Abstract
Telomerer er avgjørende for å opprettholde genomisk stabilitet. Genetiske varianter i telomere pathway gener kan påvirke telomerer og telomerase funksjon, og senere kreftrisiko. Vi evaluerte 126 SNPs fra 10 gener relatert til telomerer regulering i forhold til blærekreft risiko. Fem SNP’er, 4 fra TEP1 gen og en fra PINX1-genet, ble funnet å være meget signifikant (P 0,01). Av disse var det mest signifikant sammenheng funnet i rs2228041 av TEP1 (OR 1,66, 95% KI 1.19 til 2.31), mens rs1469557 av PINX1 hadde en beskyttende effekt (OR 0,75, 95% KI 0,61 til 0,93). Haplotype-analyse viste at en TEP1 haplotype bestående av de variant alleler fra 7 SNP’er oppviste en 2,28 ganger øket risiko (95% CI 1,13 til 4,60). Vi deretter utført kumulativ analyse av flere risiko varianter, samt klassifisering og regresjon treet (CART) for å lete etter gen-gen-interaksjoner. I kumulativ effekt analyse, gruppen med 4-5 risikovariantene hadde en OR på 2,57 (95% CI = 1,62 til 4,09) versus referansegruppen med 0 risiko varianter. Den CART analyse kategorisert personer inn i fem undergrupper med ulike blærekreftrisikoprofiler basert på deres distinkte genotype bakgrunn. Så vidt vi vet, er dette en av de største og mest omfattende studier på blærekreft risiko vedrørende telomer-regulerings sti genet SNPs og våre resultater støtter at genetiske varianter av telomerer vedlikehold modulere blærekreft risiko individuelt og i fellesskap.
Citation : Chang J, Dinney CP, Huang M, Wu X, Gu J (2012) genetiske varianter i telomere-Vedlikehold Gener og blærekreft Risk. PLoS ONE 7 (2): e30665. doi: 10,1371 /journal.pone.0030665
Redaktør: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, USA
mottatt: 19 september 2011; Godkjent: 27 desember 2011; Publisert: 17 februar 2012
Copyright: © 2012 Chang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir CA131335, CA74880, CA91846, og CA127615. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Telomerer danner endene av kromosomer og består av nukleotid TTAGGG sekvensen gjentas, og den tilhørende proteinkomplekset shelterin i pattedyrceller [1], [2]. Telomerer hindre endene av kromosomene fra å bli anerkjent som dobbel-strand pauser og er avgjørende for genomisk integritet, hindrer ende-til-ende-fusion, nukolytiske degradering, og atypisk rekombinasjon [3]. Den shelterin kompleks, som består av seks kjerneproteiner, bidrar til å hindre gjenkjennelse av telomerer av DNA-skade reparasjonsbaner [2], og modulerer også telomeraseaktivitet [2], [4]. Telomerase, et spesialisert revers transkriptase, legger TTAGGG gjentar å forlenge telomerer hjelp av en intern RNA mal [5].
I somatiske celler, telomerer gradvis forkorte ved 30-200 bp etter hvert mitotisk divisjon på grunn av ufullstendig replikering av telomeric DNA ved DNA-polymeraser, kjent som ende-replikasjon problem [6]. Når telomer-lengden blir kritisk korte, tap av telomer-beskyttelse resulterer i initiering av cellen senescence og til slutt fører til apoptose, utløser DNA skade respons på telomeric kromosomendene som er anerkjent som dobbel-strand pauser [7]. Men en slik prosess resulterer i sterk seleksjon for celler med defekte DNA skader responser som kan omgå dette telomerer sjekkpunkt [8]. Ubegrenset spredning er oppnådd gjennom oppregulering av telomerase som kompenserer for telomere erosjon i kreftceller [9]. Telomeraseaktivitet har blitt påvist i -85% av kreft, og er karakteristisk for de fleste kreft [10], [11]; i flere tert-transgene musemodeller, konstitutiv ekspresjon telomerase øket kreftforekomst [12]. Tap av telomerer funksjon og fortsatt spredning fører til ende-til-ende fusjoner, ødelagte kromosomer, brudd-fusion bro sykluser, og generell genetisk ustabilitet; resultatet er akselerert genetiske endringer som er ansvarlige for videre vekst fordeler og kreft celle utvikling [13].
