Abstract
Bakgrunn
Sphingosine kinase-en (SphK1) er et onkogen lipid kinase særlig involvert i respons på anticancer behandling i prostatakreft. Androgener regulere prostatakreft celleproliferasjon, og androgen deprivasjon terapi er standard vare i behandling av pasienter med avansert sykdom. Her, vi utforsket rollen SphK1 i reguleringen av androgen-avhengige prostatakreft cellevekst og overlevelse.
metodikk /hovedfunnene
Kortsiktig androgen fjerning induserte en rask og forbigående SphK1 hemming forbundet med en redusert cellevekst in vitro og in vivo, en hendelse som ikke ble observert i hormono-ufølsomme PC-3-celler. Støtte den kritiske rollen SphK1 hemming i den raske effekten av androgen utarming, kan dens overekspresjon svekke cellevekst reduseres. Tilsvarende tilsetning av dihydrotestosteron (DHT) til androgen-belastede LNCaP-celler gjenetablert celleproliferasjon, gjennom en androgen reseptor /PI3K /Akt avhengig stimulering av SphK1, og inhibering av SphK1 kunne vesentlig hindre effektene av DHT. Omvendt, langsiktig fjerning av androgen støtte i LNCaP og C4-2B celler resulterte i en progressiv økning i SphK1 uttrykk og aktivitet gjennom progresjon til androgen-uavhengighet staten, som var preget av oppkjøpet av en nevroendokrin (NE) -lignende celle fenotype. Viktigere, hemming av PI3K /Akt sti-by negativt påvirket SphK1 aktivitets kan hindre NE differensiering i begge cellemodeller, en hendelse som kunne etterlignet av SphK1 hemmere. Fascinerende ble reverserbarhet av NE fenotype ved eksponering for normal medium koblet med en uttalt hemming av SphK1 aktivitet.
Konklusjon /Betydning
Vi rapporterer det første beviset på at androgen deprivasjon induserer en differensialeffekt på SphK1 aktivitet i hormonfølsom prostatakreft cellemodeller. Disse resultatene antyder også at SphK1 aktivering ved kronisk androgen deprivasjon kan tjene som en kompenserende mekanisme som tillater prostata kreftceller til å overleve i androgen-utarmet miljø, som gir støtte til den hemmende effekten som en potensiell terapeutisk strategi for å utsette /forhindre overgangen til androgen-uavhengig prostata kreft
Citation. Dayon A, Brizuela L, Martin C, Mazerolles C, Pirot N, Doumerc N et al. (2009) Sphingosine Kinase-en står sentralt i Androgen-regulert prostatakreft vekst og overlevelse. PLoS ONE 4 (11): e8048. doi: 10,1371 /journal.pone.0008048
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 23 juli 2009; Godkjent: 02.11.2009; Publisert: 26.11.2009
Copyright: © 2009 Dayon et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Inserm, CNRS, Fondation pour la Recherche MEDICALE, Association pour la Recherche sur les Tumeurs de la prostata, og Institut National du Cancer (OC). AD er mottaker av Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche og La Ligue Nationale Contre le Cancer. CM er mottaker av Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste kreft står for 25% av alle nydiagnostiserte krefttilfeller hos menn, og er den nest største årsaken til død av kreft [1]. Primær behandling med kirurgi eller strålebehandling hos pasienter med organ begrenset prostatakreft demonstrerer ordnede 10-års overlevelse på over 75% [2], [3]. På tross av det, er det anslått at approximatively 15% av pasientene som finnes lokalt avansert eller metastatisk sykdom, og ca 40% av pasientene vil få tilbakefall etter lokalbehandling [4].
