Abstract
I løpet av det siste tiåret, montering bevis har innblandet menneske neurotropic virus JC-virus i patologi for tykktarmskreft. Men mekanismene for JC-virus-mediert onkogenese er fortsatt ikke helt bestemt. En kandidat til å mediere slike effekter er den virale tidlig transkripsjons-produktet T-antigen, som har evnen til å inaktivere cellesyklusregulerende proteiner, slik som p53. I Medulloblastomas, har T-antigen er vist å binde Wnt signalveien protein β-catenin; Men effekten av dette samspillet på nedstrømscellesyklusregulerende proteiner forblir ukjent. I lys av disse observasjonene, undersøkte vi sammenslutning av T-antigen og kjernefysisk β-catenin i tykktarm kreft tilfeller og virkningene av dette komplekset i aktivering av transkripsjon og cellesyklus regulatorer c-myc og cyclin D1
in vitro
. Genamplifikasjon viste nærvær av virale sekvenser i 82,4% av tilfellene, og vi har oppdaget ekspresjon av T-antigen i 64,6% av tilfellene ved immunhistokjemi. Videre har vi funnet at T-antigen og β-catenin samlokalisert i kjernen av tumorceller, og vi bekreftet den fysiske binding mellom disse to proteinene
in vitro
. Den kjernefysiske tilstedeværelse av T-antigen og β-catenin resulterte i betydelig forbedring av TCF-avhengige promotor-aktivitet og aktivering av β-catenin nedstrøms mål, c-Myc og Cyclin D1. Disse observasjonene gir ytterligere bevis for en rolle JCV T-antigen i feilregulering av Wnt signalveien og i patogenesen av tykktarmskreft
Citation. Ripple MJ, Parker Struckhoff A, Trillo-Tinoco J, Li L, Margolin DA, McGoey R, et al. (2014) Aktivering av c-myc og cyclin D1 av JCV T-antigen og β-catenin i Colon Cancer. PLoS ONE ni (9): e106257. doi: 10,1371 /journal.pone.0106257
Redaktør: Shao-Jun Tang, University of Texas Medical Branch, USA
mottatt: Mai 10, 2014; Godkjent: 30 juli 2014; Publisert: 17.09.2014
Copyright: © 2014 Ripple et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet var mulig takket være innvilge P20 RR021970 fra National Institutes of Health, til LDV. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal karsinom (CRC) er fortsatt et alvorlig helseproblem over hele verden til tross for fremskritt i diagnostikk og behandling. Den rangerer tredje i total kreftforekomst og er den nest vanligste årsaken til kreftdødelighet i USA hvor det er anslagsvis 140.000 nye tilfeller og 50000 CRC-relaterte dødsfall hvert år [1]. Risikoen for å utvikle sporadisk tykktarmskreft i befolkningen generelt er 5%, men denne forekomsten øker med alderen på grunn av opphopning av genetiske og epigenetiske forandringer [2]. Noen av disse endringene kan være forårsaket av miljøfaktorer, inkludert virus, som har blitt implisert i en rekke andre typer kreft. Flere uavhengige undersøkelser har vist at ca. 20% av alle krefttilfeller er forårsaket av smittestoffer [3], [4]. Et slikt middel er den menneskelige neurotropic JC virus (JCV), et medlem av
Polyomaviridiae
familien, som også inkluderer SV-40, BK virus (BKV) og den nyoppdagede Merkel Cell polyomavirus (MCPyV), fant å bli klonalt integreres i en høy prosentandel av Merkel karsinomer. JCV er etablert som den utløsende agent for progressiv multifokal leukoencefalopati (PML), en demyeliniserende sykdom som påvirker HIV-pasienter [5], og mer nylig i pasienter som gjennomgår immunmodulerende terapi [6]. I løpet av det siste tiåret, har flere laboratorier vist at JCV er assosiert med forskjellige humane kreftformer, inkludert hjernesvulster [7], [8], lungekreft [9], og ondartede sykdommer i de øvre og nedre fordøyelseskanalen [10] – [12 ].
