Abstract
topoisomeraser er en familie på viktige enzymer i stand til å løse topologiske problemer i DNA under ulike genetiske prosesser. Topoisomerase-gift, blokkerer gjenforening av spaltede DNA-tråder og stabiliserende enzym-mediert DNA-spalting-komplekset, er klinisk viktige anti-neoplastiske og anti-mikrobielle midler. Men den raske økningen av legemiddelresistens som hindrer den terapeutiske effekten av disse livreddende medisiner gjør oppdage nye blyforbindelser stadig mer presserende. Vi rapporterer her en lettvint høy gjennomstrømming screening system for midler rettet mot human topoisomerase IIα (Top2α). Analysen er basert på måling av fluorescens anisotropi av en 29 bp fluorofor-merket oligonukleotid duplex. Siden narkotika-stabilisert Top2α bundne DNA har en høyere anisotropi i forhold til gratis DNA, kan denne analysen fungere hvis man kan bruke et dissosierende agent for å spesifikt forstyrre enzym /DNA binær komplekser, men ikke de legemiddel stabilisert trefoldig komplekser. Her viser vi at NaCIO
4, et kaotropisk middel, serverer en avgjørende rolle i vår screening metode for å skille de legemiddel stabiliserte enzym /DNA-komplekser fra de som ikke er det. Med denne strategien vi vist en kjemisk bibliotek på 100.000 forbindelser og fikk 54 positive treff. Vi preget tre av dem på denne listen, og demonstrerte sin effekt på Top2α-medierte reaksjoner. Våre resultater tyder på at denne nye screening strategi kan være nyttig i å finne flere kandidater av kreftlegemidler
Citation. Lin YS, Huang WC, Chen MS, Hsieh Ts (2014) Mot oppdage nye kreftlegemidler targeting Topoisomerase IIα: En Facile Screening strategi tilpasses til høy gjennomstrømning plattform. PLoS ONE 9 (5): e97008. doi: 10,1371 /journal.pone.0097008
Redaktør: Maria Spies, Universitetet i Iowa, USA
mottatt: 26. desember 2013, Godkjent: 14 april 2014; Publisert: 8. mai 2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Research Program for Biopreparater (ChemBank og høy gjennomstrømming screening Resource Center, NSC-101-2325-B-001-029), og NSC (NSC102-2325 og NSC103-2811). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA-transaksjoner som sender og gjenopprette genetisk informasjon alltid innebære avvikling og tilbakespoling av doble spiralformede strukturer. På grunn av den topologiske sammenhengen mellom videregående og høyere ordens DNA-strukturer, spiralformede avkobling /tilbakespoling resultat i forviklinger og sikringsanlegg kromosomer og DNA. Disse topologiske forviklinger måtte løses på en rask og presis måte, uten noe som cellene ikke kan overleve. Topoisomeraser er naturens løsning på disse tilsynelatende uløselige topologiske kompleksiteten [1] – [6]. De utføre disse topologiske transformasjoner gjennom en syklus av reversibel transforestring mellom det aktive sete tyrosyl rest og fosfat-hovedkjeden i DNA. Den forbigående enzym /DNA-addukt danner en DNA-port gjennom hvilken et annet DNA-segment kan transporteres og resulterer i topologiske endringer. Basert på strukturen og mekanismen, er topoisomeraser klassifisert i to typer: type I enzym medierer strengen transport gjennom en enkeltkjedet DNA-porten mens type II-enzym transporterer DNA-segment som via en dobbel tråd gate. Begge typer av topoisomeraser er videre klassifisert i to familier, A og B, og disse enzymene er allestedsnærværende i naturen og har viktige funksjoner for vekst og utvikling av alle organismer [7], [8].
