Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er en veletablert mål for kreftbehandling. EGFR-tyrosinkinase (TK) inhibitorer, slik som gefinitib og erlotinib, har blitt utviklet som anti-kreft medikamenter. Selv om ikke-småcellet lungekreft med en aktiverende EGFR mutasjon, L858R, svarer godt til gefinitib og erlotinib, svulster med en dobbelt mutert EGFR, T790M-L858R, utvikler resistens mot disse stoffene.
C. elegans
EGFR homolog LET-23 og dens nedstrøms signalveien har blitt studert for å gi innsikt i reguleringsmekanismer bevart fra
C. elegans anbefale til mennesker. Å utvikle en
in vivo
screening system for potensielle kreftlegemidler rettet mot spesifikke EGFR mutanter, uttrykte vi tre LET-23 chimeras der TK domenet ble erstattet med enten den menneskelige villtype TK domene (LET-23: : hEGFR-TK), en TK domene med L858R mutasjon (LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]), eller en TK domene med de T790M-L858R mutasjoner (LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]) i
C. elegans
vulval celler med
la-23
promoter. Villtype hEGFR-TK kimære protein reddet
la-23
mutant fenotype, og aktiverings mutante hEGFR-TK chimeras indusert en multivulva (Muv) fenotype i en villtype
C. elegans
bakgrunn. Den anti-kreft narkotika gefitinib og erlotinib undertrykte Muv fenotype i LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] -expressing transgene dyr, men ikke i LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] transgene dyr. Som en pilot skjerm, ble 8,960 små kjemikalier testet for Muv undertrykkelse, og AG1478 (en EGFR-TK inhibitor) og U0126 (en MEK hemmer) ble identifisert som potensielle hemmere av EGFR-medierte biologisk funksjon. I konklusjonen, transgen
C. elegans
uttrykker kimære LET-23 :: hEGFR-TK proteiner er et modellsystem som kan brukes i mutasjonsspesifikke skjermer for nye anti-kreft narkotika
Citation. Bae YK, Sung JY, Kim YN, Kim S, Hong KM, Kim HT, et al. (2012) En
In Vivo C. elegans
modellsystem for screening EGFR-hemmende kreftmedisiner. PLoS ONE 7 (9): e42441. doi: 10,1371 /journal.pone.0042441
Redaktør: Anne C. Hart, Brown University, USA
mottatt: 20 mars 2012; Godkjent: 09.07.2012; Publisert: 05.09.2012
Copyright: © Bae et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet var utelukkende støttet av en forskningsstipend fra National Cancer Center (NCC-1110060) fra Sør-Korea (www.ncc.re.kr). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Utvikling av en høy gjennomstrømming og lave kostnader
in vivo
screening system for små molekyl anti-kreft reagenser ville ideelt sett være i stand til å overvinne de store problemene med konvensjonell
in vitro
screening metoder. På grunn av rask generasjonstid, høye avkom tall, lav pris, og godt etablerte genetiske verktøy, nematode
Caenorhabditis elegans product: (
C. Elegans
) er en attraktiv kandidat for en dyremodell screening system med mange av fordelene med
in vitro
screening systemer og dyremodeller [1].
EGFR er overuttrykt eller abnormt aktivert i ulike typer kreft hos mennesker, som brystkreft, eggstokkreft, og ikke-små-celle lunge karsinom (NSCLC) [2]. EGFR er involvert i forskjellige trinn i utviklingen av kreft inkludert tumorgenese, invasjon, metastase, og angiogenese [3], og gir således et attraktivt mål for kreftlegemiddelutvikling. Gefitinib (Handelsnavn: Iressa) var den første EGFR-TK inhibitor medikament utviklet for behandling av epiteliale kreftformer som NSCLC [4]. Mutasjoner i EGFR-TK domene har vært knyttet til gefitinib følsomhet i en undergruppe av lungekrefttilfellene, og har også blitt funnet å aktivere anti-apoptotiske trasé [5], [6].