JCV er en allestedsnærværende virus som infiserer en stor andel av befolkningen. Ifølge Sero-epidemiologiske studier, primærinfeksjon med JCV oppstår i tidlig barndom og over 70-90% av voksne individer er positive for anti-JCV-antistoffer [13], [14]. Selv om primær infeksjon er asymptomatiske, er det foreslått rute for overføring via luftveiene, hvoretter JCV etablerer en latent infeksjon i nyrene. I ca 30% av friske seropositive individer, er JCV skur i urinen under normale forhold [15], [16]. Som et resultat, har intakte JCV partikler blitt isolert fra prøver av rå urban kloakk fra hele verden, [17], [18], som sammen med det funn av virus-DNA i epitelceller fra den øvre og nedre fordøyelseskanalen [19], antyder en ekstra inngangspunkt for viruset gjennom mage-tarmkanalen via eksponering for forurenset vann eller mat. Viktigere, Bofill-Mas,
et al
viste at viruspartikler isolert fra kloakk forble intakt etter behandling ved en pH-verdi på 1 til 30 minutter, noe som indikerer at inntak av forurenset vann eller mat kan være tilstrekkelig for JCV infeksjon av gastrointestinaltraktus [20]. Mange studier siden, har vist nærvær av JCV genomiske sekvenser og ekspresjon av T-antigen i vev fra gastrointestinale tumorer, inkludert spiserørskreft [11], gastrisk karsinom [12], [21], [22], sporadisk adenomatøse polypper [ ,,,0],23], og kolorektal adenokarsinomer [10], [24] – [30]
JCV genom er omtrent 5,2 kb i størrelse og kan deles inn i tre regioner:. tidlig viral genomisk region (EVGR), sen viral genomisk region (LVGR), og den ikke-kodende region kontroll (NCCR), som inneholder replikasjonsorigo, og ligger mellom tidlige og sene genomiske regioner. Den EVGR koder for et kraftig onkogene protein, stort T-antigen, mens den LVGR koder for de virale kapsidproteiner VP1, VP2 og VP3, samt Agnoprotein, en liten tilleggsprodukt [31]. Den aktuelle modellen av JCV-mediert onkogenese innebærer integrering av deler av JCV genomet, spesielt T-antigen-genet, som er foreslått for å øke risikoen for utvikling av kreft på grunn av den etterfølgende ekspresjon av T-antigen. Til støtte for denne modellen, Theodoropoulos
et al
viste at JCV virusmengden var 10- til 50- ganger høyere i kolon adenomer og adenokarsinomer i forhold til matchet normalt vev [32]. I tillegg Coelho
et al
nylig vist at CRC vevet har en betydelig høyere relativ frekvens av JCV genomiske sekvenser enn ved normal slimhinne og fjernt normal slimhinne [33].
transformerende evner av JCV T -Antigen
in vitro
er godt kjent [34].
In vivo
T-antigen forårsaker en rekke sentrale nervesystemet svulster når injisert inn i hjernen av gnagere og ikke-menneskelige primater, alt fra Medulloblastomas til Glial svulster [35] – [37]. Transgene mus som uttrykker JCV T-antigen fra NCCR utvikle svulster i nevroektodermal opprinnelse, inkludert Medulloblastomas, glia svulster, og maligne perifere nerve slire svulster [38] – [40]. Denne transformasjonsprosessen skjer gjennom interaksjon av T-antigen med sentrale cellesyklusregulerende proteiner, inkludert p53, Rb, og den sentrale signalmolekyl i Wnt signalveien, β-catenin [41] -. [43]
β-catenin er ofte dysregulerte i tykktarmskreft [44], [45]. Nivåer av β-catenin blir kontrollert av sin ødeleggelse kompleks, bestående av proteiner APC, Axin, gsk3, og CK1, som markerer den for ubiquitinering. Mutasjoner i komponentene i ødeleggelse komplekset kan resultere i avvikende nukleær lokalisering av β-catenin, et veletablert mekanismen for karsinogenese i kolorektal cancer [44], [46] som fører til aktivering av wnt veien målgener i fravær av Wnt signal og resulterer i ukontrollert celleproliferasjon [2]. Mens Wnt veien aktiveres ved genetiske mutasjoner i over 90% av tykktarm kreft tilfeller [47], kjernefysisk β-catenin uttrykk er bare påvist hos ca. 50% av tilfellene [48], noe som tyder på at det er flere faktorer som bidrar til den kjernefysiske lokalisering av β-catenin i tykktarmskreft. Det har blitt demonstrert at JCV T-antigen har evnen til å binde β-catenin gjennom en interaksjon med den C-terminale ende av β-catenin [41], og at T-antigen kan stabilisere β-catenin med glioblastom-celler [49]. I tillegg har t-antigen et klassisk nukleære lokaliseringssignal (NLS) og er sterkt uttrykt hovedsakelig i kjernen av neoplastiske celler [10], [42], [50]. Derfor, søkte vi å bestemme virkningen av JCV T-antigen på den nukleære lokalisering av β-catenin og rollen til dette komplekset i aktivering av β-catenin målgener som en mekanisme i utvikling og progresjon av kreft i tykktarmen.