Interessant, forbigående og reversible DNA pauser mediert av topoisomeraser, så avgjørende for deres biokjemiske og biologiske funksjoner, også opprette en akilleshæl for cellene. Mange cytotoksiske midler, kunstige eller natur-produsert, målet på dette trinn av topoisomerase reaksjonen og stabilisere spaltningen mellom således genererer potensielt dødelige DNA-strengbrudd [5], [9] – [14]. Noen av disse topoisomerase-målsøkende midler har vist seg å være klinisk viktige anti-kreft medikamenter og antibiotika. Den terapeutiske effekten av disse livreddende medisiner er ofte kompromittert på grunn av økningen av resistens i tumor eller mikrobielle celler. Søke etter nye modaliteter og narkotika blir stadig mer presserende hvis vi ønsker å holde tritt med trusselen om legemiddelresistens. På grunn av en avgjørende rolle topoisomeraser i celleproliferasjon og fordi de er bevist målene for klinisk nyttige legemidler, er det rimelig å forvente at intensiv innsats skal være viet til å oppdage flere legemidler rettet mot topoisomeraser. Men de biokjemiske analyser som er oftest brukt for å overvåke topoisomerase aktiviteter er ikke lett tilpasses for automatisering og høy gjennomstrømning plattform. For biokjemiske analyser de mest allsidige analysene er basert på bruk av agarosegel-elektroforese, siden det kan detektere DNA strukturelle overganger forbundet med tråd cleavage og passasje aktivitetene til topoisomeraser. Den arbeidskrevende natur og kronglete prosess ved anskaffelse av data gjør gelelektroforese usannsynlig en metode for valg for automatisering og kvantifisering.
For å rette på dette problemet, er det en rekke tilnærminger utviklet nylig at er tilpasningsdyktige for automatisert høy gjennomstrømning plattform for å identifisere topoisomerase-målsøkende forbindelser [15] – [18]. De er alle fluorescens-baserte topoisomerase aktivitetsanalyser, og dermed mer mottagelig for automatisert kvantifisering. Men de er også kjennetegnet ved anvendelse av et plasmid-DNA i prosessen med analyser. Vi rapporterer her vårt arbeid i å utvikle en ny metode ved anvendelse av en fluorofor-merket oligonukleotid-dupleks som et substrat for analysering av dannelsen av stabiliserte topoisomerase /DNA-komplekser i nærvær av en spesifikk kandidatmiddel. Vi beskriver vår første skjerm ved hjelp av denne teknikken analysering av et kjemisk bibliotek med 100000 forbindelser og karakterisering av tre av de positive treff. Dette screening metoden kan gi en alternativ tilnærming til å oppdage nye topoisomerase-målsagenter og berike vår arsenal for å bekjempe svulster og mikrobielle patogener.
Materialer og metoder
Rensing av menneskelige Top2α
Vi brukte en konstruert YEpWob6, en vektor med hexahistidine-merket menneskelig Top2α under en
GAL1
induserbar promoter, for å uttrykke rekombinant human Top2α i gjær [19]. Gjærceller etter induksjon galaktose ble høstet, resuspendert i hypertonisk buffer (1 M sorbitol, 20 mM kaliumfosfat pH 7,4, 20 mM 2-merkaptoetanol) og lysert ved tilsetning av lytiske enzym (Zymolyase 100T, Amsbio). Cellekjernene ble høstet ved sentrifugering (20 min ved 55,000X
g
), resuspendert i en buffer av 20 mM kaliumfosfat pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 5 mM 2-merkaptoetanol med en protease inhibitor cocktail inkludert 1 mM PMSF, 2 ug /ml leupeptin, og 1 ug /ml pepstatin A, og homogenisert. Vi ekstrahert Top2α fra kjerner ved å øke NaCl-konsentrasjonen til 500 mM og fjernes nukleær pellet ved sentrifugering ved 15,000X
g
i 25 min. Supernatanten ble fraksjonert ved 3 kromatografiske trinn (GE Healthcare). Den første var en HisTrap FF rå Ni-chelaterende kolonne og Top2α ble eluert ved 40 mM imidazol med en gradient av 20-200 mM imidazol i 20 mM kaliumfosfat pH 7,4, 500 mM NaCl og 0,1% Triton X-100. De sammenslåtte fraksjonene ble fortynnet tre ganger med 20 mM kaliumfosfat pH 7,4, og ytterligere renset gjennom HiTrap SP kolonne. Top2α eluert ved 500 mM NaCl i en gradient på 200-800 mM NaCl. De sammenslåtte fraksjonene ble fortynnet tre ganger med 20 mM kaliumfosfat pH 7,4, og applisert på Mono S 5/50 GL-kolonne. Top2α ble eluert ved 500 mM NaCl og fraksjonene ble samlet, dialysert over natten mot 50% glyserol, 15 mM natriumfosfat pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF og 5 mM 2-merkaptoetanol, og lagret ved -20 ° C. Den endelige Top2α fraksjonen er over 90% ren og har en spesifikk aktivitet på minst 10
6 enheter /mg med en enhet defineres som den mengde enzym som er nødvendig for å slappe av 0,5 pg pUC19-DNA i 30 min.
