Abstract
Kreft celle invasjon er den kritiske første trinnet av metastaser, men likevel, lite er kjent om hvordan kreftceller invadere og initiere metastaser i en kompleks ekstracellulære matrise. Ved hjelp av en cellelinje fra beinmetastaser fra prostatakreft (PC3), analyserte vi hvordan prostatakreftceller vandrer i en fysiologisk relevant 3D Matrigel. Vi fant at PC3-celler overføres mer effektivt som flercellede klyngene enn isolerte enkle celler, noe som tyder på at tilstedeværelsen av celle-celle adhesjon forbedrer 3D-cellemigrering. Forstyrrelse av N-cadherin funksjon ved transfeksjon av enten N-cadherin cytoplasmatisk domene eller shRNA spesifikk for N-cadherin opphevet kollektiv cellemigrering. Interessant nok har PC3-celler ikke uttrykker α-catenin, en actin-bindende protein i cadherin komplekset. Når full-lengde α-catenin ble gjeninnført, fenotypen av PC3-celler vende tilbake til en mer epitelial fenotype med en redusert cellemigrering hastighet i 3D Matrigel. Interessant, fant vi at den N-terminale halvdel av α-catenin var tilstrekkelig til å undertrykke invasiv fenotype. Tatt sammen tyder disse data på at dannelsen av N-cadherin veikryss fremmer 3D-cellemigrering av prostata kreftceller, og dette er delvis på grunn av en avvikende regulering av N-cadherin-komplekset i fravær av α-catenin.
Citation: Cui Y, Yamada S (2013) N-cadherin Dependent Collective Cell invasjon av prostata kreft celler er regulert av N-terminalen av α-catenin. PLoS ONE 8 (1): e55069. doi: 10,1371 /journal.pone.0055069
Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan
mottatt: 12. oktober 2012; Godkjent: 24 desember 2012; Publisert: 24 januar 2013
Copyright: © 2013 Cui, Yamada. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Beckman Young Investigator Award, en Hellman Familie New Faculty Award, en NIH EUREKA GM094798, og midlene fra University of California Cancer Research Coordinating Committee. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft celle invasjon er den kritiske første trinnet av metastaser og den fenotypiske overgangen fra godartet svulst til invasiv kreft krever endringer i genuttrykk profil. For epiteliale-avledede kreftformer, er dette epitelial-til-mesenchymale overgang initiert av transkripsjonsfaktorer som regulerer ned-tumor-suppressorer og opp-regulerer onkogener, og er antatt å styre kreft metastase [1]. De viktigste epitel og mesenchymale markører som definerer de respektive fenotyper er epitel (E) og nevronale (N) cadherins, og dette cadherin switch sammenfaller ofte med overgangen fra godartet til aggressive kreftformer [2].
I ulike kreft celler, unormal ekspresjon av N-cadherin korrelerer med induksjon av celle-motilitet. For eksempel er ekspresjon av N-cadherin induserer cellemigrering i brystkreftceller [3] – [7], melanom [8], prostatakreft [9], magekreft [10] og plateepitel carcinom [11]. Interessant, overekspresjon av N-cadherin forbedrer celle motilitet og invasjon uten å redusere E-cadherin nivåer [4], noe som antyder at øket celle motilitet er på grunn av ekspresjon av N-cadherin snarere enn en mangel på E-cadherin. Derfor er viktig i normal epitelial cellefunksjon stramt regulering av N-cadherin uttrykk. I samsvar med dette begrepet, reguleringen av N-cadherin av mikroRNA-145 har vist seg å undertrykke invasjon og metastase i magekreft [10].
Mens den kanoniske funksjon av N-cadherin er å etablere celle-celle- adhesjon, nærvær av N-cadherin induserer også pro-vandrende signalering. Det ekstracellulære domene av N-cadherin interagerer med FGF-reseptor 1 [12], og denne interaksjonen minimaliserer reseptoren internalisering, for derved å forlenge MAPK-ERK-aktivering [5], [6]. Videre er N-cadherin-indusert cellemigrering er avhengig av redusert akt3 nivå og aktivering i brystkreftceller [7]. I motsetning til dette, rollen av N-cadherin-mediert celle-celle-adhesjon i kreftcellemigrering er uklart. Dersom N-cadherin veikryss fungere på samme måte som E-cadherin veikryss ved å stabilisere celle-celle interaksjoner og hindrer celle migrasjon (kontakt hemming), deretter N-cadherin veikryss ville hindre kreft celle migrasjon. Derfor vil slike celle veikryss være kontraproduktivt til N-cadherin indusert pro-trekkende signaler.