Den omvendte forholdet mellom telomere lengde og alder har også blitt godt dokumentert [9]. Frekvensen av telomer-avgang er avhengig av mange faktorer: røyking, fedme, usunn livsstil, og oksidativt stress er alle forbundet med kortere telomerer [14]. Genetikk sterkt påvirke telomer-lengden og genetisk arvelighet av leukocytter telomer-lengden er beregnet til rundt 80% [15]. Telomerer forkortes har vært forbundet med økt risiko for flere kreftformer, med blærekreft å være den mest konsekvente [16]. Tidligere studier har funnet at enkelt-nukleotid polymorfismer (SNPs) i telomer-spredningsveier gener assosiert med endret kreftrisiko; for eksempel en fersk studie fant varianter av telomerase-assosiert protein (
TEP1
) forbundet med økt blærekreft risiko [17]. I denne studien, tok vi en sti basert tilnærming for å evaluere foreningen av haplotype tagging og funksjonelle SNPs i kritiske telomerer vedlikeholds gener, inkludert shelterin komponent, telomerase, og telomere /telomerase forbundet gener, med blærekreft risiko i en stor case- control studie.
Resultater
Pasient egenskaper
totalt 803 kaukasiske pasienter diagnostisert med blærekreft og 803 kaukasiske kontrollpersoner ble inkludert i denne studien (tabell 1). Saker og kontroller ble matchet på kjønn (p = 0,95) og alder (p = 0,10). Tilfellene hadde en høyere andel av nåværende røykere (47.45%) versus kontroller (23,29%, p = 5.15E-21), og blant stadig røykere, tilfellene hadde en høyere gjennomsnittlig pakke år (43.02 ± 30,73 år) versus kontroller (29.92 ± 27.87 år, p = 2.78E-12).
risiko knyttet til enkelt SNPs
Blant de 126 analyserte SNPs, ble 24 SNPs (19%) signifikant assosiert med blærekreft risiko ved 5% nivå. Etter fjerning SNP’er med høy binding (R «> 2 0,8 mellom noen merking SNP’er og koding SNP’er), forble 18 SNP’er for den påfølgende analyse (tabell 2). Det er bemerkelsesverdig at 7 SNPs i både
TEP1 Hotell og
PINX1
genet var signifikant på p 0,05. Alle SNPs i
TEP1
var assosiert med økt risiko, og alle SNPs unntatt én i
PINX1
var assosiert med redusert risiko for blærekreft. En SNP i POT1, en i TRF2, og to i TNKS var også signifikant. Siden flere tester ble utført, beregnet vi Q-verdi (en falsk funnrate justert P-verdi) for å justere signifikansnivået for individuelle SNPs og Q-verdier for disse 18 SNPs var mellom 0,08 og 0,12 (data ikke vist).
av spesiell interesse, 5 SNPs ble funnet å være meget signifikant (p 0,01), 4 fra
TEP1 Hotell og 1 fra
PINX1
. Fordelingen av disse SNPs er funnet i tabell 3. Av disse var den viktigste foreningen funnet i rs2228026 av
TEP1 plakater (OR 1,72, 95% KI 1,20 til 2,44), mens rs1469557 av
PINX1
hadde en beskyttende effekt (OR 0,75, 95% CI 0,61 til 0,93). For å utforske interaksjoner av genetiske varianter med røykestatus, alder og tumorstadium, utførte vi stratifisert analyse på disse 5 svært betydelige SNPs, men vi gjorde ikke merke noen vesentlig forskjell på ORS i aldri og stadig røykere i alderen gamle og unge i alderen individer, og i ikke-muskel invasiv og muskel-invasive svulster (data ikke vist).