C. elegans
vulval utvikling er et modellsystem veletablert benyttet for å studere EGFR signalveien [7] – [9]. Blant de seks vulval forløpercellene (VPCs), P5.p, P6.p, og P7.p adoptere de 2 ° -1 ° -2 ° celle skjebner, henholdsvis, og fortsette å dividere for å danne den modne vulva. Den 1 ° celle skjebne blir bestemt som et resultat av EGFR-Ras-signalisering i MAPK P6.p, mens den 2 ° celle skjebne bestemmes av LIN-12 /Notch signalisering i P5.p og P7.p, som aktiveres så et resultat av EGFR-Ras-MAPK signalering i nabocellen. Komponenter av EGFR pathway, inkludert EGFR, Ras, Raf, MEK, og MAPK, er høyt konservert mellom mennesker og
C. elegans product: [8]. Et begrenset antall kjemiske forbindelser som retter seg mot EGFR veien har blitt testet ved hjelp av
C. elegans
vulval utvikling som modell. Famesyltransferaseinhibitorene, som hemmer Ras aktivitet, og MCP forbindelser som forstyrrer Ras-Raf interaksjoner ble funnet å handle spesifikt på ortologe proteiner i
C. elegans
EGFR-Ras vei [10] – [12]. Toksisiteten av EGFR kinase-inhibitorer BIBU1361 og BIBX1382 ble også evaluert i
C. elegans product: [13]. Disse studiene tyder på at potensialet for bruk av
C. elegans
som et verktøy for anti-EGFR veien narkotika screening.
I denne studien har vi utviklet og analysert en human EGFR-drevet
C. elegans
modell, hvor de stiller ut Muv fenotype. Ved hjelp av denne modellen, ble en pilot skjermen på 8,960 kjemikalier gjennomført, og en EGFR-hemmer og en MEK hemmer ble isolert som dempere, noe som tyder på at dette
C. elegans
-basert system kan brukes effektivt til skjerm for nye EGFR-hemmende legemidler.
Materialer og metoder
Worm kultur og stammer
Wild-type N2 og mutantstammer ble dyrket som beskrevet av Brenner [14]. Mutant alleler som brukes i dette arbeidet er
la-23 (SY1), la-23 (SA62), la-60 (n1700) Hotell og
lin-15 (n765)
. Integrasjon linjer som brukes i dette arbeidet er
jgIs6 product: [
la-23p
:: LET-23 :: hEGFR-TK [L858R],
rol-6 (su1006)
],
jgIs19 product: [
la-23p
:: LET-23 :: hEGFR,
rol-6 (su1006)
],
jgIs25 product: [ ,,,0],
la-23p
:: LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R],
rol-6 (su1006), myo-2p :: mCherry
],
jgIs14 product: [
EGL-17p
:: EPJ-1 :: RFP,
dhs-31p
:: NLS :: GFP,
rol-6 (su1006)
], JJ1136 (HMP-1 :: GFP), PS4657 (AJM-1 :: GFP) og PS3352 (CDH-3 :: GFP).
Bygging av LET-23 :: hEGFR kimære plasmider
Vi brukte genomisk DNA av
la-23
gen og cDNA som koder for human EGFR. Hver DNA-fragment ble amplifisert ved PCR, klonet inn i pGEM-T enkel vektor (Promega Inc., Madison, WI, USA), og bekreftet ved sekvensering. Vi deretter satt sammen DNA-fragmenter ved bruk av passende restriksjonsenzymer og de tilsvarende områder av pPD117.01 vektor (Dr. Andrew Fire, Stanford Univ., CA, USA). QuikChange seterettet mutagenese (Cat # 200523, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) ble av EGFR-TK cDNA utført for å produsere EGFR [L858R], EGFR [T790M] og EGFR [T790M-L858R]. Den detaljerte prosedyre og primere anvendt i denne studien er gitt i tilleggsmaterialer (Fig. S1B). Å bruke som en sekundær celle skjebne markør, ble pJG205 konstruert ved å kombinere et PCR fragment forsterket fra genomisk DNA sekvensen 4,0 kb oppstrøms
EGL-17
med
emr-en
cDNA, DsRed ( RFP, Clontech av TAKARA Bio Inc.) og pPD95.77 (A. Brann). GFP kodende sekvens av pPD95.77 ble erstattet med DsRed cDNA. En annen celle skjebne markør, pJG207, ble gjort ved kloning
DHS-31
promoter regionen inn pPD95.69 (A. Brann), som inneholder SV40 kjernefysiske lokalisering signal (NLS) og GFP. Alle plasmid konstruksjoner ble bekreftet ved sekvensering.