Ved hjelp av prostatakreftcellelinjer som et modellsystem, søkte vi å analysere hvordan N-cadherin regulerer kreftcelle invasjon. I prostata cancer, N-cadherin ekspresjon oppregulert og E-cadherin-ekspresjon nedregulert [13], [14]. En lignende cadherin bryter er også assosiert med klinisk tilbakefall [15], og ble identifisert i metastatiske lesjoner [16]. Videre er N-cadherin nivåene økte i kastrerings-resistente svulster hos pasienter med metastaser etablerte [17]. I tillegg ble det observert forhøyede nivåer av N-cadherin i prostatakreft høy klasse i forhold til karakteren svulster lave [18]. Behandling med en N-cadherin-spesifikt monoklonalt antistoff redusert spredning, adhesjon og invasjon av prostatakreftceller
in vitro
, og bremset veksten av flere etablerte xenografter, blokkert lokal invasjon og metastasering, og høyere doser, ledet for å fullføre regresjon [9]. Samlet utgjør disse studiene fremheve sammenhengen mellom N-cadherin uttrykk og prostatakreft progresjon, men den spesifikke rollen N-cadherin veikryss under kreftcelle invasjon er ukjent.
Tidligere studier fokusert på kreft celle migrasjon på en to-dimensjonale (2D) substrat, mens lite er kjent om hvordan prostatakreftceller vandrer i en mer fysiologisk relevant tre-dimensjonale (3D) matrise. Ved hjelp av time-lapse mikroskopi, har vi funnet at i 3D Matrigel, prostatakreft (PC3) celler som migrerer i flercellede klynger, og denne kollektive celle migrasjon av PC3-celler er forbedret i nærvær av celle-celle adhesjon. Prostata kreftceller over-uttrykker N-cadherin cytoplasmatisk domene eller N-cadherin knockdown-celler ikke ble overført i en 3D-matrise. Videre, som PC3-celler mangler endogen α-catenin, re-ekspresjon av α-catenin fremmet en epitelial fenotype i en 3D-matrise. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at N-cadherin veikryss fremme 3D kollektiv cellemigrasjon av prostatakreftceller delvis på grunn av fravær av α-catenin.
Resultater
Collective celle migrasjon er en unik eiendom PC3 celler i 3D matrix
i motsetning til de stive 2D Dekk ofte brukes til å studere kreft celle migrasjon, gir 3D Matrigel en myk matrise som bedre etterligner svulsten mikromiljøet. Vi har sammenlignet den vandrende fenotype av prostata kreft cellelinjer (PC3, 22Rv1, LNCaP, RWPE-en og RWPE-2) i 3D matrix. Bare PC3 celler invadert den omkringliggende matrise effektivt, mens 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 og RWPE-2 celler forble rund og dannet sfæriske cellegrupper med ingen åpenbare membran utvidelser (Figur 1a). Interessant, i 3D matrix, PC3 celler migrert bare når du er i kontakt med nabocellene (Figur 1A, hvite pilspisser peke på enkelt ikke-trekkende celler). I tillegg, PC3-celler var svært vandrende på overflaten av Matrigel-belagte dekkglass (figur 1B, film S1), derimot, ble cellene ikke opprettholde celle-celle-kontakter på 2D-overflaten og migrerende celler passerte hverandre uten å danne stabile celle- celle adhesjon (Figur 1b).