Fordi mange SNPs av
TEP1
genet var assosiert med økt risiko, og 4 ut av 5 høyt betydelige SNPs var fra
TEP1
, vi utførte haplotype analyse på 7 betydelig
TEP1
SNPs (tabell 4). Sammenlignet med den halpotype med villtype-allel på alle de 7 SNP, en haplotype som inneholder variant alleler i alle de 7 SNP’er oppviste en signifikant øket risiko (OR 2,28, 95% CI 1,13 til 4,60, p = 0,022). Ingen av de andre haplotyper viste betydning i å påvirke blærekreft risiko
Kombinert effekt av flere SNPs
5 høyt betydelige SNPs (p 0,01). Ble ansett for kumulative effekter av SNPs på blærekreft risiko. Vi fant en signifikant gen-dose effekt for å øke blærekreft risiko med økende antall ugunstige genotyper (p for trend = 3.31E-06), og pasientene ble kategorisert i 3 risikogrupper etter antall ugunstige genotyper. Sammenlignet med personer uten ugunstige genotyper, risiko for blærekreft gradvis økt med tillegg av ugunstige genotyper, med ORS på 1,2 (95% KI 0,92 til 1,62) for lav-risikogruppe med en ugunstig genotype, 1,64 (95% CI 1.22- 2,21) for middels risikogruppe med 2-3 ugunstige genotyper, og 2,57 (95% KI 1,62 til 4,09) for høyrisikogruppe med 4-5 ugunstige genotyper (tabell 5).
CART analyse
Alle signifikant assosiert SNPs (tabell 2) ble analysert for mulige gen-gen-interaksjoner gjennom CART analyse. Den første delingen var på rs2228041 av
TEP1
, den viktigste SNP ut av dem evaluert for blærekreft risiko. Den endelige treet hadde 5 terminalnodene (figur 1). Tabell 6 oppsummerer risikoestimater for enkeltpersoner i hver terminal node. Node 1 (N = 101), som brukes som referanse, hadde lavest risiko og består av pasienter som var GG for rs11250080 på
PINX1
, TC /CC for rs1469557 på
PINX1
, og AA for rs2228041 på
TEP1
. I forhold til individer i en node, ble de andre nodene assosiert med øket risiko for blærekreft med ORS som strekker seg 1,74 til 3,28 basert på forskjellige kombinasjoner av genotypen. Enkeltpersoner i node 5 (N = 177) med AG /GG for rs2228041 på
TEP1
hadde høyest risiko (OR 3,28, 95% KI 1,94 til 5,57).
diskusjon
Denne studien evaluerte sammenheng mellom et sett av SNPs i telomere vedlikehold gener og blærekreft risiko. Atten betydelige SNPs ble funnet: blant SNPs med svært signifikant sammenheng (p 0,01), fire var fra telomerase protein komponent 1 (
TEP1
) og en var fra PIN2 /TRF1-samspill protein 1 (
PINX1
). Vi fant også en signifikant effekt av flere SNPs, og potensielle gen-gen-interaksjoner vedrørende risiko.
telomerer forkortes og telomerase aktivering er knyttet til genomisk ustabilitet og tumorigenesis. Mange studier viste at kortere telomerlengde er forbundet med økt risiko for flere krefttyper [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], med de sterkeste bevisene i blærekreft [25]. Telomerase er aktiv i de fleste kreftformer og er kritisk for tumorigenesis. Det er sannsynlig at de studerte genetiske varianter påvirker kreftrisiko gjennom endringer i mekanismer som involverer telomer-regulering, telomerlengde, eller telomerase funksjon.
Tidligere studier har vist valgt genetiske varianter i genene av telomer-bane og blærekreft risiko [26 ], [27].
TEP1
er en del av ribonucleoprotein komplekse og binder seg til telomerase. En SNP (rs1760897) i
TEP1
har nylig vært forbundet med en økt risiko for blærekreft [17]. Vi har også genotypet denne SNP i denne studien og fant denne SNP ble assosiert med en border betydelig økt risiko for blærekreft (OR 1,17, 95% KI 0,94 til 1,45 og OR 1,27, 95% KI 0,91 til 1,79 for heterozygote og homozygote variant genotyper henholdsvis, p for trend = 0,08). I tillegg, i vår studie fant vi 7
TEP1
SNPs assosiert med økt blærekreft risiko. Den mest betydningsfulle SNP ble rs2228041. Dette SNP er en ikke-synonyme SNP, Arg1155Gln. Endre en sterk grunnleggende aminosyre (arginin) til en nøytral aminosyre (glutamin) er sannsynlig å påvirke proteinstruktur og funksjon. Fremtidige studier er nødvendig for å finne ut hvordan dette
TEP1
SNP påvirker TEP1 funksjon, telomerase aktivitet, og blærekreft risiko. Vår haplotype analyse støtter også rollen TEP1 i blærekreft etiologi.