Mikroinjeksjon og integrering
Injeksjon konsentrasjonen av DNA-konstruksjoner og markører var 75 mikrogram /ml pRF4 [
rol-6 (su1006)
], 50 eller 25 mikrogram /ml EGFR kimære plasmider, 50 mikrogram /ml
TTX-3 :: GFP
, 35 mikrogram /ml pJG205 [
EGL-17p
:: EPJ-en: : RFP], 40 mg /ml pJG207 [
dhs-31p
:: NLS :: GFP] og 5 mikrogram /ml pCFJ90 [
myo-2p
:: mCherry] (Addgene, Cambridge, MA, USA). Det totale DNA-konsentrasjonen av hvert injeksjonsblandingen var 150 ug /ml, med pBluescript SK + DNA som tilsettes når det er nødvendig. Alle integrerte linjene ble gjort ved hjelp av UV-bestråling og ut-krysset fire ganger.
Mikroskopi og Hoechst33342 flekker
Alle mikroskopiske bilder ble tatt og behandlet ved hjelp av en AxioCam HRc digitalt kamera festet til en Imager M1 fluorescens mikroskop og Axiovision Rel. 4.6 programvare (Zeiss Inc., Tyskland). For Hoechst33342 (Molecular Probes of Life Technologies Co., Grand Island, NY, USA) farging,
jgIs6
ormer ble høstet og vasket flere ganger med M9 buffer. Ormene ble så fuktet i 1 ug /ml Hoechest33342 løsning i 30 minutter. Etter vasking, ble ormer forberedt for observasjon.
Kjemisk behandling og statistikk
Kjemi inkludert gefitinib, erlotinib, U0126, AZD6244, PD0325901 og WZ4002 ble kjøpt fra Selleck Chemicals LLC. (Houston, Texas, USA), og 1280 kjemiske bibliotek ble kjøpt fra Sigma-Aldrich LLC. (St. Louis, Missouri, USA). De andre 7680 kjemikalier ble hentet fra Korea Chemical Bank of KRICT. Kjemikalier ble oppløst i 100% DMSO-løsning, og ble holdt ved -20 ° C i 1 eller 10 mM lager for screening. Alle kjemiske tester ble utført i 96-brønners plater, og sluttvolumet per brønn var 100 pl inkludert ormer, kolesterol, og døde
E. coli
. DMSO konsentrasjonen av kontrollgruppen ble holdt på 0,5%, og DMSO-konsentrasjonen i alle forsøksgrupper var under 0,5%. Den endelige kjemiske konsentrasjonen som anvendes for skjermen var 5 um og 20 til 50 L1 ormer ble dyrket i hver brønn av 96-brønns plate. Hvert kjemisk test inkluderte minst tre brønner pr kjemisk og ble gjentatt minst to ganger. Feilen barer i alle grafer representere SD (standardavvik), og
P
verdier i forhold til kontrollgruppen ble beregnet ved uparede Student
t
-Test.
Resultater
kimære LET-23 :: hEGFR-TK protein er funksjonell i
C. elegans
For å utvikle en
C. elegans
modellsystem for å skjerme for kjemikalier som hemmer human EGFR (hEGFR) aktivitet, har vi designet plasmid konstruksjoner som uttrykker
C. elegans
EGFR ortolog, LET-23, og den hEGFR fusjonsproteinet, ved å bytte den cytoplasmatiske eller TK domene av LET-23 med hver hEGFR domene (Fig. 1A og S1 fig.). Vi forsøkte å legge til rette for funksjonelle uttrykk for den menneskelige motstykke i
C. elegans
ved å beholde mesteparten av
C. elegans
LET-23 koding og regulatoriske sekvenser, for eksempel, ved å holde C-terminale residuer viktig for riktig handel [15]. De antatte proteinprodukter av disse transgener har 1388 aminosyrer (LET-23 :: hEGFR) eller 1323 aminosyrer (LET-23 :: hEGFR-TK). Som vist i figur 1A og fig S2, LA-23 :: hEGFR omfatter 841 aminosyrer av la-23 N-terminale domene, 542 aminosyrer av humant EGFR C-terminale domene, og 5 aminosyrer av la-23 PDZ samspill motiv. LET-23 :: hEGFR-TK omfatter 841 aminosyrer av la-23 N-terminale domene, 306 aminosyrer av det humane EGFR-TK domene, og 176 aminosyrer av la-23 C-terminale domenet. For å teste om dette kimære LET-23 :: hEGFR-TK protein er funksjonelle, ble konstruksjonen microinjected inn i
la-23 (SY1)
mutant. Mest
la-23
mutanter er dødelige, men
la-23 (SY1)
er levedyktig og vulvaless (Vul) på grunn av avvikende smugling av LET-23 [15] – [17]. Det kimære LET-23 :: hEGFR-TK protein reddet Vul fenotype av
la-23 (SY1) plakater (Fig. 1B), noe som indikerer at kimære protein er funksjonell i
C. elegans
. Når
la-23 (SY1)
mutant ble reddet med
jgIs19
, en integrert belastning inneholder LET-23 :: hEGFR transgenet,
la-23 (SY1); jgIs19
belastning viste en betydelig redusert vulvaless befolkning (9,1%) sammenlignet med
la-23 (SY1)
mutant (92%) (fig. S1C).
