Abstract
Bakgrunn
MIR-26a spiller en avgjørende rolle i tumordannelse, enten som en tumor suppressor eller som et onkogen miRNA, avhengig av ulike krefttyper. Imidlertid er funksjonen til mir-26a i kreft i bukspyttkjertelen er ikke klart utledet. Denne studien er designet for å avgjøre rollene til Mir-26a i bukspyttkjertelkreft og sin tilknytning til overlevelse av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen.
Metoder
uttrykk for MIR-26a ble undersøkt i 15 par av pankreasgang adenokarsinom (PDAC) og deres tilstøtende godartede pankreas vev (ABPT), ved QRT-PCR. Resultatene ble bekreftet av
in situ
hybridisering med to paneler av 106 PDACs og deres ABPT microarray. Foreningen av MIR-26a uttrykk med total overlevelse ble bestemt. Utbredelsen og cellesyklus distribusjon av CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1 celler, transfektert med MIR-26a etterligner eller en MIR-26a-hemmer, ble vurdert ved hjelp av Cell Counting Kit-8-analysen og flowcytometri, henholdsvis. Cellen tumorigenicity ble evaluert via murine xenograft eksperimenter. Cyclin D2, E2, EZH2, og PCNA-nivåene ble analysert ved hjelp av Western blot og immunhistokjemi.
Resultatene
MIR-26a ble uttrykt i cytoplasma av pankreas ductal epitelceller, mens dens ekspresjon ble betydelig nedregulert i PDAC vev sammenlignet med at av ABPT. Pasienter med lav MIR-26a uttrykk hatt en betydelig kortere overlevelse enn de med høy MIR-26a uttrykk.
in vitro Hotell og
in vivo
analyser viste at overekspresjon av MIR-26a resulterte i cellesyklus arrest, hemmet celledeling, og redusert tumorvekst, som ble assosiert med cyclin E2 downregulation.
Konklusjoner
MIR-26a er en viktig suppressor av bukspyttkjertel ductal carcinoma, og kan vise seg å være en roman prognostisk faktor og terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen behandling
Citation. Deng J, Han M, Chen L, Chen C, Zheng J, Cai Z (2013) The Tap av MIR-26a-mediert Post-Transkripsjonell Regulering av cyclin E2 i bukspyttkjertelen celleproliferasjon og redusert pasient Survival. PLoS ONE 8 (10): e76450. doi: 10,1371 /journal.pone.0076450
Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, USA
mottatt: 16 november 2012; Godkjent: 27 august 2013; Publisert: 08.10.2013
Copyright: © 2013 Deng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (prosjekt nr 81172077) og Shanghai biobank nettverk av felles menneskelig svulstvev fondet (prosjekt nr 12DZ2295102). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen, spesielt pankreasgang adenokarsinom (PDAC), er den fjerde vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall på verdensbasis. Med en median overlevelsestid på mindre enn 6 måneder og en gjennomsnittlig 5 års overlevelse på mindre enn 5%, dødelighet-insidensratio for pasienter med kreft i bukspyttkjertelen er ca. 99%, med svært dårlig prognose [1], [2] . Derfor molekylære mekanismene som er involvert i svulsten ondartet transformasjonsprosessen, herunder rollen microRNAs (miRNAs), må forstås for forbedret diagnostisering og behandling av kreft i bukspyttkjertelen [3], [4].
miRNAs er naturlig forekommende, små, enkeltrådet, ikke-kodende RNA som medierer genekspresjon på post-transkripsjons og translasjonsforskning nivåer i både planter og dyr [5], [6]. Disse molekylene spiller avgjørende roller i humane cancerformer så som kreft i bukspyttkjertel [7], [8], så vel som i kreft oppførsel, inkludert dens spredning, invasjon, migrering, apoptose, og medikamentresistens. Den miRNA funksjonelle nettverk av kreft er knyttet til flere sider ved tumor patogenesen [9]. Dette nettverket kan brukes til å vurdere diagnose og prognose av kreft, samt å vurdere mulige behandlingsalternativer.