I tillegg til
TEP1
, fant vi høy betydning i en SNP på
PINX1
genet og lavere blærekreft risiko.
PINX1
regulerer telomerase funksjon og kan direkte binde seg til TERT og hemme telomerase aktivitet; hemming av
PINX1
øker telomerase aktivitet, mens overekspresjon gjør det motsatte [28]. En tidligere studie viste at
PINX1
hemming fører til avvikende telomerase aktivering og telomere forlengelse, at det går telomere funksjon og forårsaker kromosom ustabilitet, og det er bevis som støtter den rollen
PINX1
som en tumor suppressor, konstituert gjennom en telomerase avhengig mekanisme [29]. Våre funn gir ytterligere støtte at
PINX1
er en potensiell tumor suppressor. Potensielt, genetisk variasjon av
PINX1
genet kan endre kreftrisiko gjennom mekanismer av telomer regulering, og flere studier er garantert å evaluere genetiske varianter i
PINX1
genet og tilknytning til blærekreft risiko, samt å definere hvordan
PINX1
regulerer telomerer gjennom telomerase-avhengige eller uavhengige mekanismer.
Vi utførte kumulativ analyse av flere SNPs. Selv om den analyserte SNPS individuelt hatt moderat effekt på blærekreft risiko, fant vi en sterkere kumulativ effekt. Disse resultatene bekrefter multigenicity av blærekreft, som nevnt i tidligere studier [30], [31], [32], og identifisering av flere risiko varianter ytterligere kan forbedre risiko prediksjon. I tillegg utførte vi CART analyse for å utforske høy ordre gen-gen-interaksjoner mellom SNPs. Siden blærekreft er en multi-faktor sykdom, samspillet mellom genetiske variasjoner samt miljøfaktorer som røyking og yrkesmessig eksponering, vil trolig bidra med en akkumulativ effekt for risiko.
Det er flere sterke sider av denne studien . Prøvestørrelsen er forholdsvis stor for en kandidat-gen studie. Studiepopulasjonen er homogene med minimal confounding av befolkningsstruktur. Pasientene ble alle histologisk bekreftet. SNP panelet er omfattende. Det er også noen begrensninger i denne studien. Vi brukte en falsk funnrate (FDR) basert tilnærming for å justere for flere tester og FDR-justerte P-verdiene var mellom 0,08 og 0,12 for de betydelige SNPs. En FDR terskel på 0,2 ble foreslått av tidligere studier for kandidat genet studier [33]. Noen av foreningene er sannsynlige tilfeldig funn. Den fremtidige eksterne valideringer i uavhengige studier er garantert å bekrefte resultatene fra våre studier. I tillegg CART analysen var utforskende og resultatene må tolkes med forsiktighet. Likevel antyder studien sterkt at genetiske variasjoner i telomere vedlikehold gener modulere blærekreft risiko individuelt og i fellesskap.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle pasientene undertegnet en skriftlig informert
Studier befolkning og datainnsamling
p > Denne studien inkluderte pasienter med blærekreft som ble rekruttert fra The University of Texas MD Anderson Cancer Center og Baylor College of Medicine, rekruttering starter i 1999. Tilfeller ble alle histopathologically bekreftet og tidligere ubehandlede for chemotheraphy eller strålebehandling pre-rekruttering. Det var ingen restriksjoner på rekruttering på alder, kjønn, eller scene. Kontrollpersoner ble rekruttert fra Kelsey Seybold, den største private multispecialty lege gruppe i Houston. De var friske individer uten tidligere historie av kreft, bortsett fra ikke-melanom hudkreft, og ble matchet til pasienttilfeller etter alder (± 5 år), kjønn og etnisitet. Detaljert spørreskjema data inkludert demografi, familiehistorie, røykestatus, alkohol drikking, yrkeshistorie og medisinsk historie ble samlet inn fra alle fag gjennom personlig intervju. Personer som hadde røykt mindre enn 100 sigaretter i sin levetid ble definert som aldri har røykt, enkeltpersoner som hadde røykt minst 100 sigaretter i løpet av livet, men hadde sluttet mer enn 12 måneder før diagnosen (tilfeller) eller intervju (kontroller) ble definert som tidligere røykere og personer som var i dag røyker eller som hadde stoppet 1 år før ble definert som nåværende røykere. Tidligere og nåværende røykere ble definert som noensinne røykere. Responsrater for saker og kontroller var 92% og 76,7%, henholdsvis. Fordi 90,6% av pasientpopulasjonen var kaukasisk, inkluderte vi bare kaukasiere i denne studien.