i denne studien, måler vi utbredelsen av T-antigen genomiske sekvenser og protein uttrykk i menneskelige kolon kreft vev ved hjelp av en samling av godt karakterisert biopsiprøver. Viktigere, viser vi en sammenslutning av T-antigen og kjernefysisk β-catenin i humane tarmkreftprøver og forseggjort på denne foreningen ved å belyse de molekylære virkningene av dette samspillet i feilregulering av Wnt signalkaskade og aktivering av β-catenin mål ved hjelp tykktarm kreft cellelinjer.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Det er totalt 113 avidentifiserte parafininnstøpte prøver av tykk- og endetarmskreft og pre-neoplastiske polypper ble samlet inn fra patologi arkiver i følgende institusjoner: LSUHSC-New Orleans (34 prøver) og Ochsner Clinic (79 prøver). Svulstene var var histologisk gradert og immunohistochemically tegnes ifølge WHO klassifisering av svulster i mage-tarmkanalen.
DNA Extraction and Analysis
En dedikert mikrotom ble brukt til § parafinblokker for å unngå forurensning. Videre er blokken og bladholderen ble periodisk autoklavert, og en ny, engangsblad ble anvendt for hver prøve. DNA ble ekstrahert fra omtrent 10 deler av 10 um i tykkelse fra hver av de vevsprøver ved hjelp av QIAamp Tissue Kit, i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen). PCR-amplifisering av T-antigen-genet ble utført ved anvendelse av PEP1 og PEP2 primere (nukleotider 4255-4272 og 4408-4427, henholdsvis), som forsterker sekvenser i den N-terminale region av JCV T-antigen (PEP1 sekvens: AGTCTTTAGGGTCTTCTACC; PEP2 sekvens : AGGTGCCAACCTATGGAACA). For forsterkning av kontrollområdet (CR), brukte vi de NCRR1 og NCRR2 primere, tilsvarende nukleotider 4993-5004 og 258-279, henholdsvis (NCRR1 sekvens: GCAAAAAAGCGAAAAACAAGGG; NCRR2 sekvens: CAGAAGCCTTACGTGACAGCTGG). Amplifikasjon ble utført på 250 ng templat-DNA med den FailSafe PCR-system (Epicentre) i et totalt volum på 25 pl. PCR ble utført ved følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 62 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek. Som en avslutning trinn, ble forlengelse tidspunktet for den siste syklus økes til 7 min. Prøvene forsterket i fravær av templat-DNA tjente som en negativ kontroll, mens DNA ekstrahert fra T-antigen-positive BSB8-celler ble anvendt som en positiv kontroll for hver enkelt prosedyre. Southern blot ble utført ved oppløsning av 10 ul av hver PCR-reaksjon på en 2% agarosegel. Gelen ble deretter behandlet i 15 minutter hver med 0,2 M HCl til depurinering, 1,5 M NaCl /0,5 M NaOH for denaturering, og 1,5 M NaCl /0,5 M Tris-HCl (pH 7,4) for nøytralisering, etterfulgt av overføring av de amplifiserte fragmentene fra gelen til nylonmembraner (Hybond-N, Amersham). Membranene ble deretter pre-hybridisert i 1 time i EasyHyb løsning (Roche), fulgt av hybridisering i den samme oppløsning inneholdende 2 ug DIG-merket oligonukleotid som er spesifikt for JCV T-antigen (nukleotider 4304-4405) over natten. Primere som brukes til syntese av DIG-merket probe er PEP INT 1 (TTGGGATCCTGTGTTTTCATC) og PEP INT 2 (AATGGGAATCCTGGTGGAAT). For CR sonde vi benyttet primere fra nukleotider 62-81. Prober ble syntetisert ved hjelp av DIG DNA Merking og Detection Kit (Roche). Membraner ble hybridisert over natten, vasket og utviklet ved hjelp av DIG Vask og Block Buffer Set følge produsentens instruksjoner (Roche).