DNA underlag
Fluorescent DNA substrat (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) er designet ligner på det som ble beskrevet tidligere (Smiley, Collins et al. 2007), en 29-bp oligonukleotid duplex inneholder en top2 cleavage området i sentrum og Alexa Fluor 488 på 3 «enden. Plasmid pUC19 DNA renset ved CsCl dobbel-banding, fenol-kloroform ekstraksjon og alkohol nedbør ble brukt til avslapping og cleavage analyser (Sander og Hsieh 1983).
Pre-HTS (High throughput screening) anisotropi analyse
I 50 ul av Top2 reaksjonsbuffer inneholdende 10 mM Tris-HCl pH 7,9, 5 mM MgCl
2, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM ATP. 50 nM Alexa Fluor 488-merket DNA, 1,25 uM human Top2α, og teniposid (VM26) i et område av konsentrasjoner 60-300 uM, ble reaksjonsblandingen inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Før måling av anisotropi, NaCIO
4 ble tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon på 250 mM. Eksperimenter testing effekten av NaCIO
4 konsentrasjoner viste at innenfor et område på 100-750 mM det har en lignende effekt i moduler fluorescens anisotropi (for å være detaljert i resultater avsnitt).
For å teste effekten av tilsetningsrekkefølge, ble 50 nM Alexa Fluor 488-merket DNA, 250 nM human Top2α, og 250 mM NaCIO
4 med eller uten 300 uM VM26 innført i annen rekkefølge til 50 pl reaksjonsbuffer. Den totale reaksjonstiden var 30 minutter ved 37 ° C, med mindre annet er angitt.
For å undersøke de positive treff av anisotropi assay i henhold til masseforhold, reaksjonen ble utført i 50 pl reaksjonsbuffer inneholdende 50 nM Alexa Fluor 488 -merket DNA, 250 nM human Top2α, og 15 uM testforbindelse. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter før tilsetning av NaCIO
4.
anisotropi-analyser i henhold til bulkbetingelser ble målt ved Fluorolog-3 spektrofluorometer (Hiroba Scientific) er utstyrt med to polarisatorer i banene for eksitasjon og emisjon ved bruk av L-format metode. Eksitasjon og emisjonsbølgelengden var 492 nm og 515 nm, henholdsvis, hver med en spalte bredde på 2 nm, og gevinsten G verdien satt til 1.
Høy gjennomstrømning anisotropi Screening
For HTS , filmvisninger ble utført ved Genomics Research Center of Academia Sinica i Taiwan, etter protokollen publisert tidligere, og ved hjelp av kjemiske biblioteket generert og samlet det [20]. Kort beskrevet, film ble utført i 1536-brønners plater ved bruk av high-throughput screening (HTS) system fremstilt av GNF-systemer (GNF, San Diego, CA). Den HTS systemet er integrert med dispensere, en 1536-pin overføre verktøy, inkubatorer og en ViewLux plateleser (Perkin Elmer Inc.). Reaksjonsvolumet var 4-pl per brønn inneholdende 100 nM Alexa Fluor 488-merket DNA med 150 nM human Top2α i reaksjonsbufferen. Etter 30 minutters inkubering ved 37 ° C, 100 mM NaCIO
4 ble tilsatt til hver brønn for å stoppe reaksjonen, og anisotropi verdien ble målt. Screeningen ble utført med en representant bibliotek på 100.000 kjemikalier ved en konsentrasjon på 12,5 uM. 300 uM teniposid (VM26) ble inkludert som en positiv kontroll, mens 5% DMSO var den negative kontroll. Z ble beregnet ved anvendelse av følgende formulering:. SD for MAX og SD av MIN er standardavviket av positive og negative kontroller. En undersøkelsesmetode som passer for HTS-plattformen har en Z-faktor større enn 0,5. Med den første runden screening av over 100 000 kjemikalier, ble 107 testforbindelser scoret positive ved kriteriene for å bli beskrevet i teksten. Andre runde med screening ble utført ved å teste anisotropi avlesningene på 8 forskjellige konsentrasjoner av hver kandidat forbindelse ved hjelp av to-ganger fortynninger med start fra 12,5 pM. Bare de forbindelser som resulterer i 20% økning i detekterte signaler i løpet av de negative kontroller, og som viser doseavhengige responser ved to eller flere punkter ble definert som treff. Det var 54 treff scoret i den andre runden av screening.