Prostatakreft celleproliferasjon er regulert av androgener og androgen deprivasjon terapi (ADT) er standarden på omsorg i behandling av pasienter med avansert sykdom. ADT er opprinnelig effektiv, noe som reduserer både prostata størrelse og prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer, men til slutt alle pasientene blir resistente mot hormonelle manipulasjon [4]. ADT induserer endringer i sykdomsutviklingen fremme sin progresjon til androgen-ildfast tilstand eller hormon-ildfast prostatakreft (hrpc) fenotype, med en tilhørende forventet levealder på bare 15 til 20 måneder. Det er ikke klart hvordan prostatakreftceller gjøre overgangen fra androgen-avhengige til androgen-uavhengig status etter ADT. Blant de mange mekanismer som er involvert i å omgå virkningene av androgen ablasjon, og aktivering av fosfatidylinositol-3-kinase /akt (PI3K /Akt) signalering er beskrevet som en sentral bane [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9]. Viktigere kliniske studier har bekreftet viktigheten av Akt-aktivering i prostata cancer progresjon til androgen uavhengighet og dårlig klinisk resultat [10], [11], [12], [13], [14].
Tallrike studier har vist at, etter langvarig ADT, prostata kreft celler skaffe en nevroendokrin (NE) -lignende fenotype fører til svulstpopulasjonene beriket i NE celler. NE-celler utgjør en mindre komponent av normal prostata og skiller ut en rekke neuropeptider som kan indusere mitogene virkninger på tilstøtende kreftceller i androgen-utarmet betingelser [15]. Selv NE celler har vært beskrevet i flere tiår siden, har deres funksjonelle roller i prostata kreft progresjon først nylig fått stor oppmerksomhet. Nevroendokrine svulster og serum biomarkører er oppregulert etter ADT i prostatakreftpasienter som indikerer en dårlig prognose [16], [17], [18], [19]. Konsekvent til kliniske observasjoner, er androgen tilbaketrekking-indusert NE differensiering også sett i cellekultur og dyremodeller [20], [21], [22], [23], [24], og den transgene adenokarsinom i mus prostata modell av prostata (TRAMP) kreft viser en markant økning i prostata nevroendokrine cellepopulasjonen med sykdomsprogresjon [25].
Sphingosine 1-fosfat (S1P) er et lipid megler som spiller en viktig regulerende rolle i tumorcellevekst, overlevelse , invasjon, og angiogenese [26]. Balansen mellom de cellulære nivåer av S1P og dens metabolske forløpere ceramider og sfingosin regnes som en bryter som kan avgjøre om en celle proliferates eller gjennomgår apoptose eller vekst arrest [27]. En viktig regulator av denne balansen er sfingosin kinase-1 (SphK1), enzymet omdanne sfingosin til S1P. SphK1 tjener den doble funksjon av å produsere pro-vekst, anti-apoptotisk S1P, og redusere intracellulære nivåene av pro-apoptotiske ceramid. Videre understøtter en rolle for SphK1 i å fremme kreft, har SphK1 blitt funnet å virke som et oncogen [28], dens mRNA blir overuttrykt og positiv farging for SphK1 ble funnet i forskjellige tumorer [29], [30], [31], [ ,,,0],32], [33], og økningen i SphK1 uttrykk i tumor biopsier ble korrelert med kort overlevelse hos pasienter med glioblastom og brystkreft [30], [34]. I tillegg er SphK1 enzymatisk aktivitet og ekspresjon markert økning i tumorprøver fra prostata kreftpasienter (sammenlignet med normale motstykker) å korrelere med andre markører, slik som PSA-nivå, tumor klasse så vel som med det kliniske resultatet etter prostatektomi (Malavaud og Cuvillier, innsendt). Mens SphK1 aktivitet kan bli stimulert av et bredt spekter av vekstfaktorer [26], vi har tidligere vist i prostata cancer celler og dyremodeller som antikreftbehandlinger (kjemoterapeutiske midler eller ioniserende stråler) føre til dens inhibering antyder at SphK1 kunne virke en sensor for å anticancer behandling [35], [36], [37], [38].
i denne studien har vi utforsket potensielle rolle SphK1 i reguleringen av androgen-avhengige cellevekst og overlevelse i hormon sensitive LNCaP prostatakreft cellemodell. For første gang viser vi at androgen deprivasjon utøver en kontrastvirkning på SphK1. Mens kortsiktig androgen tilbaketrekking induserte en midlertidig hemming av SphK1, kronisk androgen uttømming utløste en oppregulering av SphK1 korrelere med NE differensiering av LNCaP og C4-2B celler som støtter involvering av SphK1 i utviklingen mot androgen-uavhengighet.