DNA-sekvensering av kontrollområdet ble utført med ABI Prism 3730x /analysator DNA. For forsterkning av DNA fra husholdningsgenet, GAPDH ble følgende primere brukes.
5 «TTC TCC CCATTC CGT CTT CC 3» og 3 «GTA CAT GGT ATT CAC CAC CC 5»
Histologisk og Immunhistokjemisk analyse
Parafin-embedded tissue tidligere fiksert i 10% bufret formalin ble delt i fire-mikrometer tykkelse og monteres på ladede lysbilder. Snittene ble plassert i en ovn ved 65 ° C for å smelte parafin og deretter deparaffinized i tre endringer xylen i 30 minutter hver. Snittene ble deretter rehydrert gjennom en gradert serie av alkoholer opp til vann, og ikke-enzymatisk antigen gjenfinning ble utført i 0,01 M natriumcitrat (pH 6,0) ved 97 ° C i en vakuumovn i 35 min. Etter en avkjølingsperiode på 25 min ble snittene skylt med PBS, og endogen peroksydase ble stoppet ved inkubering av lysbildene i metanol /3% H
2o
2 i 30 min ved romtemperatur. Seksjonene ble blokkert i 2% hesteserum og inkubert over natten med primære antistoffer ved romtemperatur i et fuktet kammer. Antistoffene som anvendes til å påvise virale proteiner inkludert et mus monoklonalt antistoff mot SV40 stort T-antigen som kryssreagerer med JCV T-antigen (klon pAb416, 1:100 fortynning, Calbiochem) og et mus monoklonalt anti-β-catenin antistoff (klon E -5, 1:100 fortynning, Santa Cruz Biotechnology). Etter skylling delene i PBS, ble platene inkubert i 1 time ved romtemperatur med biotinylerte anti-muse sekundære antistoffer, og deretter ble skylt i PBS. Vevet ble deretter inkubert med avidin-biotin-peroksidase-komplekser i 1 time ved romtemperatur, i henhold til produsentens instruksjoner (Vector Laboratories), og til slutt, ble seksjonene utviklet med en 3,3′-diaminobenzidin-substrat (Sigma), motfarget med hematoxylin, og coverslipped med Permount (Fisher). For å vurdere den fraksjon av immunolabeled celler i prøver fra hver pasient tilfelle,-merkeindeksen definert som prosentandelen av positive celler av det totale antall tumorceller tellet, ble bestemt.
dobbeltmerking Immunofluorescence
for immunfluorescens og dobbel merking av parafin innebygde seksjoner, deparaffinization, antigen henting, endogen peroksidase leskende og blokking ble utført som beskrevet ovenfor. For immunofluorescent dobbel merking av HCT116-celler i kultur ble cellene vasket med PBS, fiksert i kald aceton, og blokkert i PBS inneholdende 5% hesteserum og 0,1% BSA i 2 timer. Seksjoner eller celler ble deretter inkubert med mus-anti-T-antigen-antistoff (klon pAb416, 1:100 fortynning, Oncogene Science) og kanin-anti-β-catenin antistoff (klon D13A1, 1:100 fortynning Cell Signaling) i 16 timer fulgt av vasking i PBS og inkubering i anti-muse-rhodamin-antistoff og anti-kanin-antistoff Fluorescein (1:200 fortynning; Vector Laboratories). Til slutt, delene ble vasket i PBS og montert i vandig montering media med DAPI (Vector Laboratories), og visualisert i en konfokal mikroskop (Olympus FV1000).