MIR-26a er en velprøvd tumor suppressor som er signifikant nedregulert i leverkreft (HCC) [10]. Redusert MIR-26a nivåer har vært assosiert med dårlig prognose; disse nivåene er prediktive for den terapeutiske respons hos pasienter med HCC til interferon-α. I tillegg har MIR-26a overekspresjon blitt korrelert med betydelig tumorregresjon, noe som indikerer at MIR-26a gjeninnføring hos pasienter med kreft kan være en effektiv behandlingsstrategi [11]. Vår tidligere studie viste at tumorspesifikt MIR-26a-overekspresjon, drevet av en hAFP-TERT dual-promoteren, redusert levedyktighet av tumorceller i HCC ved å regulere ekspresjonen av østrogenreseptoren (ER) -α, progesteronreseptoren (PR) , p53, cyclin D2, E2 og [12]. Men den nøyaktige forholdet mellom MIR-26a og bukspyttkjertelkreft er ukjent.
I denne studien har vi undersøkt Mir-26a uttrykk nivåer i humane PDAC vev. Vi bestemte den kliniske betydningen av MIR-26a downregulation og sine roller i cellevekst og cellesyklus distribusjon. I tillegg har vi brukt en musemodell for å undersøke den potensielle rolle MIR-26a i bukspyttkjertelen tumorigenesis. Våre funn gir grunnleggende informasjon for å forstå patogenesen av kreft i bukspyttkjertelen og dens mulige terapeutiske strategier.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i samsvar med Helsingfors retningslinjer for menneske fagstudier og ble godkjent av Institutional Review board of Second Military Medical University, Shanghai, Kina. Signert informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne for prøvetaking og analyse. Alle prosedyrer på dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Second Military Medical University.
Pasienter og vevsprøver
Data på pasienter med PDAC ble hentet over en 3-årig periode (januar 2008 til desember 2010) fra Institutt for patologi arkiver Changhai Hospital, Second Military Medical University i Shanghai, Kina og Shanghai Biobank Network of felles menneskelig svulstvev. Alle pasientene ble behandlet med kirurgi, og i alt ble 106 par av prøver fra PDACs og deres ABPT inkludert. Videre ble ytterligere 15 par av PDAC og deres ABPT prøver fra pasienter under kirurgiske frioppstillinger og lagret i flytende nitrogen. Pasienten egenskaper, klinisk presentasjon, staging, laboratoriefunn, behandling, objektiv respons, overlevelse, og annen relevant informasjon ble hentet fra sykehuset informasjonssystem. Pasientene ble evaluert ved standardmetoder, inkludert deres historie, fysisk undersøkelse, og biokjemiske-hematologiske tester. TNM Staging System ble brukt til å bestemme pasientens sykdomsstatus.
morfologisk analyse og konstruksjon av Tissue Microarray
Alle prøver ble oppnådd ved kirurgi, fast i formalin, og i parafin. Deler av 4-mikrometer tykkelse ble farget med hematoksylin og eosin før de blir vurdert av tre patologer for morfologiske trekk ved kreft i bukspyttkjertelen, ifølge Verdens helseorganisasjon klassifisering av fordøyelsessystemet [13]. Microarray (TMA) ble konstruert som tidligere beskrevet [14]; hver microarray inneholdt to paneler av 106 PDACs og deres ABPT som ble arrangert på 2,0 mm diameter kjerner.
omvendt transkripsjon reaksjon og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
Totalt , 15 par av frosne PDACs og deres ABPT prøver (makro-dissekert) ble brukt for QRT-PCR i henhold til Invitrogen protokoll. U6 ble anvendt som endogene kontroll for å normalisere mengden av total RNA i hver prøve. QRT-PCR ble utført i tre eksemplarer, med nontemplate kontroller. Den relative uttrykket ble beregnet basert på komparative Ct metode (2
-ΔΔ
Ct
) [12]. Primersekvensene er oppført i tabell S1
miRCURY LNA mikroRNA Detection
in situ
Hybridisering og Survival Analysis
Låst nukleinsyre (LNA) -.
in situ
hybridisering (ISH) ble utført på PDAC TMA bruker respektive miRCURY LNA ™ prober mot har-MIR-26a eller har-MIR-21 (som positiv kontroll) (Exiqon, Vedbæk, Danmark). Disse prober ble anvendt i henhold til produsentens protokoll, slik som tidligere beskrevet [15]. Kolorimetrisk deteksjon ble utført ved å inkubere prøvene i 30 minutter ved hjelp av en substrat-kromogen oppløsning, med 0,04% DAB (DAKO, Danmark) og 0,05% H