Resultater
Short-Term androgen deprivasjon Reduserer Cell Proliferation i LNCaP – men ikke i PC-3 celler – og er forbundet med redusert SphK1 aktivitet
Celleproliferering ble kraftig redusert overtid CSS (androgen fritt medium) -behandlet LNCaP celler sammenlignet med FBS (som inneholder lave nivåer av androgener) behandlet celler (fig. 1A, venstre panel). For å støtte MTT resultater, celletelling (Fig. 1A, midtre panelet) og [
3H] tymidin inkorporering (fig. 1A, panel høyre) målinger bekreftet at CSS forhold hatt en dramatisk virkning på cellenummer og DNA-syntese etablere at MTT kan brukes som et surrogat indeks for cellulær proliferasjon i vår modell celle. Dette ble også korrelert med utskillelsen av PSA-nivå som var sterkt redusert i begge CSS-behandlede celler sammenlignet med FBS-behandlede celler (Fig. 1B). Tvert imot, har androgen deprivasjon ikke forandre vekst av PC-3-hormono ildfast (HR) celler hvis vekst er bare endret av serum sult (Fig. 1C) .Når sammenlignet med FBS betingelser, androgen uttømming i LNCaP-indusert en merkbar nedgang i SphK1 aktivitet innen de første 24 timer (fig. 1D, venstre panel). Senere ble en rebound i SphK1 aktivitet observert, som ble betydelig utover 4 dagers behandling (Fig. 1D, venstre panel). I PC-3 celler, ble en betydelig og varig reduksjon i SphK1 aktivitet kun observert etter serum deprivasjon forhold (Fig. 1D, panel til høyre). speiling effekten på celleproliferasjon (Fig. 1C). Som forventet i PC-3 celler som er upåvirket av CSS forhold, kan ingen signifikante SphK1 endringer være dokumentert (Fig. 1C, D).
Overnatting serum fratatt LNCaP (
En
,
D
) og PC-3 (
C
,
D
) celler ble inkubert i nærvær av 5% FBS, 5% CSS eller uten serum (SFM) i de angitte tidsrom . Celleproliferasjon i LNCaP (
En
,
venstre panel
) og PC-3 celler (
C
) ble bestemt ved MTT-analyse og uttrykt som prosent av kontroll i begynnelsen av forsøket (dag 0). Celle nummer (
En
,
midtre panelet
) og DNA-syntese (
En
,
høyre panel
) ble målt som beskrevet i materialer og metoder.
Kolonner
, mener minst tjuefire uavhengige eksperimenter for MTT-analyse og seks eksperimenter for celletelling og DNA-syntese;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001. Utskilt PSA-nivå ble målt i kulturmedier fra LNCaP celler (
B
).
Kolonner
, mener på minst seks uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001.
D
ble SphK1 aktivitet bestemmes i både LNCaP og PC-3 celler og uttrykt som prosent av FBS-behandlede celler.
Kolonner
, mener minst tolv og seks uavhengige eksperimenter for LNCaP og PC-3 celler henholdsvis;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; **
P
0,01; *,
P
0,05; ns, ikke-signifikant.