(A) LET-23 og lA-23-baserte kimære reseptor konstruksjoner. Alle konstruksjonene ble laget for å uttrykke hver kimære reseptor fra
la-23
promoter. (B) Den LET-23 :: hEGFR-TK chimera redder vulvaless fenotype av
la-23 (SY1)
mutant. (C) En sammenligning av flere MUV mutanter og
jgIs6
transgen belastning som uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [L858R].
C. elegans
uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] viste en større pseudovulva sammenlignet med
la-23 (SA62) Hotell og
la-60 (n1700)
MUV mutanter. (D) Hoechst33342 (H33342) farging av pseudovulval regionen i
jgIs6
avdekket mange kjerner. Eske regionen i nedre panelet er forstørret i panelet til høyre. (E) Uttrykk for en 1 ° celle markør, CDH-3 :: GFP i vill-type orm og
jgIs6
. CDH-3 :: GFP er sterkt uttrykt både i vulva og pseudovulva av
jgIs6
. (F) Uttrykk for 2 ° vulval celle skjebne markører i
lin-15
Muv mutant og
jgIs6
. Reporter gener kontrollert av arrangører av
EGL-17
og
dhs-31
ble uttrykt i vulva og pseudovulva. Pilspisser indikerer normal vulvae og små piler indikerer pseudovulvae. Skala barer, 50 mikrometer.
Neste, vi vurdert effektene av over-uttrykker aktive mutant form av LET-23 :: hEGFR-TK i en
la-23
( +) bakgrunn. Økt aktivitet av EGFR-Ras-MAPK pathway resultater i hyper-induksjon av vulval celler, referert til som en Muv fenotype, som er sett med semi-dominant
la-23 (SA62)
mutasjon og konstitutivt aktiv
la-60 (n1700)
mutasjon.
lin-15
fungerer oppstrøms
la-23
til negativt regulere EGFR-Ras-MAPK veien [18]. Denne negative reguleringen blir forstyrret i
lin-15 (n765)
mutant, noe som resulterer i en sterk Muv fenotype [18], [19]. Derfor forventet vi at de aktiverende mutasjoner i EGFR-TK regionen vil også føre til en Muv fenotype. To aktiverende EGFR mutasjoner som gefitinib følsomhet for visse lungekrefttilfellene ble testet: EGFR [L858R] og EGFR [Δ747-752] [20], [21]. I-ramme delesjoner i ekson 19 inkludert Δ747-749 (44%), og enkle punktmutasjoner i ekson 21 inkludert L858R (41%) er de hyppigst EGFR-TK aktiverende mutasjoner i NSCLC [20]. Den gefitinib bestandig EGFR [T790M-L858R] mutasjonen ble også testet. T790M er en sekundær mutasjon som endows gefitinib motstand mot L858R lesjon [21]. Chimeriske LET-23 :: hEGFR-TK inneholdende en hvilken som helst av disse mutasjonene indusert hyper-induksjon av vulval cellene som resulterer i en Muv fenotype (Fig. 1C og tabell 1). Transgene dyr uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] eller LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] hadde en fenotype som ligner på
lin-15 (n765)
, med 2-4 stor pseudovulvae. I kontrast transgene dyr som uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [T790M] viste ikke en Muv fenotype. For å lette videre analyse, valgte vi en LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] transgen linje for å generere
jgIs6
, en stamme med den transgene matrise integrert i genomet. Integrering av transgenet kraftig forbedret pene av Muv fenotype; 49% Muv før integrasjon versus 94,6% Muv etter integrering (tabell 1). Farging av kjerner med Hoechst33342 avslørte tilstedeværelsen av flere kjerner i den pseudovulval regionen (Fig. 1D), og dette betyr at celletall ble økt i den pseudovulva av vår transgen belastning lik andre Muv mutanter så som
la-60 ( n1700)
, og
lin-15 (n765)
. Transgene dyr viste en rullende fenotype fordi pRF4 [
rol-6 (su1006)
] ble anvendt som en transgen markør. For å lette Muv fenotype deteksjon, introduserte vi
SQT-en (jg52)
mutasjon i de transgene linjer. Dette
SQT-en
mutant undertrykker rullende fenotype av
rol-6
uten åpenbare mangler [23]. Uventet, fant vi at
SQT-en (jg52)
mutasjon forbedret Muv fenotype av EGFR transgene linjer (tabell 2).