Transient Transfeksjon og Luciferase konstruerer
HCT116-celler ble vennlig levert av Dr. Hamid Boulares. Cellene ble transfektert bruker Xtreme Gene-HP (Roche). Følgende konstruksjonene ble brukt for luciferase analysene: M72 Super 16x TOPflash reporter konstruere: Addgene plasmid 17165; M51 Super 8x FOPflash: Addgene plasmid 12457; c-myc arrangøren: Addgene plasmid 16595; Cyclin D1-promotor: Addgene plasmid 32727. Disse rapportør konstruksjoner ble transfektert alene eller sammen med pcDNA-T-antigen og /eller pcDNA-β-catenin og analysert for luciferase-aktivitet ved anvendelse av en Luciferase Assay System (Promega) ved 24 timer etter transfeksjon.
protein Extraction, Co-Immunpresipitasjon og analyse
cytoplasmatiske og kjernefysiske proteinekstrakter fra HCT116-celler ble samlet inn ved hjelp cytoplasma lysebuffer og kjernefysiske lysis buffer som tidligere beskrevet [51]. I korthet ble cellene trypsinert, pelletert ved 2000 g i 5 minutter, og re-suspendert i 500 ul lyseringsbuffer cytoplasmisk i 10 minutter på is. Etter lysering av cellemembranen, ble kjernene pelletert ved 14000 g i 10 minutter. Cellekjernene ble vasket en gang i cytoplasmisk lyseringsbuffer, pelletert og lysert i 250 ul lyseringsbuffer atom i 20 minutter ved 4 ° C med risting. 500 ug total proteinekstrakt ble inkubert med 10 ug anti-T-antigen eller anti-β-catenin antistoff over natten ved 4 ° C med risting. Antigen-antistoff-kompleksene ble deretter immunopresipitert med protein A /G magnetiske kuler (Pierce), vasket i HNTG buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0,1% Triton X-100), denaturert og analysert ved hjelp av SDS-PAGE .
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til Louisiana State Universitys Institutional Review Board retningslinjer og godkjenning. Alle 113 parafininnstøpte humane prøver av kolorektal karsinom og pre-neoplastiske polypper, som ble samlet inn fra patologi arkiver LSUHSC New Orleans (34 prøver) og Ochsner Clinic (79 prøver). The Louisiana State University Institutional Review Board (IRB) fravikes behovet for skriftlig samtykke, som prøvene er arkivering, avidentifisert og følge under NIH retningslinjer for fritak som vev som vil bli forkastet, og kan ikke spores tilbake til pasientene (IRB Protocol # 8077).
Resultater
uttrykk for T-antigen og β-catenin i tykktarm kreft prøver
Den tidlige transcriptional produkt av JCV, T-antigen, er et godt -kjent potent onkogene protein, som er blitt detektert i en rekke av tumorer. For å etablere tilstedeværelse av JCV T-antigen, utførte vi immunhistokjemiske eksperimenter i totalt 113 formalinfiksert, parafininnebygd tilfeller av tykktarmskreft fra to av New Orleans største medisinske institusjoner. De fleste av disse prøvene inneholdt normale slimhinner, pre-neoplastiske polypper og begge
in situ Hotell og invasive carcinoma. Vi har funnet ekspresjon av T-antigen ved immunhistokjemi i kjernen av tumorceller i 73 av prøvene (64,6%). Interessant, T-antigen var også til stede i kjernen av epitelceller fra pre-neoplastiske polypper, men fullstendig fraværende i normale kolonepitelet (figur 1, venstre panel).