Avslapping Analyser
I 20 ul Top2 reaksjonsbuffer tilsatt 8,5 nM negativ supercoil pUC19, 0.125 nM menneskelig Top2α med enten 5% DMSO, eller 60 pM testforbindelser, reaksjonene ble utført ved 37 ° C i 5, 10 eller 15 minutter ble terminert ved tilsetning av SDS til 0,25%, EDTA til 10 mM og proteinase K til 0,4 mg /ml, ytterligere inkubert ved 50 ° C i 1 time, og analysert ved elektroforese i 1,2% agarose-gel.
Cleavage Assays
i en reaksjonsbuffer inneholdende 8,5 nM negativ supercoil pUC19, 3,75 nM human Top2α og 150 uM teniposid (VM26) eller som er spesifisert i teksten, ble reaksjonene inkubert ved 37 ° C i 15 minutter og avsluttet ved tilsetning av SDS til 0,25%, EDTA til 10 mM og proteinase K til 0,4 mg /ml, eller ved tilsetning av NaCIO
4-500 mM i 2 minutter etterfulgt av tilsetning av proteinase K til 0,4 mg /ml. Inkubasjon ble fortsatt ved 50 ° C i 1 time, og prøvene ble analysert ved elektroforese i 1,2% agarose-gel inneholdende 0,15 ug /ml etidiumbromid. For testing av spaltningsreaksjoner med et lineært DNA-substrat, ble pUC19 spaltet med Scal for å fremstille en enhetslengde molekyl. Den restriksjonsenzym behandlede DNA ble renset og benyttet i spaltningsreaksjoner.
For å teste effekten av positive treff i spaltningsreaksjon, ble testforbindelsene fortynnet i tre forskjellige konsentrasjoner, 16, 64 og 256 uM, og reaksjonene ble utført og analysert som beskrevet ovenfor.
glyserol gradient Sedimentasjon og Topoisomerase Detection ved immunoblotter
en 3,5 ml glyserol gradient fra 30-60% i Top2 reaksjon buffer ble utarbeidet i en polyallomer sentrifugering tube , og lagdelte med en 80 ul av top2 reaksjonsblandinger som beskrevet i tekster. Sentrifugering ble utført ved 55 000 rpm i 16 timer ved 20 ° C i TFT-80,4 Rotor (Thermo Scientific). En 22-gauge nål ble anvendt for å stikke hull i røret, og fraksjoner ble samlet opp fra bunnen. 50 ul prøve av hver fraksjon ble applisert på en forfuktet PVDF-membran ved hjelp av et spalt-avtrykks-manifold (Hoefer PR 648) apparat. Etter lasting, ble membranen blokkert i 1 time ved værelsestemperatur i 5% skummet melk laget i TBS-buffer (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 125 mM NaCl). Blokkert membran ble inkubert over natten ved 4 ° C med en geit antistoff mot humant Top2α (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, sc-5348). Membranen ble deretter behandlet for kjemi-luminescens med ECL-reagens (Millipore, WBKLS0500) etter produsentens anbefalinger.
Cvtotoksisitetsmålinq
Cytotoksisitet Analysen ble utført med HCT116 cellene bruker CellTiter 96 AQ
ueous en løsning Cell Proliferation Assay kit i henhold til produsentens protokoll (Promega). Kort sagt ble HCT116-celler sådd ut i 96-brønners plater ved en celletetthet på 7500 celler per brønn i DMEM i 24 timer. Etter fjerning av medium, ble eksponentielt voksende celler inkubert med 1 pl av testforbindelsen i 6 to-ganger fortynninger i et sluttvolum på 100 ul i hver brønn. Etter en 72-timers inkubasjon ved 37 ° C ble cellene etterfylles med friskt medium inneholdende 10 ul MTS tetrazolium og inkubert i en time. Den formazanet omdannes av de levende celler ble overvåket ved 490 nm. Kontrollceller inneholder 1% DMSO uten testforbindelse. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger.