Effekten av Kastrering i Orthotopically Xenotransplanted SCID mus er assosiert med SphK1 Hemming
Effekten av androgen deprivasjon ble neste undersøkt
in vivo
ved hjelp av en kirurgisk implantering ortotopisk (SOI) av LNCaP og PC-3-celler som overuttrykker GFP [36]. Ni og tre uker etter SOI av LNCaP /GFP og PC-3 /GFP celler henholdsvis ble SCID mus randomisert i to grupper og utsatt for kastrering eller humbug behandling. Som vist ved høy forstørrelse mikroskopi av en representativ primær LNCaP /GFP tumor, kastrering forårsaket en dramatisk reduksjon i tumorvolum og masse (Fig. 2A og B) i løpet av 7 dager etter behandling, sammenlignet med narrebehandlede dyr. Effekten av kastrering ble assosiert med en signifikant reduksjon i SphK1 aktivitet i vevsekstrakter (fig. 2B, høyre panel). I tillegg Parallelt effekten på primærtumor etter en markert reduksjon i metastase formidling på kastrering-behandlede gruppen (tabell S1). Som ventet gjorde kastrering ikke påvirke kreftutvikling i SCID-mus xenotransplanted med PC-3 /GFP celler (Fig. 2C). Tumormasser og volumer var like i begge sham-behandlede og kastrerte dyr (Fig. 2D), og SphK1 aktivitet (Fig. 2D, høyre panel) samt metastasespredning (tabell S1) var sammenlignbar i begge grupper.
Ni og tre uker etter SOI av LNCaP /GFP og PC-3 /GFP-celler respektivt, SCID-mus ble randomisert i to grupper. Disse dyrene ble deretter utsatt for kastrasjon eller sham behandling. Representant fluorescerende primære LNCaP (
A
) og PC-3 (
C
) svulster fra simulert injeksjon- og kastrering-behandlede dyr på tidspunktet for obduksjon (7 dager etter behandling). Tumor massen av Bolts primære LNCaP (
B
,
venstre panel
) og PC-3 (
D
,
venstre panel
) GFP-merket svulst .
Kolonner
betyr fra 8 dyr;
barer
, SE. SphK1 aktivitet ble målt i vev utdrag hentet fra simulert injeksjon-, og kastrering behandlet LNCaP (
B
,
høyre panel
) og PC-3 (
D
,
høyre panel
) svulst bærende dyr.
Kolonner
betyr fra 8 dyr;
barer
, SE. De to-tailed
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; eller ns, ikke signifikant.
SphK1 Overuttrykte Renders LNCaP celler mindre følsom for Androgen Nedbryting
Fordi en hemming av SphK1 ble observert under kortsiktig androgen deprivasjon
in vitro
(fig. 1 D) og
in vivo plakater (fig. 2B), vi bekreftet om transfeksjon av LNCaP celler med SphK1 kan gjengi disse cellene mer motstandsdyktig mot androgen uttømming. Transfeksjon effektivitet ble verifisert ved immunoblotting (Fig. 3A, venstre panel). Den SphK1 aktivitet av SphK1-overekspresjon LNCaP (fig. 3A, høyre panel) ble øket til ~1100 pmol /min /mg protein (dvs. ~ 30 ganger høyere sammenlignet med tom vektor-transfekterte celler). Den avgjørende rolle av SphK1 inhibering i redusert cellevekst ble bekreftet ved hjelp av cellelevedyktighetsanalyser, som viste at LNCaP overekspresjon SphK1 var merkbart mindre følsomme for virkningene av androgen uttømming (Fig. 3B). Samtidig, SphK1 håndhevet uttrykk var assosiert med en høyere utskillelse av PSA i CSS-behandlede LNCaP celler som gjenspeiler dens virkning på celleproliferasjon (Fig. 3C).
SphK1 uttrykk i LNCaP celler ble analysert ved Western blotting ved hjelp av anti- FLAG antistoff (
En
,
venstre panel
). Hviler SphK1 aktivitet ble målt i LNCaP /neo og LNCaP /SphK1 celler (
En
,
høyre panel
).
B
, overnatting serum fratatt LNCaP celler ble inkubert i nærvær av 5% FBS eller 5% CSS for 6 dager. Celleproliferasjon ble så bestemt og uttrykt som prosent av 5% FBS-behandlede celler.
Kolonner
, mener minst tolv uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001.
C
, skilles PSA-nivå ble målt i kulturmedier fra LNCaP /Neo og LNCaP /SphK1 celler etter 24 timers inkubering i 5% CSS medium.