(A) Morfologi av prostata kreft cellelinjer i 3D Matrigel. PC3 cellene danner multi-cellular invasiv klynge men 22Rv1, LNCaP, RWPE-1 og RWPE-2 celler danner flercellede spheroids og er ikke invasiv. Pilspisser indikerer enkeltrom, ikke-trekkende PC3 celler. Høyre panel viser immunoblotter for N-cadherin (Ncad), E-cadherin (ECAD), α-catenin (α-katt) og tubulin (Tub) av prostata kreft cellelinjer. (B) Cell migrasjon på 2D underlag. Rød stjerne og svart pil separat merke og spore to naboceller passerer hverandre uten å danne og opprettholde celle-celle kontakt. Tid i minutter. (C) Time-lapse bilder av kollektiv cellemigrasjon av PC3 celler i 3D Matrigel. Tid i timer. (D) Representative baner (til venstre), gjennomsnittlig hastighet (i midten) og ende-til-ende-forskyvning (til høyre) fra enkeltceller (N = 33) og flercellede klynger (N = 43) i 3D Matrigel (**, p 0,01 ). (E) EDTA-tilsetning forstyrrer celle-celle interaksjoner. EDTA ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1,4 mM. Tid i minutter. (F) farging for N-cadherin i PC3 celler seeded i 3D Matrigel. N-cadherin (klone 6G11) co-lokaliserer med aktin (phalloidin) på celle-celle kontakter. Pilen angir celle-celle-kontakt. Alle skala barer er 10 mikrometer.
I 3D Matrigel, langstrakte PC3 cellegruppene migrert i en vedvarende retning (figur 1C, D, Movie S2), mens enkeltceller migrert tilfeldig med en lavere gjennomsnittshastighet og netto forskyvning enn de individuelle cellene i cellegrupper (figur 1D). Disse dataene tyder på at kollektivt cellemigrering av PC3-celler er unike for migrerende celler i 3D Matrigel, og nærværet av celle-celle interaksjoner kan fremme effektiv cellemigrering (celle hastighet og utholdenhet) i 3D Matrigel.
Cadherins finnes potensielle regulatorer av kollektiv cellemigrasjon
Siden mange celle-celle adhesjon proteiner er kalsiumavhengig, analyserte vi kollektive celle migrasjon i 3D Matrigel under lave kalsium forhold. Ved chela kalsium med EDTA, PC3 celler i avlange klaser skilt fra naboceller i løpet av 30 minutter (figur 1E, Movie S3). Dette tyder på at kalsiumavhengige adhesjonsproteiner (f.eks cadherins) er sannsynligvis ansvarlig for PC3 celle-celle interaksjoner. Interessant, PC3 cellene uttrykte høyere N-cadherin og lavere E-cadherin nivåer sammenlignet med 22Rv1, LNCaP, RWPE-en og RWPE-2 prostata kreft cellelinjer (figur 1A). Videre bare PC3 celler invadert 3D matrix mens de andre prostatakreftcellelinjer ikke (figur 1A). I 3D Matrigel, N-cadherin lokalisert til celle-celle kontakter av PC3 celler (figur 1F), noe som tyder på at N-cadherin formidler celle-celle interaksjoner i 3D matrix.
immunolabeling av N og E-cadherin avslørt at de fleste PC3 cellene ble N-cadherin positive (figur 2A), men svært få PC3 cellene E-cadherin positive (figur 2A). Interessant, observerte vi at selv om mesteparten av PC3-celler samlet migrerte 3D Matrigel, forble noen få celler i sfæriske cellegrupper. Vi har mistanke om at ikke-trekkende PC3 celler kan uttrykke E-cadherin. For å vurdere nøyaktig hvilken rolle både cadherins i 3D celle migrasjon, ble PC3 celler subklonet å isolere E-cadherin uttrykker PC3 celler. Av tjueen PC3 subkloner generert, de fleste subkloner hadde høyere eller tilsvarende nivå av N-cadherin til foreldre celler (se figur S1). To under kloner ble valgt (PC3e og PC3n) for sin karakteristiske cadherin uttrykk. PC3e hadde en høyere E-cadherin uttrykk nivå enn både foreldre PC3 og PC3n, mens PC3n hadde et høyere uttrykk nivå av N-cadherin (figur 2B, C, S1). E og N-cadherin proteiner lokalisert til celle-celle-kontakter av PC3e og PC3n kloner, respektivt (figur 2C). Videre cadherin uttrykket analyse viste at den parentale og PC3n klon uttrykte også et høyt nivå av cadherin 11, mens PC3e primært uttrykt E og P-cadherin (figur 2E). I 3D Matrigel, gjorde PC3e cellene ikke migrere og forble som sfæriske klynger (figur 2D, Film S4). I kontrast, PC3n hadde en langstrakt morfologi og migrerte i en vedvarende retning på samme måte som foreldre PC3 celler (figur 2D, Film S5). Disse data tyder på at uttrykket nivåer av E /P og N /11-cadherins samsvarer med den sfæriske og langstrakte fenotype i 3D matrix, henholdsvis.