Resultatene
Vi brukte renset full-lengde human Top2α og fluorofor-merket dobbelttrådet oligonukleotid inneholdende en topoisomerase bindingssete for å utvikle den fluorescens-baserte analyse (figur 1A). Ordningen med screening for Top2α-målretting forbindelser er illustrert skjematisk i fig 1B. Denne analyse er basert på måling av fluorescens polarizability (anisotropi) som en indikasjon på hvorvidt et protein er bundet til fluorofor-merket DNA. Ved eksitering med polarisert lys, utslipp fra fluoroforen av DNA-substratet hvis bor bevege seg, også er polarisert. Rotasjons diffusjon endrer retning av overgangs øyeblikk og forårsaker depolarisering. Topoisomerase-DNA-kompleks, kovalent eller ikke-kovalent, har en lavere tumbling hastighet og resulterer i en høyere anisotropi. På den annen side, har den frie DNA-et høyere tumbling hastighet og således en lavere anisotropi. Siden anisotropi analysen kan lett automatiseres, kan vi gjennomføre high-throughput screening (HTS) for å identifisere potensielle blyforbindelser målretting mot Top2α. Men en viktig utfordring for screening analysen skal fungere er å skille de legemiddel stabilisert Top2α-DNA komplekser fra de todelte Top2α-DNA komplekser. Vi vil trenge et reagens for å forstyrre den sistnevnte kompleks, men opprettholde den tidligere.
(A) Et fluorescerende DNA-substrat ble syntetisert med en kjent Top2 spaltningssete (angitt med pilene). Alexa Fluor 488 merket med stjerne ble merket på 3’end. (B) Skjematisk fremstilling av anisotropi-baserte Top2α medikament-screening. Topoisomerase-DNA-kompleks, kovalent eller ikke-kovalent, har en langsommere rotasjons diffusjon og resulterer i en høyere anisotropi. Etter behandlet med et protein-dissosierende middel, ble den ikke-kovalent bundet Top2α fjernet, og den frie DNA har en lavere anisotropi. Hvis en Top2α-målsøkende middel stabilisert kovalente enzym-DNA komplekser, vil anisotropi forbli høy.
Behandling med NaCIO
4 kan resultere i en økning i anisotropi avhengig av tilstedeværelsen av en anti- kreft narkotika teniposid (VM26)
Ved hjelp teniposid (VM26) som en modell sammensatt for vår screening analysen, testet vi om en rekke vanlig ansatt denaturerende reagenser inkludert alkali og SDS kan gi rom for å påvise økt stabilitet i Top2α -DNA komplekser i nærvær av en anti-kreft legemiddel. Siden alkali danner fint bunnfall med Mg
++ i reaksjonsbuffer og SDS frembringer ørsmå bobler, begge reagenser skape uakseptable artefakter for mikrotiter-baserte fluorescensanalyser. Men vi oppdaget at en sterk kaotropt reagent NaCIO
4 oppfyller våre krav som dissosierende reagens i fluorescens analyser. Etter tilsetning av NaCIO
4 til 250 mM til bindingsreaksjonsblandingen, stabilitet i Top2α-DNA komplekser som overvåkes av fluorescensen anisotropien viser en klar doseavhengig økning som VM26 konsentrasjoner som varierer fra 0 til 300 pM (Fig 2A ). Uten å legge NaCIO
4 anisotropi forblir den samme uavhengig av VM26 konsentrasjon. For ytterligere å bekrefte at VM26-indusert anisotropi endringen er enzym avhengige, utførte vi anisotropi måling uten topoisomerase i ellers identiske reaksjonsbetingelser. Fra resultatene vist i figur 2B, bekreftet vi at medikamentavhengig økning av anisotropi etter behandling med NaCIO
4 ble Top2α-mediert.
(A) Reaksjoner av Alexa Fluor 488-merket DNA med human Top2α var utføres med VM26 konsentrasjoner på 60, 120, 180, 240 og 300 uM. Det ble observert en doseavhengig økning i anisotrofien med økende konsentrasjoner VM26 hvis reaksjonene ble avsluttet med NaCIO
4 (fast firkant), men ikke uten at det (tom trekant). (B) Den doseavhengig økning av anisotropi med økende VM26 ble observert når reaksjonene inneholdt menneske Top2α (firkanten), men ikke uten det (tom firkant).