Kolonner
, mener på minst seks uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001
dihydrotestosteron Raskt og Forbigående Stimulerer SphK1 aktivitet i en Androgen. receptor /PI3 kinase-avhengig måte
Som en nedregulering av SphK1 aktivitet var korrelert med fjerning av androgener i LNCaP celler (fig. 1 D), var det av interesse å fastslå om dette kan bli reversert ved tillegg av androgener. Under CSS betingelser, kan tilsetningen av dihydrotestosteron (DHT) utløse en tidlig og forbigående stimulering av SphK1 (så tidlig som 15 minutter), hvoretter SphK1 aktivitet returnerte til basalnivåer (Fig. 4A). Den raske stimulering av SphK1 var avhengig av aktivering av PI3K /Akt signalering, som er blitt vist å mediere de raske effektene av androgener [39], [40]. Faktisk, mens Wortmannin (WT) hemmet både aktiveringen av Akt (Fig. 4B, øverst) og SphK1 (Fig. 4B, nederst) indusert av DHT, den SphK1 inhibitor SKI-2 ikke påvirke Akt fosforylering (Fig. 4B, topp ). Stimulering av PI3K /Akt /SphK1 vei var kritisk for å overføre de proliferative virkninger av DHT i henhold til CSS betingelser. Faktisk, ligner på PI3K hemmere WT og LY294002 (fig. 4C), de SphK1 hemmere SKI-2 og F-12509a kunne hindre DHT-indusert celleproliferasjon, DNA-syntese samt PSA sekresjon (fig. 4D).
A
, over natten serum berøvet LNCaP-celler ble inkubert under 5% CSS betingelser og behandlet med 10 nM DHT i de angitte tidsrom. SphK1 aktivitet ble kvantifisert og uttrykt som prosent av ubehandlede celler.
Kolonner
, mener på minst seks uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; **
P
0,01; ns, ikke-signifikant.
B
, over natten serum berøvet LNCaP-celler ble inkubert med 10 nM DHT i 45 minutter i nærvær eller ikke av 2,5 uM SKI-2 eller 200 nM Wortmannin (WT). Cellelysater ble analysert for fosfo-Akt og Akt-ekspresjon ved Western blot-analyse. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige forsøk (
toppen
). Over natten serum fratatt LNCaP-celler ble inkubert under 5% CSS betingelser og behandles med eller uten 10 nM DHT og 200 nM Wortmannin (WT) i 45 min, og essayed for SphK1 aktivitet (
bunn
).
Kolonner
, mener på minst fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: **
P
0,01; ns, ikke-signifikant.
C
, overnatting serum fratatt LNCaP celler ble inkubert i FBS eller i CSS vilkår for 6 dager med eller uten 200 nM Wortmannin (WT) eller en mikrometer LY294002 i nærvær eller ikke av 10 nM DHT som angitt. Celleformering ble bestemt ved MTT-analyse og uttrykt som prosent av kontroll ved begynnelsen av forsøket (dag 0).
Kolonner
, mener på minst åtte uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; ns, ikke-signifikant.
D
, overnatting serum fratatt LNCaP celler ble inkubert i FBS eller i CSS forhold med eller uten 2,5 mikrometer av SKI-2 eller F-12509a i nærvær eller ikke av 10 nM DHT i 24 timer (
toppen
), 48 timer (
midten
) eller 6 dager (
nederst
). Utskilt PSA nivå ble kvantifisert 24 timer etter den angitte behandling (
toppen
). DNA-syntese og MTT-baserte celleformering måling ble uttrykt som prosent av kontroll ved begynnelsen av behandlingen, 2 og 6 dager, henholdsvis.
Kolonner
, mener på minst fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; **
P
0,01; eller ns, ikke-signifikant.
Effekten av androgen reseptor antagonist ble neste undersøkt med bikalutamid. Som forventet ble LNCaP respons celleproliferasjon ved 10 nM DHT helt avstumpet med 10 mikrometer bikalutamid (Fig. 5A). DHT-utløst stimulering av SphK1 aktiviteten var også fullstendig hemmet i nærvær av androgen reseptor antagonist (Fig. 5B).