2o
2. Seksjonene ble kontra med hematoksylin før eksamen ved hjelp av et lysmikroskop (Leica, Tyskland) [16].
LNA-ISH resultater ble semikvantitativt vurdert. Basert på intensiteten av hybridisering, ble prøver scoret som «0» for negative; «1» for svakt positiv; «2» for moderat positiv; og «3» for sterkt positiv. Prosentandelen av positive epitelceller ble scoret som «0» for ≤10%; «1» for 11% -25%; «2» for 25% -50%; og «3» for ≥50%. Intensiteten og prosentpoengsummer ble summert for å få den endelige ISH poengsum, som ble klassifisert som «negative» ( 3) eller «positive» (≥3) [17]
LNA-ISH resultater for. MIR-26a eller MIR-21 og de kliniske behandlings data for 106 pasienter ble videre analysert. Behandlingen respons på kjemoterapi og strålebehandling, inkludert pasientens kliniske manifestasjoner, computertomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MRI) funn og CA19-9 nivåene ble objektivt vurdert. Dermed er alle pasientene i studien ble vurdert for deres respons på behandling, som ble vurdert som «fullstendig respons», «delvis respons», «stabil sykdom», «progressiv sykdom», «tidlig død av sykdom eller forgiftning», og så videre.
Cyclin D2, Cyclin E2, og PCNA immun i bukspyttkjertelen Vev
seksjonene ble forbehandlet ved 65 ° C i 2 timer, etterfulgt av gradert deparaffinization. Antigen henting ble utført før inkubasjon med de primære antistoffer av cyclin D2 (1:300 fortynning, Millipore), cyclin E2 (1:300 fortynning, Millipore), og voksende cell nuclear antigen (PCNA) (1:300 fortynning, Dako) , over natten ved 4 ° C, med normal IgG som en negativ kontroll. Deretter ble objektglassene inkubert i 2 timer ved romtemperatur med HRP-konjugert sekundært antistoff (1:100; DAKO). HRP aktivitet ble oppdaget ved hjelp av en flytende DAB + Substrat-kromogen System (DAKO). Endelig seksjonene ble kontra med hematoksylin og fotograferte. De immunhistokjemiske resultatene ble vurdert ved hjelp av en semikvantitativ metode, med endelig score basert på intensiteten og andelen positive epitelceller bestemt av deres immunkjemi; disse score ble klassifisert som «negative» ( 3) eller «positive» (≥3) [17]. De PCNA nivåene ble scoret i henhold til prosentandelen av positive epitelceller som «0» for ≤5%; «1» for 5% -25%; «2» for 25% -50%; «3» for ≥50%. Prøvene ble klassifisert i grupper med en «lav proliferativ indeks» (mindre enn 2) eller «high proliferative indeks» (≥2) [13], [17]. De immunhistokjemiske resultatene ble deretter videre analysert med oppfølgingsdata.
Cell Culture
PDAC cellelinjer CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1, for godt (Grade 1) , moderat (grad 2), og dårlig (grad 3) differensiert kreft i bukspyttkjertelen, henholdsvis, ble hentet fra den kinesiske Senter for Type Culture Collection (Wuhan, Kina). Celler ble dyrket i Dulbeccos minimal essensielt medium (supplert med 10% føtalt bovint serum) og holdt i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C i en inkubator.
Plasmider og Cell Transfeksjon
De PDAC cellelinjer CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1 ble sådd på 3 × 10
5 celler per brønn i 12-brønners plater, og transfektert med MIR-26a etterligner, hemmere eller cyclin E2 siRNA (Dharmacon) ved en sluttkonsentrasjon på 100 nM ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll.
MIR-26a overekspresjon vektor p-hTERT-MIR-26a (PTM) og dens styrevektor p-hTERT (pT) ble konstruert som tidligere beskrevet [12]. For å generere stabile cellelinjer, 4 x 10
5 celler i hver brønn i en 6-brønns plate ble transfektert med 2 ug av plasmider (PTM eller Pt) ved hjelp av Lipofectamine 2000, i henhold til produsentens instruksjoner. Positive kulturer ble valgt med 800 ug /ml G418 i 2 uker.