Tilsetting av NaCIO
4 opphever Top2α binding til DNA, men beholder de legemiddel stabiliserte enzym-DNA ternære komplekser
for å undersøke om økningen av anisotropi etter tilsetning av NaCIO
4 kommer fra de Top2α-bundet DNA komplekser, vi testet effekten av å endre rekkefølgen av tilsetningen av nøkkelkomponenter i disse reaksjonene. I fravær av NaCIO
4, anisotropien av DNA-enzymkomplekser er 0,19 (fig 3A-II), og tilsetningen av NaCIO
4 reduserer anisotropi til 0,06 (fig 3A-III), en verdi som ligger nær med den i fri oligonukleotid (fig 3A-i). Dette resultat viser at NaCIO
4 er istand til å dissosiere enzym fra DNA. Mens dannelsen av enzymet DNA og teniposid (VM26) trefoldig komplekse resultater i NaCIO
4-resistente anisotropi (figur 3A-IV), inkubasjon uten Mg
++ (figur 3A-V) eller pre-inkubasjon av enzymet med NaCIO
4 før tilsetningen av DNA, uavhengig av tilstedeværelsen av VM26, fører til en lavere anisotropi (fig 3A-VI og VII). Dette resultatet tyder på at NaCIO
4 er i stand til å inaktivere enzymet og inhiberer enzymets evne til å danne DNA bundet komplekser. Siden Mg
++ er nødvendig for enzymatiske aktiviteter topoisomeraser, kravet om Mg
++ tyder på at enkel binding er ikke tilstrekkelig for dannelsen av NaCIO
4 bestandig kompleks. Med unntak av de VM26-stabiliserte ternære komplekser, ved behandling med NaCIO
4 i alle andre betingelser reduserer anisotropien til en verdi lik den fri DNA-substratet, som bekrefter at NaCIO
4 er i stand til å forstyrre enzym-DNA-komplekser uten en Top2α-målsøkende middel. For å demonstrere konsentrasjonen avhengighet av NaCIO
4 for å tillate for spesifikt å detektere VM26-stabiliserte enzym-DNA komplekser, analyserte vi anisotropien av binære kompleks etter tilsetning av forskjellige mengder NaCIO
4 (figur 3B). De maksimale dissosiasjon nivåer ble oppnådd ved en NaCIO
4 konsentrasjon på 100 mM, med IC
50 ved 40 mM, og det er små variasjoner opp til 750 mM. Vi har således vist at NaCIO
4 er et effektivt middel til å forstyrre protein /DNA komplekser med et bredt konsentrasjonsområde mellom 100 til 750 mM, og den kan tilpasses for bruk i HTS for Top2α-målsøkende midler.
(A) ble observert på VM26 avhengig økning i anisotropi da reaksjonen ble stoppet med NaCIO
4 (reaksjon IV vs reaksjon III), og ikke når NaCIO
4 ble tilsatt i nærvær av Top2α før tilsetningen av DNA, uten hensyn til tilsetning av VM26 (Reactions VI og VII vs Reaksjon IV). Anisotropi observert i kontrollgruppen ble bare DNA (reaksjon I), DNA /Top2α uten VM26 (reaksjon II), og inkubasjon uten Mg
++ (Reaksjon V). (B) Optimalisering av NaCIO
4 konsentrasjonen for anisotropi analysen. Reaksjonen ble utført i 50 ul reaksjonsbuffer Top2 med 300 uM VM26, 50 nM Alexa Fluor 488-merket DNA og 250 nM human Top2α. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Før måling av anisotropi, NaCIO
4 ble tilsatt til hver reaksjonsblanding til å gi en sluttkonsentrasjon opptil 750 mM. Den maksimale grad av dissosiasjon ble oppnådd ved en konsentrasjon på 100 mM eller over. (C) Anisotropy observert med etoposid (VP16), mamsa, mitoxantron (MXT), og med teniposid (VM26) som positive kontroller, etter behandling med 200 mM NaCIO
4. Konsentrasjonene av disse kjente Top2α legemidler som brukes her var 300 mikrometer for VP16 og VM26, og 15 mikrometer for mamsa og MXT.