Overnattingsserum fratatt LNCaP cellene ble inkubert under 5% CSS forhold og behandles med eller uten 10 mm bikalutamid i nærvær eller ikke av 10 nM DHT for 2 (
En
,
toppen
) eller 6 dager (
En
,
nederst
). DNA-syntese og celle-tellemålinger ble uttrykt som prosent av kontroll ved begynnelsen av behandlingen.
B
, over natten serum berøvet LNCaP-celler ble inkubert med 10 nM DHT i 30 min i nærvær eller ikke av 10 uM bikalutamid, og SphK1 aktivitet ble kvantifisert og uttrykt som prosent av kontroll ved begynnelsen av behandlingen.
Kolonner
, mener på minst fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; **
P
0,01; eller ns, ikke-signifikant.
SphK1 er involvert i Androgen Nedbryting-Induced Nevroendokrine transdifferensiering av LNCaP og C4-2B Cells
Vi neste undersøkt potensialet involvering av SphK1 i overgangen til androgen ildfast staten etter kronisk androgen tilbaketrekning. For dette formål, LnCap og C4-2B celler, som tidligere har blitt rapportert til å skaffe en neuroendocrine (NE) fenotype [20], [21], [23], [41], [42], [43] ble opprettholdt i henhold CSS vilkår for opp til 42 dager. LNCaP-celler eksponert for et hormon-manglende medium gikk nevroendokrine (NE) morfologiske endringer (synlig etter approximatively 7-10 dager) som angitt ved soma kompaktering og utvikling av lange og forgrenede neuritic utvidelser (fig. 6A), mens kontroll LnCap parentale celler beholdes en fusiforme epitelial morfologi (fig. 6A). I tillegg til morfologiske egenskaper, transdifferentiated NE-lignende prostatacancerceller er definert ved uttrykket av en rekke produkter, inkludert neurosecretory chromogranin A (CGA) og neuron-spesifikk enolase (NSE). CGA er ansett for å være den mest pålitelig indikator for prostata NE differensiering.
A
, representative fase-kontrastbilder av LNCaP-celler i begynnelsen av forsøket (dag 0) og etter 42 dager inkubasjon i trekull strippet forhold (dag 42). Chromogranin A (CGA) -innhold ble evaluert ved immunoblotting ved de angitte tider (
bunn
) .Secreted Neuron enolase (NSE) nivå ble målt i kulturmedia fra LNCaP-celler ved de angitte tider (
panel rett
).
Kolonner
, mener fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD. De to-tailed
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001. SphK1 aktivitet (
B
,
venstre panel
) ble bestemt ved de angitte tider i LNCaP celler inkubert i CSS forhold.
poeng
, mener fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD.
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001.
Inset
, S1P innhold i følge TLC.
Høyre panel
, ekspresjon av SphK1, fosfo-Akt, og Akt ble analysert ved Western blotting ved de angitte tider. Lignende resultater ble oppnådd i fem uavhengige eksperimenter.
C
, uttrykk for CGA og fosfor-Akt (
venstre panel
) og SphK1 aktivitet (
høyre panel
) ble analysert 10 dager etter behandling eller ikke med en mikrometer LY294002 eller 200 nM Wortmannin (WT) under kull strippet forhold.
Kolonner
, mener fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD. De to-tailed
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001.
D
, ble utskilt NSE nivå målt i kulturmedier 10 dager etter behandling eller ikke med fem mikrometer SKI-2 under trekull strippet forhold (
venstre panel
). Uttrykk for CGA og fosfor-Akt ble analysert ved western blot (
panel midt
).