Den Muv fenotype av
jgIs6
skyldes ektopisk aktivering av LET-23 /EGFR sti
for å bekrefte at pseudovulvae dannelse i
jgIs6
skyldes spesifikk aktivering av EGFR-Ras-MAPK sti ved kimære LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] protein, utførte vi RNAi av gener i EGFR-Ras-MAPK veien. I samsvar med ektopisk aktivering av EGFR-Ras-MAPK vei, knock-down av gener nedstrøms
la-23
, inkludert
la-60 /Ras, mek-2 /MEK
, og
MPK-1 /MAPK
, undertrykte Muv fenotype av
jgIs6
. RNAi av LET-23 /EGFR oppstrøms genet
lin-3 /EGF
også undertrykte Muv fenotype. Den Muv fenotype av en annen transgen linje,
jgIs25
, som uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [L858R-T790M], ble også undertrykt av RNAi av
lin-3, la-60, mek -2
, og
MPK-en product: (fig S3A.). Siden Wnt veien fungerer parallelt med
lin-3
å opprettholde VPC kompetanse [24], også utførte vi Wnt sti genet knockdown av RNAi å teste om Wnt aktivitet påvirker Muv formasjonen i
jgIs25
. To Wnt pathway gener (
bar-1 Hotell og
cwn-2
) ble testet, fordi deres knockdown fenotyper er forbundet med vulval utvikling [25], [26]. I likhet med
lin-3
knockdown, RNAi av
bar-en
eller
cwn-2
resulterte i undertrykkelse av Muv fenotype av
jgIs25 product: ( ). Vi observerte sjelden larvedødelighet fra disse RNAi eksperimenter fordi synkronisert L1 larver ble behandlet med RNAi, samme som samme metode som vi brukte for medikamentell behandling er beskrevet nedenfor. For å bekrefte den dødelige RNAi effekten av EGFR nedstrøms gener, behandlet vi
jgIs25
L4 larver med
la-60
eller
MPK-en
RNAi, og telte antall F1 avkom. Larve dødelighet var signifikant økt med
la-60
eller
MPK-en
RNAi (Fig. S3C).
Vi har sammenlignet vulval celle skjebne markører i
jgIs6
og MUV mutanter som har EGFR-Ras-MAPK veien aktivert. Når en ° celle skjebne markør ble undersøkt,
jgIs6
pseudovulvae viste uttrykk for en ° celle skjebne markør CDH-3 :: GFP (Fig. 1E). CDH-3 er en cadherin uttrykt i 1 ° Vul C, D, E og F celler [27]. For å teste for 2 ° skjebne markør uttrykk, bygget vi en integrert transgen linje som uttrykker både
EGL-17p
:: EPJ-1 :: RFP og
dhs-31p
:: NLS :: GFP . EGL-17 er uttrykt i de 2 ° Vul C og D-celler, og DHS-31 i 2 ° vul B1, B2, og D-celler på voksne stadiet [27], [28]. EMR-1 er en homolog av human integral nukleær membranprotein emerin [29], og derfor fører til lokalisering på atom konvolutten. I en villtype bakgrunn,
EGL-17p
:: EPJ-1 :: RFP og
dhs-31p
:: NLS :: GFP uttrykkes ved kjernekraft konvolutten og kjernen av 2 ° vulval-celler, respektivt. Begge
lin-15 (n765) Kjøpe og
jgIs6
dyrene hadde lignende mønstre av uttrykk for
EGL-17p
:: EPJ-1 :: RFP og
dhs -31p
:: NLS :: GFP (fig. 1F). For ytterligere sammenligning av
jgIs6 Kjøpe og MUV mutanter, undersøkte vi uttrykket av AJM-1 :: GFP og HMP-1 :: GFP, som begge er uttrykt i adherens krysset og markere grensene for voksende og differensierende epitelceller [30]. AJM-1 :: GFP og HMP-1 :: GFP uttrykk ble observert i ventral invaginations, inkludert mulige pseudovulval regioner i
jgIs6
,
la-60 (n1700)
, og
lin-15 (n765)
mutanter ved L4 scenen. Disse to koblings markører ble også observert i pseudovulva av
jgIs6
på det voksne stadiet (Fig. S4). Til sammen resultatene beskrevet ovenfor tyder på at
jgIs6
transgen belastning uttrykker kimære LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] protein visningsegenskaper som er i samsvar med over aktivering av EGFR veien i Muv mutanter.