SNP utvalg og genotyping
Vi valgte 10 av de viktigste genene som koder for proteiner involvert i telomere vedlikehold, inkludert telomerase, shelterin proteiner, og flere telomere assosierte proteiner, basert på litteratur gruvedrift. Tagging SNPs ble valgt av binning algoritme av LDSelect programvare (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.pl) (r
2 0,8, MAF 0,05) innen 10 kb oppstrøms for 5 «uoversatt region (UTR) og 10 kb nedstrøms fra 3»-UTR av hvert gen. Vi inkluderte også alle de bekreftede koding SNPs i dbSNP database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/). Endelig antall SNPs for hvert gen region var som følger:
PINX1
, 27; POT1, 8; PIP1, 1;
TEP1
, 42; TRF2, 2; TRF2IP, 2; TERT, 12; TNKS, 21; TNKS1BP1, 5; og TNKS2, 6. Genomisk DNA ble isolert fra perifert blod ved hjelp av QIAamp DNA Blood Maxi Kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. Genotyping ble gjort ved hjelp av Illumina er IVelg tilpasset SNP array plattform i henhold til produsentens infinium II analyseprotokollen (Illumina). Genotyping data ble deretter analysert og eksporteres med BeadStudio programvare (Illumina). Gjennomsnittlig takst for SNP rekke var 99%. Tilfeldig valgt 2% av prøvene ble kjørt i duplikater og samstemmighet av genotype samtaler var 99,9% for dupliserte prøvene
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Stata 10,0 programvare (Stata Corp. ). χ
2 test og Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne kategoriske variabler, og Student
t
test ble brukt for kontinuerlige variabler. Godhet-of-fit χ
2-analyse ble brukt for å teste Hardy-Weinberg likevekt. Effekter av SNP om blærekreft risiko ble beregnet som odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall (KI). Ubetinget multivariabel logistisk regresjon ble utført under dominerende, recessive, og additive modeller av arv justering for alder, kjønn og røykestatus, der det er hensiktsmessig. False funnrate (FDR) basert Q-verdien ble beregnet for individuelle SNP å justere for multippel testing. Vi brukte en terskel på 0,20 for Q-verdi, som tidligere foreslått som mer passende for moderate størrelse studier med kandidat genet tilnærminger [33]. Haplotype analyse ble utført på SNPs av
TEP1
genet
For den kumulative effekten av flere SNPs på kreftrisiko, SNPs med signifikant sammenheng (p-verdi for best tilpassede modellen 0,01). Var evaluert. Bruke faggruppe uten ugunstige genotyper som referanse, ORS og 95% CI’er ble beregnet for de andre gruppene som bruker ubetinget multivariat logistisk regresjon, justert for alder, kjønn, røykestatus og pakke år. Ugunstige genotypene var sub-kategorisert i 3 grupper (lav, middels og høy risiko) i henhold til antall ugunstige genotyper. Referansegruppen var en uten ugunstige genotyper. Høy ordre gen-gen-interaksjoner ble utforsket via Klassifisering og regresjon treet (CART) analyse, utført ved hjelp HelixTree Genetics Analysis Software (v. 4.1.0, gylne Helix). Kort fortalt bruker CART rekursiv partisjonering for å skape et beslutningstre som muliggjør identifisering av ulike kombinasjoner av variabler med varierende grad av risiko. Analyse starter med rotnoden med alle saker og kontroller, bestemmer den mest optimale split, dvs. minste P-verdi for hvert følgende node, med et flertall justert P-verdier for å kontrollere treet vekst (p 0,05). Prosessen fortsetter inntil endenoder har ingen statistisk signifikant splitt eller når et forhåndsbestemt minimumsstørrelse. ORS og 95% CI’er for hver terminal node ble beregnet ved hjelp av logistisk regresjon. P value≤0.05 ble ansett for å være terskelen for betydning i denne studien; alle statistiske analyser var tosidig.