(A) Farging av N-cadherin med phalloidin (topplaten) og E-cadherin med phalloidin (nederst panel) av foreldre PC3 celler belagt på dekkglass. (B) To representative subkloner fra foreldre PC3 celler, PC3e og PC3n, ble immunblottet for E-cadherin og N-cadherin. Tubulin er vist som en lasting kontroll. De opprinnelige blotter er vist i Supplementary figur S1. (C) Immuno-farging av PC3 subkloner for E-cadherin og N-cadherin (klon 32). (D) Cell morfologi, celle hastighet og retnings utholdenhet av PC3e (N = 19) og PC3n (N = 20) kloner i 3D Matrigel (**, P 0,01; N = 11-42). Alle skala barer er 20 mikrometer. (E) Heat kartet microarray analyse for alle cadherin uttrykk nivåer i foreldre PC3, PC3e og PC3n celler.
Uttrykk av N-cadherin cytoplasmaområde opphever kollektiv cellemigrasjon
Å analysere rollen av N-cadherin i kollektiv cellemigrering, transfektert vi N-cadherin cytoplasmatisk domene (N-cytomegalovirus), og subklonet stabile transfektanter med økende N-Cyto nivåer (figur 3A). I nærvær av N-cytomegalovirus, ble endogen N-cadherin ekspresjon nedregulert, mens endogen E-cadherin ble oppregulert (figur 3B). Microarray-analyse bekreftet den reduserte N-cadherin og øket E-cadherin ekspresjonsprofilen i N-Cyto-celler (figur 3C), og videre avslørte oppregulering av P-cadherin (figur 3C). Både E og P-cadherin også var oppregulert i den ikke-vandrende PC3e klon (figur 2E). Samlet utgjør disse data viser at nedregulering av N-cadherin resulterer i opp-regulering av både E og P-cadherins i PC3-celler. Interessant, cadherin 11 var nedregulert i en av de N-Cyto uttrykkende celler (1), men ikke i andre (# 4, figur 3C).
(A) Skjematisk av full-lengde N -cadherin og cytoplasmatiske N-cadherin (N-CYTO) konstruerer. N-cadherin cytoplasmatiske domene er sammensmeltet med membran rettet mot domenet fra Lyn kinase (svart) ved N-terminus og tandem dimer-tomat (rød) i C-terminus. (B) immunoblotter for N-cadherin ekstracellulært domene (klone 8C11), N-cadherin cytoplasmaområde (klon 32), og E-cadherin (klon 36) i N-CYTO uttrykker PC3 celle subkloner. # 1, # 2, # 3, # 4 er fire populasjoner av N-Cyto-celler med gradvis økte N-Cyto nivåer. (C) Heat kartet microarray analyse for alle cadherin nivåer i PC3, N-CYTO # 1 og N-CYTO # 4 celler. (D) Immuno-farging av ekstracellulære domene av N-cadherin (klon 8C11), med phalloidin i paren PC3-celler (toppfeltet) og N-cytomegalovirus # 4-celler (nedre panel). N-CYTO lokalisering ble oppdaget av tandem-tomat signal (nedre panel). Scale bar 10 mikrometer. (E) Statistisk analyse av N-cytomegalovirus-uttrykkende celle PC3 3D-migrasjon. Gjennomsnittlig hastighet og ende til ende avstand vises (**, P 0,01; N = 42 for foreldre celler og N = 11 for N-CYTO celler). Feilfelt er standard feil av gjennomsnittet. Scale bar, 40 mikrometer.
I stedet for en løst organisert og elongatged morfologi på et 2D-overflate, N-CYTO uttrykker cellene hadde strammere celle-celle kontakt enn foreldre celler. Farging for det ekstracellulære domene av N-cadherin detektert lave nivåer av endogen N-cadherin som ikke ble lokalisert ved celle-celle-kontakter (figur 3D). I 3D Matrigel, både N-CYTO # 1 og # 4 celler dannet sfæriske klynger og var ikke invasiv (Figur 3E, Film S6). Selv om disse to N-Cyto uttrykkende kloner delte den samme ikke-invasive fenotype i 3D Matrigel, de har forskjellige cadherin 11 nivåer, noe som tyder på at cadherin 11 uttrykk er uavhengig av PC3 cellemigrering fenotype og oppførsel i 3D Matrigel.