Gefitinib og erlotinib hemme Muv fenotype av
jgIs6
for å finne ut om
jgIs6
transgen belastning uttrykker kimære LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] protein kan brukes i en storstilt skjerm for menneske EGFR-TK-hemmere, testet vi effekten av narkotika gefitinib og erlotinib. Når villtype
C. elegans
ble behandlet med gefitinib, selv høye doser (40 mm) ikke påvirke embryogenesen eller larveutvikling (Fig. 2A). Dette indikerte at gefitinib er ikke giftig for villtype
C. elegans
, og ser ut til å ha liten eller ingen virkning på LET-23 funksjon, som ikke er overraskende gitt lav sekvensidentitet med det humane EGFR-proteinet eller korrelasjon av respons gefitinib og aktiverende EGFR mutasjoner [31]. I motsetning til dette Muv fenotypen til
jgIs6
ble hemmet opp til 90% ved en uM gefitinib og fullstendig hemmet ved 5 uM gefitinib (Fig. 2B og C). Tatt i betraktning at 250 eller 500 mg gefitinib oralt en gang daglig anbefales for kreftpasienter (ca. 10 mm) [4], [32], den hemmende effekten av gefitinib ser ut til å være lik i
C. elegans Hotell og mennesker. For å verifisere virkningsmekanismen til reversible EGFR-TK-hemmere (TKI) for vår LET-23 :: hEGFR-TK-uttrykke transgene
C. elegans
, vi behandlet
jgIs25
med gefitinib. Den T790M-mutasjonen kan resultere i en endring av EGFR topologi som utelukker bindingen av reversible EGFR-TKI gjennom sterisk hindring, eller T790M kan øke affiniteten til kinasedomenet av ATP [21], [33] – [35]. Gefitinib behandling hemmet ikke Muv fenotype av
jgIs25 plakater (Fig. 2C). Erlotinib, en annen EGFR-TKI anti-kreft narkotika, produsert lignende hemmende effekter til gefitinib (Fig. 2D). Vi prøvde å sammenligne uttrykket nivået på to kimære proteiner fra
jgIs6 Hotell og
jgIs25
, men vi klarte ikke å kvantifisere kimære protein. Forutsatt tilsvarende nivåer av transgene uttrykk, er den observerte forskjellen i aktivitet trolig på grunn av en nedgang i narkotika følsomhet gitt av den L858R mutasjon.
(A) En høy dose av gefitinib (40 mm) ikke påvirke normal embryogenese , larvevekst, eller vulval dannelsen av villtype
C. elegans
. (B) Gefitinib hemmet Muv fenotype av
jgIs6
som uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [L858R]. (C) Gefitinib hemmet Muv fenotype av
jgIs6
på en doseavhengig måte, men hemmet ikke at av
jgIs25
, som uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R ]. Antall ormer telles (
n
) var 159, 96, 130, 85, 87, 125, 108 og 88 fra venstre langs X-aksen. (D) Erlotinib produsert en lignende effekt som gefitinib i både
jgIs6 Hotell og
jgIs25
modeller. (
n
= 159, 96, 67, 110, 80, 106, 95 og 176). (E) Fastsettelse av utviklingsstadiet av
jgIs6 Hotell som er mest mottakelig for gefitinib. Som i normal vulval utvikling, tidlig larver (L1-L3) responderte godt på gefitinib. (
n
= 128, 224, 134, 116, 139, 167, 99 og 66). Skala barer, 50 um (A, B). X-aksen, konsentrasjon av gefitinib (C), erlotinib (D) og snekketrinn gefitinib behandling (E). Y-aksen,% av ormer som viser Muv fenotype (C-E). *
P
. 0,001
For å bestemme stadium av ormen utvikling der gefitinib behandling er mest effektiv, vi behandlet
jgIs6
av hver larvestadiet med 1fiM gefitinib, og scoret Muv fenotype på voksne stadiet. Dyr utsettes for gefitinib fra L1, L2 eller L3 stadier viste en markant reduksjon i Muv fenotype, og graden av respons var lik mellom de tre stadier (Fig. 2E). L4 dyr var ikke så utsatt for gefitinib, noe som indikerer at gefitinib behandling før L3 /L4 molt når vulval utvikling initierer, er avgjørende for effektiv hemming av LET-23 :: hEGFR-TK [L858R] protein. Fra dette resultatet, konkluderte vi med at tidlig larver fra L1 til L3, kan brukes for screening nye hemmere mot aktivert EGFR-TK signalveien.