For å teste at våre anisotropi analyser kan være effektive i å identifisere andre kjente Top2α målretting anti-kreft narkotika foruten teniposid (VM26), målte vi anisotropi etter NaCIO
4 behandling med etoposid (VP16), mamsa, og mitoxantrone (fig. 3C). I likhet med at målt med teniposid, alle tre kjente kreftlegemidler produsert anisotropi avlesninger over kontrollene.
NaCIO
4 kan fremme generasjon bretter DNA i narkotika stabilisert Top2α trefoldig komplekser
virkningene av NaCIO
4 i å forstyrre Top2α-bundet DNA komplekser ble undersøkt med et oligonukleotid substrat overvåket ved fluorescens anisotropi-analyser. For ytterligere å undersøke potensielle mekanistiske roller NaCIO
4 i Top2α reaksjoner, bestemmer vi oss for å bruke plasmid DNA som substrat som gir anvendelsen av agarose gelelektroforese for å undersøke DNA strukturelle endringer. Med en sterk denaturerende SDS for å terminere reaksjonene med plasmid-DNA, nærværet av en anti-kreft legemiddel som teniposid (VM26) kan innfange de spaltbare kompleksene og øke produkter av linearisert og nicked DNA. Vi har utført forsøk for å undersøke DNA-produktene genereres fra en reaksjonsblanding inneholdende Top2α-DNA-VM26 ternære komplekser som er avsluttet med enten SDS eller NaCIO
4. Å fjerne proteinene som var knyttet til DNA etter behandling med disse dissosiering reagenser ble stoppet reaksjonsblandingene behandlet med proteinase K før deres analyser med agarosegelelektroforese. Reaksjonsproduktene etter at de er avsluttet med SDS viste det forventede mønster av fremkomsten av lineariserte DNA overveiende, og noen bretter arter også (figur 4A). I en interessant kontrast, reaksjonsprodukter som genereres fra NaCIO
4 behandling gitt mer bretter DNA produkter og mindre lineær form. Med NaCIO
4 for å stoppe reaksjonene, produksjon av bretter og lineariserte former økte i parallell ved økende VM26 konsentrasjoner i disse reaksjonene (figur 4B), som viser at begge produkter er sannsynlig generert gjennom VM26 handling i entrapping spaltbare kompleksene. Forrige rapport viste allerede at VM26 fremmer dannelsen av enkelttrådet DNA hakk, i tillegg til å doble strandet pauser, avhengig av concertedness av spalting fra to protomere i Top2 dimer [21]. Både biokjemiske og strukturelle biologiske data viser at hver protomer kan binde en enkelt legemiddelmolekylet, tilstedeværelsen av noe som kan påvirke spaltning /religering mediert av det dimere enzymet [22], [23]. Det resultat at NaCIO
4 har en tendens til å generere mindre lineariserte spaltningsprodukter derav, og mer komme nicked form, muligens på grunn av at det er en mindre potent enn denatureringsmiddel SDS og mindre effektiv for å indusere dannelsen av spaltningspunkter komplekser. Man kan således forvente å observere mer lineariserte produkter med tilstedeværelse av mer enzym og consequentially mer spaltbare kompleksene. Vi kunne vise at ved å øke enzymet DNA støkiometri, de lineariserte DNA-produkter økte samtidig med bretter skjemaet når reaksjonene ble avsluttet med NaCIO
4 (fig 4C). Under de samme reaksjonsbetingelser, men terminert med SDS, den lineariserte produktene ble ytterligere nedbrutt for å gi DNA-fragmenter som er mindre enn den lengdeenhet molekylet. DNA cleavage og sammenpressing indusert av NaCIO
4 er ikke begrenset til de sirkulære DNA-substrater. Vi kunne lett demonstrere DNA cleavage med lineær underlaget ved høyere enzym /DNA forhold (figur 4D). Nedbrytningen av DNA for å generere under full lengde molekyler fra NaCIO
4 behandling er på grunn av den nære avstand mellom to kutt på sidestilte tråder og også noen dobbel tråd spalting under slike forhold. Imidlertid, under de samme betingelser tilsetning av SDS kan indusere mer omfattende DNA-ødeleggelse, noe som viser at SDS er en sterkere denatureringsmiddel og mer effektiv i å utløse Top2α spaltningsreaksjon. Interessant, da SDS og NaCIO
4 ble lagt etter hverandre, kan SDS fremme generasjon av mindre DNA-produkter selv når det ble lagt til etter NaCIO
4. Dette resultatet igjen tyder på at NaCIO
4 ikke helt forstyrre enzym /DNA /narkotika trefoldig komplekser, fortsatt opprettholde deres følsomhet mot SDS i å fremme flere cleavage komplekser.