Dempe N-cadherin opphever celle migrasjon i 3D Matrigel
for å kunne fastslå om N-cadherin er den primære regulator av 3D celle migrasjon, vi stabilt forstummet N-cadherin i PC3 celler. Av tre N-cadherin spesifikke shRNA sekvenser testet og 44 transfekterte kloner analysert, er to kloner med 50% (KD1) og 99% (KD2) reduksjon av endogen N-cadherin vist. Kontrollgruppen med tilsvarende eggesekvenser (sCR1, SCR2) viste lignende N-cadherin nivåer for å paren PC3-celler (figur 4A, B). Endogen N-cadherin ble observert i KD1 celler, men ikke i KD2 celler (figur 4B). Videre stanse av N-cadherin ikke endre E-cadherin og cadherin 11 nivåer i KD1 og KD2 celler (figur 4A).
(A) immunoblotter for N-cadherin, E-cadherin og cadherin 11 i N -cadherin knockdown-celler og celler transfektert med egge sekvenser. Tubulin er vist som en lasting kontroll. KD1, KD2 er to knockdown kloner. SCR1, SCR2 er to kloner transfektert med tilsvarende egge sekvenser. (B) Farging av N-cadherin i kontrollceller (øverst panel) og knockdown celler (nederst panel). (C) Celleaggregatdannelse av knockdown-celler og kontrollceller i løpet av 3 timer i suspensjon. På time 0, 1, 2, 3 i suspensjon, antall celleaggregater analysert var 144, 101, 133, 62 for paren PC3-celler, 147, 117, 107, 81 for KD1 celler, 142, 121, 107, 73 for KD2 celler, 146, 115, 87, 88 for sCR1 celler, 131, 147, 107, 68 for SCR2-celler, respektivt. (D) 3D celle migrasjon analyser av foreldre (N = 17), rykke shRNA (N = 17 for sCR1, N = 20 for SCR2) og knockdown celler (N = 37 for KD1, N = 33 for KD2). Statistisk analyse av gjennomsnittshastighet vises (**, P 0,01). Alle feilfelt er standard feil av gjennomsnittet. Alle skala barer er 20 mikrometer.
Til tross for redusert nivå av N-cadherin, aggregater knockdown celler fortsatt formet celle lik i størrelse som foreldre PC3 celler i suspensjon (figur 4C), noe som tyder på at tilstedeværelsen andre cadherins, f.eks cadherin 11, kan være tilstrekkelig for celle-celle-kontakt formasjonen. Men i 3D Matrigel, den delvis knockdown (KD1) celler langstrakte på lignende måte som parentale celler, men dannet mye løsere cellegrupper (Figur 4D). Den komplette knockdown (KD2) celler forble runde med minimale membran utvidelser i 3D Matrigel (figur 4D). I motsetning til de foreldre eller egge shRNA transfekterte celler, gjorde disse cellene ikke utvikle store langstrakte cellegruppene (figur 4D).
I 3D Matrigel, begge knockdown cellelinjene ikke vandrer så fort som foreldre eller egge shRNA transfektert celler. Mens KD1 celler migrert med en 50% reduksjon i fart, KD2 celler var nesten immobile (figur 4D, Film S7). Disse data antyder at i 3D Matrigel, regulerer N-cadherin både den langstrakte morfologi og utvikling av cellegrupper, i tillegg til cellemigrering.
Ekspresjon av α-catenin tilbakestilles PC3-celler til normal epitelial fenotype
Cadherins spille en avgjørende rolle i å danne og opprettholde sterke celle-celle adhesjon og kreve støtte fra den underliggende aktin cytoskjelettet for å opprettholde celle-celle-kontakter. Ett nøkkelmedlem av cadherin komplekse, α-catenin, inneholder en aktinbinding domene i C-terminus. Interessant, i motsetning 22Rv1 eller LNCaP celler, PC3 celler uttrykker ikke α-catenin (figur 1A, 5A). For å forstå hvordan α-catenin uttrykk påvirker N-cadherin avhengig kollektiv cellemigrasjon, vi stabilt transfektert GFP-merket α-catenin i PC3 celler (figur 5A, B). De GFP- α-catenin uttrykkende celler hadde en svak økning i N-cadherin nivå og en liten reduksjon i E-cadherin nivå i forhold til de parentale celler (Figur 5A). Interessant, α-catenin uttrykkende celler dannet strammere celle-celle-kontakter i mer kompakt cellegrupper i forhold til de løst organisert, langstrakte parentale celler for 2D overflate (figur 5B). I tillegg GFP merket α-catenin lokalisert til celle-celle kontakter (figur 5B), og samlokalisert med N-cadherin (figur 5C).