Immunhistokjemi i områder med normal kolonepitelet er negativ for T-antigen, mens β-catenin er uttrykt i cytoplasma og membranen (paneler og B). T-antigen ekspresjon er funnet i kjernen av epitelceller i polypper og neoplastiske celler i områder av invasive svulster (paneler C og E, respektivt). Sammenhengende deler av de samme tilfeller viser at β-catenin ligger nå til cytoplasma og kjerner av epitelial tumorceller og (paneler D og F henholdsvis). I T-antigen negative tilfeller er imidlertid fortsatt β-catenin i cytoplasma (paneler G og H). Statistisk analyse viser at 67,6% av T-antigen positiv tykktarm kreft tilfeller uttrykke kjernefysisk β-catenin, mens bare 40,4% av T-antigen negative tilfeller uttrykke kjernefysisk β-catenin (G; p = 0,006) (Panel I). Den relative prosentandelen av positive kjerner for β-catenin i et avsnitt ble scoret på en skala fra 0-4. T-antigen positive tilfeller viste signifikant flere kjerner positive for β-catenin enn T-antigen negative prøver (F; * p 0,05) (Panel J). Dobbel merking immunfluorescens demonstrerer ko-lokalisering av T-antigen (rhodamin) og β-catenin (Fluorescein) i kjernen av neoplastiske celler i en lomme av neoplastiske celler under en epitelial foring av T-antigen-negative celler, hvori β-catenin forblir cytoplamic (Panel K). Original forstørrelse av alle immunhistokjemi paneler er 600x, og immunfluorescens er 1000x.
Tidligere har vi vist at i Medulloblastomas, er T-antigen i stand til fysisk å binde og translocate β-catenin, den sentrale molekyl Wnt signalveien, inn i kjernen [45], [52]. For å avgjøre om β-catenin er til stede, og i forbindelse med T-antigen i tykktarmskreft, utførte vi immunhistokjemi i de samme 113 prøvene og analysert uttrykket av kjernefysisk β-catenin i T-antigen positive og negative grupper. Vi har funnet at av de 71 totale T-antigen-positive tarmkreftprøver, 48 viste atom ekspresjon av β-catenin (67,6%), mens bare 17/42 (40,5%) av T-antigen-negative prøver var positive for atom β-catenin (p≤0.005, Figur 1I). I alle T-Antigen negative tilfeller forble β-catenin i cytoplasma. Interessant nok de samme observasjonene var tilstede i polypper, hvor atom β-catenin korrelert med ekspresjonen av T-antigen. I den normale slimhinne, forble β-catenin lokalisert til den vanlige plassering i cytoplasma og membranen. β-catenin atom positive celler ble scoret på en skala fra 0-4, med en score på 0 indikerer at ~ 5% eller færre celler og en score på 4 indikerer ca 75% eller flere celler med kjernefysisk β-catenin. T-antigen positive prøvene hadde en gjennomsnittlig score på 1,463 (SD 1.164) for kjernefysisk β-catenin, mens T-antigen negative prøvene hadde en gjennomsnittlig score på 0,8182 (SD 0,9580, p≤0.05, figur 1J).
til slutt utførte vi dobbel merking immunfluorescens i en positiv sak som inneholdt de tre områder (normal tykktarm, polypp og kreft) og fant at i den normale tykktarm, hvor T-antigen er negativ, blir β-catenin uttrykt i cytoplasma; men i polypper og neoplastiske celler som uttrykker T-antigen, er β-catenin co-lokalisere med JCV oncoprotein i atomrommet. Figur 1 viser Panel K et område som inneholder normal epitel på toppen, med ingen ekspresjon av T-antigen og cytoplasmisk β-catenin, mens en underliggende lomme av neoplastiske celler som robust uttrykker T-antigen viser atom ko-lokalisering av β -catenin.
Påvisning av JC virus T-antigen genomiske sekvenser i kolorektal kreft prøver
for å bekrefte tilstedeværelse av T-antigen-genet, utførte vi PCR forsterkning fulgt av Southern blot hjelp av en svært spesifikk og følsom sonde for JCV T-antigen i et valgt antall 34 tykktarmskrefttilfeller som inneholdt høy kvalitet DNA. En skjematisk representasjon av JCV genomet er vist, inneholdende plassering av primere for Southern blot-amplifisering og probe-syntese (figur 2A). Regionen sonde anerkjennelse i JCV genomet (basepar 4304-4405) er svært variabel mellom JCV, BKV, og SV40, med 20 nucleotide mismatch mellom JCV og BK virus, og 33 nukleotid mismatch mellom JCV og SV40 i den regionen. Mens PEP1 og PEP2 primere forsterke både JCV og BKV T-antigen vår sonde gjenkjenne området mellom PEP1 og PEP2 primere som er meget spesifikt for JCV og binder seg ikke til BKV eller SV40 [53].