(A) Reaksjoner av menneskelig Top2α og pUC19 plasmid DNA ble avsluttet med enten NaCIO
4 eller SDS. Tilsetning av NaCIO
4 til 100 mM fører til dannelse av flere bretter DNA-produkter samtidig tilsetning av SDS resulterer i en preferanse for lineær de. Reaksjonene ble utført med 8,5 nM pUC19, 3,75 nM Top2α, og 100 uM VM26, terminert ved tilsetning av enten NaCIO
4 eller SDS, reaksjonsproduktene ble behandlet med proteinase K, og analysert ved elektroforese i 1,2% agarose-gel inneholdende 0,15 ug /ml etidiumbromid. (B) DNA-spaltningsseter analyser ble utført under lignende betingelser, bortsett fra med økende konsentrasjoner av VM26, etterfulgt av tilsetning av NaCIO
4. En økning i bretter DNA spaltningsproduktene ble observert med høyere mengder av VM26. (C) plasmid DNA spaltningsseter analyser ble utført ved anvendelse av forskjellige enzym til DNA-forhold som angitt. Linear DNA-produkter (full-lengde eller under full lengde) fra SDS behandling, og både komme nicked og lineær DNA fra NaCIO
4 behandling øker med høyere enzymet DNA-forhold. (D) Reaksjoner i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av VM26 inneholdt lineære pUC19 som substrat med et enzym /DNA-forhold på 20, etterfulgt av tilsetning av NaCIO
4 eller SDS, eller begge deler i rekkefølge, for å stoppe reaksjonene. De størrelsesmarkører, og lineære pUC19 ble lagt i lengst til venstre to baner. Plassering av DNA ble merket som NC (bretter sirkulær), L (lineær), NSC (negativ supercoil), og RC (avslappet).
NaCIO
4-behandlet tre-komplekser analysert av ultrasentrifugering på glyserol-gradienter
Vi anvendte ultrasentrifugering på glyserol-gradienter for å undersøke stabiliteten av Top2α-DNA komplekser etter behandling av NaCIO
4, og virkningen av en anti-kreft legemiddel. Glycerol-sentrifugering ble ofte brukes til å separere makromolekyler basert på deres størrelse og form. Vi inkubert Top2α med plasmid-DNA, enten i nærvær eller fravær av VM26, og tilføres den til glycerol gradient direkte eller etter behandling med NaCIO
4. Fraksjonene ble samlet opp etter sentrifugering og plassering av Top2α ble bestemt ved western blot med antistoff mot Top2α. I fravær av VM26, Top2α sedimentert mer mot bunnen uten NaCIO
4-behandling (figur 5, felt 1 vs 3). Tilstedeværelsen av NaCIO
4 skift Top2α til en lettere fraksjon, i en posisjon svarende til fri enzym (figur 5, kolonnene 3 vs 5), noe som bekrefter evnen til NaCIO
4 for å forstyrre enzym-DNA-kompleks i fravær av et anti-kreft legemiddel. I nærvær av VM26, behandling med NaCIO
4 ikke grovt endre sedimentering av Top2α, noe som tyder på at NaCIO
4 fremdeles opprettholder de fleste av de ternære komplekser (figur 5, sporene 2 vs 4). Eksperimenter fra både fluorescens anisotrofien og glycerol gradient sedimente støtte tanken som NaCIO
4 behandling gir et middel for å skille stabiliteten av Top2α-DNA komplekser avhengig av nærvær av en anti-kreft legemiddel, og gir dermed oss en metode for automatisert screening -analysen og som gjør det mulig for bruk i HTS-plattformen.
glycerol gradient løsning er lagdelt i en polyallomer rør som starter fra 60% til 30% glyserol. Reaksjonen for Top2α /DNA-kompleks-dannelse ble utført i 80 pl av en oppløsning inneholdende 100 uM VM26, 34 nM pUC19 og 3,75 nM human Top2α.