(A) immunoblotter for α-catenin, N-cadherin og E-cadherin i α-catenin uttrykke celler. Tubulin er vist som en lasting kontroll. LNCaP ble anvendt som en positiv kontroll for α-catenin og E-cadherin. (B) Lokalisering av α-catenin i foreldre PC3 celler og GFP-merket α-catenin uttrykker celler i bunnplater. (C) co-lokalisering av GFP-merket α-catenin med N-cadherin. (D) Celle aggregering analyse av foreldre og α-catenin uttrykkende celler i suspensjon. Innfelt: utvidet utsikt over cellegrupper. GFP signal er overlappet på lyse-feltet image for GFP-merket α -catenin uttrykke celler. Gjennomsnittlig aggregering størrelser på hver tidspunkter er vist i søylediagram. (E) Cell migrasjon analyser i 3D Matrigel. GFP kanal av GFP-merket α-catenin uttrykkende celler i den hvite boksen (nederst til venstre panel) er vist i panel nederst til høyre. Statistisk analyse av cellevandring vises hastigheten (**, P 0,01; N = 35 for foreldre celler, N = 31 for GFP-α-catenin uttrykker celler). Alle skala barer er 20 mikrometer.
I suspensjon, α-catenin uttrykker celleaggregater var på størrelse med foreldre PC3 celler (Figur 5D). Imidlertid celle-celle-kontakter av α-catenin uttrykkende celler var mye trangere uten åpenbare celle-cellegrensene enn de løsere sperre PC3 celleaggregater (figur 5D). Pakking av celleaggregater i α-catenin uttrykkende celler antyder at N-cadherin mediert celle-celle adhesjon sannsynligvis forsterket ved nærvær av α-catenin.
Til tross for evnen til å danne celle-celle-adhesjon i suspensjon ( Figur 5D), gjorde α-catenin uttrykker PC3 cellene ikke forlenges for å danne store cellegruppene i 3D Matrigel som foreldre PC3 celler gjorde. Disse cellene forble som enkeltceller eller små klynger med en mer rund morfologi (figur 5E). I 3D Matrigel, α-catenin lokalisert til celle-celle-kontakter av små celleklynger (figur 5E). I samsvar med dette morfologi, α-catenin celler var ikke bevegelig i 3D Matrigel (figur 5E, Film S8). Disse resultatene tyder på at α-catenin uttrykk styrket N-cadherin mediert celle-celle adhesjon og hindret cellemigrasjon i 3D Matrigel, og at nedregulering av α-catenin kan være et viktig skritt i prostata kreft metastasering.
den N-terminale halvdel av α-catenin er tilstrekkelig for å undertrykke invasiv fenotype
for å teste rollene til α-catenin i regulering av celle-celle adhesjon, vi gradvis avkortet α-catenin konstruksjon (figur 6A) og stabilt transfektert PC3 celler. Den C-terminale ende av α-catenin består av vinculin bindings inhiberende domene (aa 509-633), og actin-bindende domene (aa 697-906), noe som krever kort C-terminale ende (AA 848-906) for aktinbinding [ ,,,0],19]. The full-lengde α-catenin og avkortede mutanter var sammenlignbare i sine uttrykk nivåer (figur 6B, S2), og uttrykk for de avkortede mutanter ikke endre cadherin uttrykket profilen (Figur 6B). Mens alle avkortede mutanter lokalisert til områder av celle-celle adhesjon (figur 6C), den avkortede mutant uttrykke celler dannet løsere cellegrupper enn for full lengde α-catenin uttrykker cellene på en 2D-overflate (figur 6C). Interessant, trunkeringstegn mutanter α-catenin 1-509 og α-catenin 1-848 uttrykke celler dannet relativt kompakte klynger enn a-catenin 1-670 uttrykke celler på et 2D-overflate (figur 6C).