En skjematisk representasjon av Mad-en stamme av JCV genomisk struktur som viser virale gener i rødt, tidlig og sent transkripsjoner i grått, og plasseringen av primere som brukes for T-antigen forsterkning (PEP1 og PEP2) og Southern blot probe syntese (PEP INT1 og PEP INT2) (panel A). Genomiske sekvenser av den virale tidlige region, som koder for T-antigen, ble påvist i 28 av 34 utvalgte prøver. En representant Southern blot er presentert, med saksnummer over hver kjørefelt. Negative resultater ble observert når de samme sakene ble testet med prober for BKV og SV40. Negative kontroller viser resultatene fra reaksjoner som inneholder ikke DNA og positiv kontroll representerer genamplifisering ved hjelp pBJC, et plasmid inneholdende JCV-DNA som et templat, eller plasmider som inneholder BKV og SV40-T-antigenene. PCR for GAPDH og agarose elektroforese ble benyttet for å bekrefte tilstedeværelsen av intakt genomisk DNA i alle tilfeller. (Panel B). Southern blots av plasmider som inneholder T-antigen av JCV, BKV og SV40 ble testet med spesifikke prober for hver polyomavirus, noe som viser spesifisiteten av probene (panel C). En representativ Southern blot av PCR-amplifisering av styre regulatoriske område er vist (panel D, venstre). Sekvensering avslørte tilstedeværelsen av Mad-en og Mad-4 stammer med punktmutasjoner i de ulike prøvene. En representant sekvens er vist i blått, under den kjente sekvensen av Mad-4 CR-regionen (svart); punktmutasjoner er uthevet i rødt (Panel D, til høyre).
Vi forsterket genomiske sekvenser fra T-antigen kodende region i 28 prøver av 34 prøver (82,4%), 21 av disse viste T -Antigen protein uttrykk ved immunhistokjemi. I bare seks tilfeller har vi funnet at tilstedeværelsen av virus-DNA, men ingen proteinekspresjon, og ingen av tilfellene hadde T-antigen ekspresjon i fravær av virale genomiske sekvenser. Vi testet de amplifiserte sekvensene med spesifikke prober for BKV og SV40, noe som resulterer negativ i alle tilfeller. Høy kvalitet genomisk DNA ble påvist i hver prøve ved hjelp av PCR for GAPDH. (Figur 2B). Til slutt, vi også testet våre sonder med plasmider som inneholder T-antigener fra JCV, BKV en SV40, bekreftende spesifisiteten av våre sonder, og som tyder på at immunhistokjemi avslører T-antigen av JCV og ikke en fra de andre polyomaviruses (figur 2C ).
Deretter utførte vi PCR eksperimenter med primere og prober som er spesifikke for den regulatoriske regionen JCV. Vi forsterket virale sekvenser i 14 av de 34 sakene. Figur 2D viser en representativ Southern blot inneholdende en av disse tilfellene, som også var positive for T-antigen region. Sekvensering av disse amplikonene viste at Mad-en og Mad-fire var de to oppdaget flekker av JCV. Men alle disse sekvensene inneholdt enkeltpunktmutasjoner, forskjellig fra hverandre, noe som tyder på at disse er faktisk unike og forkaster muligheten for forurensning laboratoriet. En representant sekvens er vist i blått, under know sekvensen av Mad 4 stamme av JCV i svart. Punktmutasjoner er uthevet i rødt (figur 2D). I tillegg er en detaljert oversikt over sakene og resultatene av PCR forsterkning og sekvensering, samt immunhistokjemi presentert i tabell 1.
T-antigen og β-catenin co-lokalisere til kjernen i tykktarm kreft celler og co-immunpresipitatet
in vitro
Tidligere studier tyder på at T-antigen og β-catenin samhandle direkte endre normal cytoplasma subcellulære lokalisering av β-catenin. For å underbygge disse funnene
in vitro
og for å bestemme hvorvidt T-antigen og β-catenin er til stede i det samme cellerommet i kolon kreftceller, utførte vi dobbel merking immunfluorescens for disse to proteiner i HCT116 tykktarm kreftcellelinje transient transfektert med T-antigen. Vi fant at celler som uttrykker oncoproteinet viser en sterk kjerne ekspresjon av β-catenin (figur 3D-E, piler), mens i celler som ikke får tilført, og ikke uttrykker T-antigen, forblir β-catenin i cytoplasma (figur 3D-E, pilspisser).
