Kolonnene representerer gjennomsnittet av de relative mRNA mengde fra minst tre uavhengige eksperimenter. Søylene viser SE. * Indikerer statistisk signifikante endringer (P 0,05). Blant fem grupper
3,6 PD173074 hemninger av celleproliferasjon, Cycle Transition, og apoptoseresistens Avhenger av TC-1 Expression nivå
in vitro
for å studere effekten av PD173074 på TC-1-mediert celle proliferasjon i NSCLC, en MTT-analysen ble platen kolonidannelsesbestemmelsen, cellesyklusanalyse, og celle apoptose analyse utført. Som vist på fig. 6A, har PD173074 behandling en markert innflytelse på celle-vekstkurver for de ikke-transfekterte celler, som vist ved forskjellen mellom A549 + PD173074 gruppe og A549-gruppe, men har liten innflytelse på celle-vekstkurvene til de transfekterte cellene, som indikert av forskjellen mellom A549-pLenti-shRNA1 + PD173074 gruppen og A549-pLenti-shRNA1 gruppe. Et lignende resultat ble observert i platen kolonidannelse analyse: Det var en signifikant forskjell i kolonidannelseshastigheten mellom A549 + PD173074 gruppe og A549-gruppen, men bare små forskjeller i kolonidannelseshastigheten ble observert mellom A549-pLenti- shRNA1 + PD173074 gruppen og A549-pLenti-shRNA1 gruppe (fig. 6B). Som vist på fig. 6C, prosentandelen av celler i S-fasen i populasjoner av PD173074-behandlede A549-celler, A549-celler, PD173074-behandlede A549-pLenti-shRNA1 celler og A549-pLenti-shRNA1 celler ble 29,47 ± 0,62%, 49,5 ± 1,89% , 28,02 ± 0,97%, og 29,5 ± 1,02%, henholdsvis. Selvfølgelig, det var en signifikant forskjell mellom A549 + PD173074 gruppen og A549-gruppen, men bare en liten forskjell mellom A549-pLenti-shRNA1 + PD173074 gruppen og A549-pLenti-shRNA1 gruppe. Som vist på fig. 6D, de apoptotiske hastighetene til PD173074-behandlede A549-celler var betydelig høyere enn den for A549 celler; Men det var ingen markant forskjell i apoptotiske hastigheten mellom de PD173074 behandlet A549-pLenti-shRNA1 celler og A549-pLenti-shRNA1 celler. Tatt sammen indikerer disse data at PD173074 inhiberer TC-1-mediert celle proliferasjon, cellesyklus overgang, og celle apoptose motstand når TC-1 er sterkt uttrykt eller moderat, men ikke når den er ringe uttrykkes.
(A ) MTT analyse. Den optiske tetthetsverdi ble påvist ved en rekke av tidspunkter for å evaluere celleproliferasjon. (B) Plate kolonidannelsesbestemmelsen. Koloniene ble farget med krystallfiolett farging løsning og telles, og klonen dannelseshastigheten ble deretter beregnet. (C) cellesyklusanalyse. Prosentandelen av celler i S-fasen ble målt ved anvendelse av et flowcytometer, og dataene ble analysert ved anvendelse av ModFit LT-programvaren. (D) Cell apoptose assay. Cellene ble inkubert i mørke i en oppløsning inneholdende PE-A og PerCP-Cy5.5. Prosentandelen av apoptotiske celler (nedre høyre kvadrant) ble analysert ved bruk av et FACS utstyrt med en dublett diskriminerende modul, og dataene ble analysert ved hjelp av Cellquest-programvare. Kolonnene representerer gjennomsnittlig kolonidannelseshastigheten (B), S-fase cellerate (C), og apoptose cellehastighet (D) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Søylene viser SE. * Indikerer statistisk signifikante endringer (P 0,05). Mellom A549 gruppen og A549 + PD173074 gruppe
3,7 PD173074 hemninger av celleproliferasjon, Cycle Transition, og apoptoseresistens Stol på TC-1 Expression