Pilot skjermen for hemmere som hemmer Muv fenotype av
jgIs6
Basert på våre tidlige resultater, vi utviklet en protokoll for stor-skala high-throughput screening av EGFR-hemmere ved hjelp av
jgIs6
. For å forberede et stort antall synkronisert larver,
C. elegans
ble dyrket inntil platene var fylt med egg, og larver og voksne ble fjernet ved enkel vask med M9 buffer. Etter 12 timer ble klekket larver høstet og vasket tre ganger med M9 buffer. Vi dispenseres L1 larver i 96-brønners plater som inneholdt en blanding av død
E. coli Hotell og kjemikalier som blir testet. Etter 3-4 dager ble Muv fenotype observert på et disseksjonsmikroskop (fig. 3A). Ved hjelp av denne protokollen, gjennomførte vi en skjerm på 1280 små molekyler med kjente molekylære mål og effekt. Blant de 1280 kjemikalier, AG1478 og U0126 hemmet Muv fenotype av
jgIs6
. AG1478 er en EGFR-inhibitor hyppig brukt i
in vitro
eksperimenter, med en struktur som ligner på gefitinib (Fig. 3B). U0126, som er kjent som en inhibitor av MEK, inhiberte
jgIs6
Muv fenotype ved 5 uM, men ikke ved lavere konsentrasjoner (Fig. 3C). Når virkningene av AG1478 og U0126 på gefitinib bestandige LET-23 :: hEGFR-TK [T790M-L858R] modell
jgIs25
ble testet, bare U0126 hadde en inhibitorisk effekt, mens AG1478 var ineffektiv (fig. 3D).
(A) Screening metode, inkludert synkronisering av
C. elegans Hotell og flytende kultur hjelp av 96-brønns plate for inhibitor skjermen. (B) Kjemiske strukturer av gefitinib, AG1478 og U0126. (C) Både AG1478 og U0126 hemme Muv fenotype av
jgIs6
på en doseavhengig måte. (
n
= 295, 193, 381, 133, 254, 304 og 415 fra venstre langs X-aksen). (D) Effekt av gefitinib, erlotinib, AG1478 og U0126 på
jgIs25
. Gefitinib, erlotinib, og AG1478 hemmet ikke Muv fenotype av
jgIs25
, men U0126 hemmet. (
n
= 81, 99, 106, 90 og 81). Kjemisk konsentrasjon, 5 mikrometer. *
P
. 0,001
MEK-hemmere kan potensielt behandle gefitinib-resistente kreft
observasjon at U0126 hemmet Muv fenotype av
jgIs25
antydet at noen MEK-hemmere kan ha potensial til å hemme gefitinib-resistente former av EGFR mutasjoner. Derfor, testet vi effektene av en annen MEK-inhibitor, PD0325901, samt en Raf [V600E] inhibitor (AZD6233), og en EGFR [T790M] inhibitor (WZ4002) i vår modell system. Ingen av disse kjemikaliene inhiberte Muv fenotypen til
jgIs6
dyr i doser som er effektive for U0126 (1 uM eller 5 uM) (Fig. 4A). Men ved høyere doser (5 mikrometer eller 20 mm), MEK hemmer PD0325901 litt hemmet Muv fenotype av
jgIs25 plakater (Fig. 4B). Disse resultatene ble bekreftet i en side-by-side test, der
jgIs6 Hotell og
jgIs25
dyrene ble behandlet med 100 mikrometer av hver kjemiske å observere effektene på Muv fenotype. WZ4002, som er en hemmer mot EGFR [T790M] gatekeeper mutasjon [36], hemmet Muv fenotype av
jgIs25
bedre enn for
jgIs6
. I likhet med U0126, PD0325901 helt hemmet Muv fenotype av både
jgIs6 Hotell og
jgIs25 plakater (fig. 4C). Vi har også testet om disse kjemikaliene mål
C. elegans
gener ved å behandle
lin-15
Muv mutant med U0126 og PD0325901. Både U0126 og PD0325901 undertrykte Muv fenotype av