Kolonner
, mener fem uavhengige eksperimenter;
barer
, SD. De to-tailed
P
verdier mellom midlene er som følger:. **,
P
0,01
I samsvar med tidligere observasjoner [41], [44], immunoblot viste at CGA ekspresjon var meget lav i begge foreldre LNCaP (fig. 6A, nedre panel) og C4-2B (fig S1) celler, mens dets ekspresjonsnivå var betydelig forbedret over tid i hormonmangelfull medium. Videre, sammenlignet med ikke-hormonmangel LNCaP-celler (D0), ble en 3-gangers økning i NSE sekresjon til mediet funnet etter 42 dager under CSS betingelser som indikerer en NE-lignende fenotype (Fig. 6A, høyre panel). Basert på våre tidligere observasjoner som SphK1 aktivitet på androgen deprivasjon var bare forbigående hemmet med et betydelig oppsving innen 4 dager etter inkubasjon i CSS medium (Fig. 1 D), deretter analyserte vi SphK1 aktivitet opp til 42 dager i løpet av NE transdifferensiering prosessen. Bemerkelsesverdig, SphK1 aktivitet (Fig. 6B) økte gradvis opp til en 4-dobling etter 42 dager med androgen uttømming. Dette ble ytterligere illustrert ved en markert økning i S1P innhold (fig. 6B, innfelt). Parallelt ble SphK1 protein ekspresjon betydelig øket (fig. 6B, høyre panel). Aktivering av SphK1 var korrelert med stimulering av Akt (Fig. 6B, panel til høyre), en pro-overlevelse signalveien rapportert å være oppregulert i løpet av NE transdifferensiering av LNCaP indusert av androgen uttømming [6], [7], [23 ], [45]. Sammenlignbare funn ble observert i C4-2B cellemodell (figur S1).
I tråd med tidligere studier [6], farmakologisk hemming av PI3K /Akt vei kunne hindre NE transdifferensiering av både LNCaP (Fig. 6C ) og C4-2B (fig S1) som ble holdt i 10 dager i henhold til CSS betingelser. Av notatet, ble blokaden av CGA opphopning indusert av PI3K hemmere WT og LY294002 markert assosiert med en reduksjon i både Akt fosforylering og SphK1 aktivitet (Fig. 6C, høyre panel og figur S1).
For å undersøke funksjonelle rolle av SphK1 i NE transdifferensiering, undersøkte vi effekten av den farmakologiske inhibitor SKI-2 på LNCaP og C4-2B celler. I nærvær av SKI-2 (5 mm), den distinkte NE-lignende morfologi observert var i hovedsak avskaffet med LNCaP viser en avrundet morfologi med korte sjelden forgrenede cellulære prosesser (ikke vist). Videre er begge sekresjon av NSE (fig. 6D, venstre panel) og CGA akkumulering (fig. 6D, høyre panel og fig S1) ble merkbart redusert, mens Akt fosforylering var uforandret følgelig antyder at SphK1 inhibering kan til en viss grad blokkere NE transdifferensiering .
fysiologiske eller farmakologiske midler som øker intracellulære nivåer av cyklisk AMP (cAMP) kan indusere utvikling av en NE morfologi i LNCaP eller c4-2-celler i nærvær av steroider [41], [44], [46 ]. Av notatet, har cAMP økning tidligere blitt rapportert å være assosiert med aktivering av SphK1 i osteoblaster [47]. Derfor, undersøkte vi rollen til cAMP som en potensiell oppstrøms regulator av SphK1 under NED. LnCap og C4-2B celler ble stimulert med adenylatcyklase aktivatoren forskolin (Fsk) og fosfodiesterase-inhibitor IBMX, eller sammen med epinefrin (EPI), en β-adrenerg reseptor-agonist. Behandlingen med Fsk /IBMX eller Epi sterkt stimulert SphK1 aktivitet (Fig. 7A), og korrelert med økt cAMP-innhold (fig. 7B) og kjøp av NE morfologi (data ikke vist), karakterisert biokjemisk ved CGA akkumulering (Fig. 7C). Interessant, gjorde pharmacoligical hemming av SphK1 ikke har noen effekt på cAMP-nivåer (Fig. 7B), mens det gjorde markert hemme NED (Fig. 7C). Bemerkelsesverdig under androgen deprivasjon betingelser, ble det observert en tilsvarende økning i cAMP-intracellulære nivåer, noe som ikke kunne bli blokkert av farmakologisk hemning av SphK1 (fig. 7D). Resultatene fremkalle en rolle for cAMP for stimulering av SphK1 aktivitet under NED.
En
, SphK1 aktivitet ble bestemt i LNCaP og C4-2B celler behandlet for 3 dager i fravær eller i nærvær av 10 mm Fsk /10 mM IBMX eller 10 mikrometer Epi.