(A ) Skjematisk av full-lengde α-catenin og dens C-terminal avkortede mutanter. GFP tag, Vinculin binding (Vin), dens hemmende (sperre), F-aktin binding (Actin) domener er vist. (B) immunoblotter for α-catenin, N-cadherin og E-cadherin i forskjellige α-catenin uttrykke celler. Tubulin er vist som en lasting kontroll. 22Rv1 ble anvendt som en positiv kontroll for α-catenin og E-cadherin. De opprinnelige blottene er vist i figur supplerende S2. (C) Cell morfologi (øverst panel) og lokalisering av α-catenin (nedre panel) i ulike α-catenin uttrykker PC3 celler. (D) Celle aggregering analyse av foreldre, ulike α-catenin uttrykkende celler, og 10 uM cytokalasin D (CD) behandlede celler. Innfelt: utvidet utsikt over cellegrupper. GFP signal er overlappet på lyse-feltet image for GFP-merket α-catenin /avkutting mutante uttrykker celler. Aggregering størrelse av cellene på hvert tidspunkt er vist i gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet; ANOVA analyse kombinert med posthoc test Tukey HSD ble brukt mellom gruppene ved endepunktet time 3 (**, P 0,01). (E) Cellemigrering analyser i 3D Matrigel for foreldre (N = 35), full-lengde α-catenin (N = 31), α-catenin 1-509 (N = 73), α-catenin 1-670 (N = 39), og α-catenin 1-848 (N = 52) uttrykkende celler. Gjennomsnittshastighet og endepunkt avstand på migrasjon er vist i gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet; ANOVA og posthoc test Tukey HSD ble brukt (***, P 0,001). Alle skala barer er 20 mikrometer.
De morfologiske fenotyper på en 2D flate var i samsvar med resultatene av celle aggregering analyse i suspensjon. Mens avkortede mutante uttrykkende celler som dannes celleaggregater sammenlignbare i størrelse med den til foreldre og full-lengde α-catenin uttrykkende celler, celleaggregatene viste forskjellige fenotyper (figur 6D). Tilsvarende til den full-lengde α-catenin uttrykkende celler, α-catenin 1-509 uttrykkende celler dannet tett celle-celle-kontakt uten åpenbar cellegrensene (figur 6D), noe som tyder på at den N-terminale ende av α-catenin er avgjørende for denne stram celle-celle adhesjon. Dette er i overensstemmelse med den α-catenin mutant som mangler den C-terminale ende essensiell for aktinbinding (1-848) var også i stand til å indusere tette cellegrupper, dog løsere klyngene enn full-lengde α-catenin uttrykkende celler (figur 6D ). Legg merke til at organisasjon aktin fremdeles er vesentlig for dannelsen av celle-celle adhesjon som cytokalasin behandling eliminert celle aggregering dannelse (figur 6D). Overraskende nok aggregater imidlertid α-catenin 1-670 uttrykkende celler dannet løs celle lik den av parentale celler (figur 6D).
Siden den α-catenin mutant som mangler den C-terminale ende essensiell for aktinbinding (1-848) danner forholdsvis tette cellegrupper (figur 6D), den direkte aktinbinding ved α-catenin har bare en mindre rolle i regulering av celle-celle adhesjon. I tillegg viser våre data tyder på at i fravær av aktin-bindende domene (aa 697-906), den vinculin-bindende inhiberende domene undertrykker evnen til å danne tette celle-celle kryss, som er i overensstemmelse med ideen om at vinculin kreves for styrking av celle-celle adhesjon [20], [21]. Til støtte for denne modellen, ble minimalt vinculin rekruttering observert langs de celle-celle-kontakter av α-catenin 1-670 uttrykkende celler (figur S3).
Til tross for forskjellige fenotyper i suspensjon, alt avkortet mutant uttrykkende celler erholdt lik epithelial morfologi med den i full lengde α-catenin uttrykkende celler i 3D Matrigel (figur 6E). De α-catenin mutant-uttrykke celler forble som enkeltceller eller dannet små klynger med minimum membran utvidelser, og var ikke bevegelig i 3D Matrigel (figur 6E). Selv om disse a-catenin mutante-uttrykkende celler som har forskjellige nivåer av celle-celle adhesjon (figur 6D), ekspresjon av N-terminal-halvdelen av α-catenin var tilstrekkelig til å minimalisere celle invasjon i 3D Matrigel, noe som tyder på at celle invasivitet bestemmes av protein interaksjoner i den N-terminale halvdel av α-catenin (f.eks ß-catenin).