lin-15
på en overdreven konsentrasjon (fig. 4D). Dette resultatet tyder på at
mek-2
, en av Meks i
C. elegans Hotell som er relatert til vulval utvikling, er en av de mulige målet kandidater av U0126 og PD0325901.
(A) U0126, PD0325901 (MEK hemmer), AZD6244 (RAF [V600E] hemmer) og WZ4002 (EGFR [T790M] inhibitor) ble satt til
jgIs6
. (
n
= 86, 94, 116, 64, 88, 66, 79, 110 og 98 fra venstre langs X-aksen). (B) Kjemikalier ble lagt til gefitinib resistente
jgIs25
. MEK-hemmere, U0126 og PD0325901, hemmet Muv fenotype av
jgIs25
, men de andre kjemikaliene ikke gjorde det. (
n
= 64, 100, 128, 113, 89, 64, 63, 79 og 98). (C) For store doser (100 mm) av kjemikalier ble lagt til
jgIs6 Hotell og
jgIs25
. To MEK-hemmere perfekt hemmet Muv fenotype av
jgIs6 Hotell og
jgIs25
. WZ4002 hemmet Muv fenotype av
jgIs25
bedre enn for
jgIs6
. (
n
= 160, 213, 186, 312, 195, 323, 192 og 237). (D) Muv fenotype av
lin-15
ble undertrykt av U0126 og PD0325901; kjemisk konsentrasjon, 100 pM (X-aksen). (
n
= 119, 89, 90 og 143). *
P
0,001
Alle transgene stammer som uttrykker de aktiverte EGFR chimeras, inkludert
jgIs6 Hotell og
jgIs25
, vokser sakte (. fig. 5A og S5) tilsvarende transgene stammer fig. ectopically uttrykker LIN-3 /EGF [37]. Interessant, EGFR-TK inhibitorer reparert vekstrate på
jgIs6
til nivået av villtype, og U0126 og PD0325901 reddet vekst på både
jgIs6 Hotell og
jgIs25
(fig. 5B).
(A) prosenter av voksne 3 dager etter at embryoene på tallerkenen. Alle villtype stammer var voksne, men de fleste
jgIs6 Hotell og
jgIs25
transgene stammer var yngre enn L4 scenen. Fem voksne ble overført til hver plate og ble fjernet etter 6 timer etter egglegging. Tre dager etter fjerning P0 ormer, ble F1 ormer observert. Fire plater ble tellet for hver stamme. (
n
= 488, 313, 104 og 94 fra venstre langs X-aksen). *
P
0,001 og **
P
0,05. (B) U0126 og PD0325901 trykt langsom vekst fenotype av
jgIs6 Hotell og
jgIs25
. Gefitinib og AG1478 trykt langsom vekst fenotype av
jgIs6
, men ikke
jgIs25
. L1-generasjons larver ble inkubert med hver kjemikalie i 4 dager i 96-brønners plater, og de ble gjenvunnet på en ny plate i 6 timer før tar bilder.
C. elegans
vokste langsomt når de dyrkes i 96-brønners plater. Kontroll (0,5% DMSO) og kjemisk konsentrasjon (50 pM). Scale bar, 500 mikrometer.
Diskusjoner
Vi konstruerte transgen
C. elegans
inneholder flere forskjellige EGFR konstruksjoner. Transgene linjer som uttrykker LET-23 :: hEGFR kimære reseptorer, viste en mye sterkere fenotype enn de som uttrykker LET-23 :: hEGFR-TK kimære reseptorer (tabell 1). Dessverre, vi klarte ikke å få integrasjonslinjer for disse konstruksjonene, og bare har data produsert fra integrasjons linjer av LET-23 :: hEGFR-TK transgene linjer. Den cytoplasmatiske hale av hEGFR kan ha utviklet seg til å overføre de aktiverte signalene mer effektivt enn LET-23,
C. elegans
EGFR, selv i VPCs.
For å etablere vår modell system, kimære LET-23 :: hEGFR-TK transgenet ble uttrykt i en
la-23 product: (+) bakgrunn . Potensialet dannelsen av heterodimerer av endogen LET-23 med kimære LET-23 :: hEGFR-TK protein kan forklare noen observasjoner som ble gjort i løpet av vår studie. Det hender at vi observerte at høye doser av gefitinib hemmet normal vulval utvikling i
jgIs6
.