Double merking immunocytochemistry for β-catenin (panel B, Fluorescein), og T-antigen (Panel C, Rhodamine), utført i HTC116 tykktarm kreft celler transient transfektert med T-antigen viser den ko-lokalisering av begge proteiner i kjernene i de fleste celler (panel E, piler), mens i ikke-transfekterte celler i hvilke det ikke er noen ekspresjon av T-antigen, forblir β-catenin utelukkende i cytoplasma (panel E, pilspisser).
for ytterligere å definere subcellulære plasseringen av fysisk interaksjon mellom T-antigen og β-catenin, vi utført en co-immunoutfelling om atom og cytoplasma ekstrakter av HCT116-celler transfektert med en T-antigen ekspresjonsvektor eller tom vektor som kontroller. Nukleære og cytoplasmatiske lysater ble inkubert med et anti-T-antigen-antistoff, og immunkomplekser ble analysert via Western blot med antistoffer mot T-antigen og β-catenin. T-antigen immunoutfellinger fra kjernen og cytoplasmaet viser ko-utfelling av β-catenin i begge kamrene (figur 4A). Vi har bekreftet dette samspillet i den inverse eksperimentet (β-catenin IP, T-antigen Western blot- 4B). Spesifisiteten av kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner ble bekreftet ved sondering inngangs baner for GRB-2 (cytoplasma) og Lamin A /C (atom).
HCT116-celler transfektert med T-antigen eller tom vektor ble fraksjonert å isolere atom og cytoplasmatiske kamrene og immunoutfelt med et antistoff mot T-antigen (A) eller β-catenin (B). T-antigen trekker ned β-catenin i cytoplasma (toppfeltet, felt 6) og i kjernen (toppfeltet, søyle 8). Den inverse eksperiment (IP β-catenin) bekrefter samspillet mellom T-antigen og β-catenin i cytoplasma (nederst panel, spor 6) og kjernen (nederst panel, lane 8).
T -Antigen aktiverer TCF-avhengig transkripsjon
Etter bekreftelse på at T-antigen og β-catenin co-Lokaliser og samhandle i kjernen, undersøkte vi effekten av dette samspillet på aktivering av β-catenin målgener. Vi utnyttet TOPflash reporter-konstruksjonen for å måle endringer i β-catenin /TCF-mediert transkripsjon. Den TOPflash konstruksjonen inneholder 16 TCF bindende elementer (TBES) kjører uttrykk for luciferase genet. HCT116-celler ble transfektert med TOPflash og enten T-antigen, β-catenin, eller begge T-antigen og β-catenin. Luminescens ble målt ved 24 timer etter transfeksjon. Alle gruppene ble separat transfektert med FOPflash å måle baseline luminescens. T-antigen eller β-catenin alene aktivert betydelig TOPflash med 2 ganger og fem ganger i løpet av tom vektorkontroll, hhv. Påfallende, celler som uttrykker T-antigen og eksogene β-catenin viste en 113-dobling i TOPflash aktivitet over baseline (figur 5A, p≤0.001). Disse data viser evnen til T-antigen og β-catenin til synergistisk å aktivere promo β-catenin målgener. Verdien er normalisert til FOPflash-transfekterte celler.
HCT116-celler ble ko-transfektert med Wnt veien reporter plasmid TOPflash konstruere og T-antigen, β-catenin, eller begge deler. Celler transfektert med T-antigen eller β-catenin alene økte TOPflash aktivitet omtrent 2 til 5 ganger i forhold til grunnlinjen. Co-transfeksjon med både T-antigen og β-catenin resulterte i 113-ganger økning i TOPflash aktivitet. Verdiene er normalisert til FOPflash (baseline) grupper (Panel A). For å måle aktivering av spesifikke β-catenin mål, ble tilsvarende forsøk utført under anvendelse av luciferase konstrukter inneholdende c-Myc (panel B) eller Cyclin D1 (panel C) aktivatorer. Ekspresjon av T-antigen øker signifikant c-Myc og Cyclin D1 promoter-aktivitet i HCT116-celler.