Diskusjoner
Tidligere studier har vist at N-cadherin induserer pro-trekkfugl signalering ved direkte interaksjon med FGF reseptorer på det ekstracellulære domene [5], aktiverer MAPK /ERK-signalveien [5], [6], og undertrykker akt3 signale [7]. Likevel har rollen av N-cadherin-mediert celle-celle-adhesjon i prostatakreft celle invasjon ikke blitt utforsket. Våre data antyder at nærvær av N-cadherin-mediert celle-celle adhesjon fremmer effektiv cellemigrasjon ved å øke celle hastighet i en vedvarende vandrende bane i 3D Matrigel.
Denne samlede cellemigrering av PC3-celler er en unik migrasjon fenotype bare vist i et 3D-matrise. Mens N-cadherin lokalisert til celle-celle kontakt PC3 celler belagt på en 2D overflaten (Figur 2A, 3D og 4B), disse cellene ikke opprettholde stabile celle-celle kontakter og migrere som enkeltceller (figur 1B). Siden ekspresjonen av nøkkelsignalmolekyler er forskjellige på 2D-3D-vs miljø [22], kan slike faktorer endre celle-celle adhesjon og migrering fenotype. Alternativt kan forskjellen i 2D vs 3D celle-celle adhesjon være resultatet av matrisen elastisitet. For eksempel, i motsetning til 3D-matrise, to kontaktlegemer som beveger seg i en motsatt retning kan ofte mekanisk forstyrre celle-celle adhesjon på en 2D overflate. Dette er fordi den stive 2D substrat tilveiebringer et bedre veigrep enn myk 3D-matrise. Den distinkte migrasjon fenotypen i 3D matrise antyder at N-cadherin veikryss kan spille en viktig rolle i prostatakreft celle invasjon
in vivo
.
I motsetning til E-cadherin-mediert celle-celle adhesjon som hindrer cellemigrering (kontakt-inhibering, se 22Rv1, LNCaP og RWPE i figur 1A), N-cadherin-mediert celle-celle adhesjon fremme kollektiv cellemigrering. En unik funksjon av N-cadherin adhesjon er å undertrykke tilfeldige membranfremspring av følgecellene, slik at bare de ledende cellene kan forlenge de ledende kanter. Denne lokale kontakt hemming opprettholder celle polaritet med en distinkt forkant for celle migrasjon; derfor sikre utholdenhet av kollektive celle migrasjon. Cadherin-mediert celle-celleadhesjon har vist seg å generere polarisert cellemorfologi inn i Xenopus mesendoderm celler [23] og transformerte epitelceller i et 3D-matrisen [24]. N-cadherin veikryss i epitelceller avledet kreftceller gir en polarisering kø avgjørende for retnings celle migrasjon i en 3D-matrise.
Interessant, cadherin 11, en type II cadherin, er også oppregulert i meget inngripende klone av PC3 celler (PC3n, figur 2E), og kan være ansvarlig for dannelsen av celle-celle adhesjon i N-cadherin manglende celler (Figur 4C). Dette cadherin 11 opp-regulering er antatt å fremme cellulære interaksjoner mellom kreftceller og cadherin 11 uttrykker osteoblaster som er typisk for beinmetastase [25] – [27]. Tidligere studier har rapportert at uttrykket av cadherin 11 shRNA reduserer cellemigrasjon av PC3 celler [26]. Men tilstedeværelsen av cadherin 11 alene ikke er tilstrekkelig for 3D-cellemigrering. For eksempel, N-cadherin mangelfull, men cadherin 11 uttrykkende celler er ikke migrerende i en 3D-matrise (se figur 4). Derfor kan ekspresjon av både N-cadherin og cadherin 11 eller potensielle interaksjoner mellom disse to distinkte cadherins være avgjørende for prostatakreft celle migrasjon.
E-til-N-cadherin bryter observert i PC3-celler er vanligvis observert i forskjellige cancere [2]. Ofte kreftceller nedregulerer normalt uttrykt cadherins (E-cadherin i tilfelle av prostatakreft), og opp-regulerer mesenchymale cadherins (for eksempel N-cadherin, cadherin 11 etc).