B
, intracellulære konsentrasjoner av cAMP ble kvantifisert i LNCaP og C4-2B celler behandlet for 3 dager med 5% FBS eller 10 mm Fsk /10 mM IBMX i fravær eller i nærvær av fem mikrometer SKI-2.
C
, kromogranin A (CGA) -innhold ble evalated ved immunoblotting i LNCaP og C4-2B celleekstrakter inkubert i 3 dager med eller uten 5 uM SKI-2 i nærvær av 5% FBS, 10 uM Fsk /10 mM IBMX eller 10 mikrometer Epi. Lignende resultater ble oppnådd i tre uavhengige forsøk.
D
, intracellulære konsentrasjoner av cAMP ble kvantifisert i LNCaP og C4-2B celler før eller 14 dager etter behandling eller ikke med fem mikrometer SKI-2 under kull strippet forhold.
Kolonner
, mener tre uavhengige eksperimenter;
barer
, SD. De to-tailed
P
verdier mellom midlene er som følger: ***,
P
0,001; *,
P
0,05; eller ns, ikke-signifikant.
For å finne ut om
in vitro
funn av potensialet involvering av SphK1 i NE differensiering hadde noen relevans for menneskelig sykdom, seksjoner fra en representant pasient som gjennomgikk palliativ transurethral reseksjon for lokalt residiv under full androgen blokade ble immunostained for CGA og SphK1 uttrykk (fig. 8). SphK1 farging ble begrenset til cytoplasma med noen celler blir mer intenst farget enn de andre (Fig. 8B, åpen Arrowhead). Fibromuscular stroma ikke beis positivt for SphK1. CGA farging ble observert i et mindretall av kreftceller, ca 10%, i form av sekretoriske granuli (H, Fig. 8D). Co-uttrykk for CGA i blått med brune SphK1 resulterte i intens mørk brun signal (fast pilspiss). Legg merke til i fig. 8A (nederst) og Fig. 8C, neuron-lignende utseende av det dobbeltmerkede kreftcelle (heltrukket pil).
Dual farging med anti-SphK1 (brunt) og anti-CGA (blå) av en reseksjon prøven høstet i en 84 yo mannen med T4NxM1 prostatakreft under full androgen blokade. Lav serum PSA og positiv serum NSE foreslo dårlig differensiert kreft med nevroendokrine funksjoner, noe som bekreftes av patologisk undersøkelse av resected prøven viser høy klasse prostatakreft (Gleason 9) med positiv farging for CGA. Blå granulær sekresjon karakteristisk for nevroendokrin differensiering er colocalized med brun SphK1 immun reaktivitet i Nevron-lignende celler (fast pilspiss).
Overgangen til androgen ildfast tilstand under kronisk androgen uttømming er preget
i vitro
av et tap av respons av androgen-fratatt celler til enten FBS eller DHT [20]. Så tidlig som i 7 dager og etter 14 dager androgen tilbaketrekking, LNCaP var helt ikke svarer etter overføring til FBS forhold eller når de ble behandlet med DHT med hensyn til celleproliferasjon (Fig. 9A, venstre panel) eller sekresjon av PSA (Fig. 9A, rett panel). Imidlertid er NE-lignende fenotype reversibel ved etterfylling av medium med serum fullstendig i løpet av flere uker [20]. Når LNCaP androgen-utarmet i 42 dager ble byttet tilbake til normal FBS medium, cellevekst gjenopptatt i løpet av perioden i påfølgende uke, og i løpet av de neste 21 dagene i FBS medium, cellen morfologi tilbakestilt til at foreldre LNCaP celler (data ikke vist). Som vist i fig. 8B, disse cellene var nå ikke bare i stand til å vokse normalt, og skille ut PSA i nærvær av FBS som foreldre LNCaP (fig. 1A), men også til å reagere en gang til for tilsetning av DHT i henhold til CSS betingelser tilsvarende parentale celler (fig. 4C og D). barer, SD. barer, SD. barer, SD.