Western Blot analyse
Cellene ble vasket med iskald PBS, lysert, og suspenderes i et lyseringsbuffer (Promega). Den resulterende totale proteinekstrakt ble separert ved 12% SDS-PAGE-geler. Immunoblotting ble utført på polyvinylidenfluorid membraner. De primære og sekundære antistoffer ble brukt var et kanin-anti-humant antistoff og et geite-anti-kanin-IgG, henholdsvis (Sigma). Immundeteksjon ble utført ved bruk av et HRP-baserte kjemiluminescerende substrat [18]. Tabell S2 viser antistoffer som brukes i denne studien.
celleproliferasjon og cellesyklus Analyser
proliferativ potensialet av celler ble analysert i henhold til protokollen av Cell Counting Kit-8 (CCK-8 ) analyse (Dojindo, Japan). Cellene ble trypsinert, vasket to ganger med PBS, samlet ved sentrifugering, fiksert i 70% kald etanol, inkuberes med propidiumjodid og analysert ved fluorescens-aktivert cellesortering (Miltenyi, Tyskland).
i vivo
tumorigenesis analysen
SW-1990 celler fra moderat differensiert PDAC ble stabilt transfektert med PTM (p-hTERT-MIR-26a) eller pT (kontroll vektor). De transfekterte celler ble samlet inn, suspendert i 200 mL PBS (1 × 10
7 celler), og ble injisert subkutant i 4 uker gamle BALB /c naken mus (
n
= 8). For å unngå de forhåndseksisterende forskjeller mellom de enkelte mus, både stabile cellelinjer (PTM eller PT) ble individuelt injisert i motsatt flankene av samme mus; celler transfektert med PTM ble injisert inn i den venstre flanke, mens kontrollene (transfektert med vektoren pT) ble injisert inn i den høyre flanke. Musene ble holdt i en spesifikk patogen-fritt miljø for 5 uker og deretter avlivet. Svulsten volum
V
ble beregnet ved hjelp av sin lengde
L Hotell og bredde
W
, ifølge ligningen
V
= 0,4
LW
2. De xenografttumorer mus ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin voks for immunokjemiske analyser av cyclin D2, E2, og PCNA.
Statistical Analysis
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik ( SD). De sammenslutninger av MIR-26a uttrykk med de kliniske patologiske egenskaper ble analysert ved hjelp av Chi-kvadrat eller Mann-Whitney tester. Overlevelseskurven ble bygget ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test. Grupper ble sammenlignet ved hjelp av en student
t
-test. Korrelasjonsanalyse ble utført ved bruk av Pearson korrelasjonsanalyse. Alle sannsynlighets verdier ble analysert ved hjelp av en to-tailed test og som betydelig når
P
0,05. Analysene ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 17.0) programvare (SPSS Inc., Chicago, USA).
Resultater
nedregulering av MIR-26a i bukspyttkjertelen vev er assosiert med Survival
de clinicopathological karakteristikker av 106 tilfeller av PDAC er presentert i tabell 1. de fleste av disse pasientene var i Stage II (70,8%), noe som indikerer at funnene er viktige for pasienter som fortsatt er kirurgisk resectable med den beste muligheten for en 5-års overlevelse. QRT-PCR-analyse viste at Mir-26a uttrykk var betydelig lavere i PDAC vev enn i normalt vev (
n =
15,
P
0,05, Fig. 1A), som ble ytterligere bekreftes av LNA-ISH analyse av 106 tilfeller av PDAC. LNA-ISH viste at Mir-26a var til stede i cytoplasma av bukspyttkjertelen duktale epitelceller (fig. 1C og 1D). I henhold til intensitet og prosentpoengsummene for de ISH resultater kriteriene [17], 44 av 106 (41,5%) bukspyttkjertelkreft vev og 84 av 106 (79%) tilstøtende normale vev (ISH ≥3;
P
0,001) var positive for MIR-26a. MIR-21-uttrykk som positiv kontroll, ble analysert på de samme pasienter. MIR-21 var positiv i 99 av de 106 (93,4%) PDAC vev og i 25 av 106 (23,6%) tilstøtende normalt vev, basert på ISH scoring kriterier (figur 1E og 1F;. ISH ≥3;
P
0,01). Forholdet mellom kliniske karakteristika med MIR-26a uttrykk i PDAC vev, som bestemmes av LNA-ISH, er presentert i tabell 2.
(A) Gjennomsnittlig uttrykk nivå av MIR-26a i humane PDAC prøver (
n
= 15) og normal bukspyttkjertelen vev (
n
= 15). miRNA overflod ble bedømt ved QRT-PCR og normalisert til U6 RNA. Verdier er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (B) Total overlevelse etter reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen med MIR-26a-negativ versus MIR-26a-positive grupper. Mir-26a-negative gruppen hadde signifikant kortere overlevelse enn MIR-26a-positive gruppe (
P
= 0,029). (C, D)
In situ
hybridisering for MIR-26a i bukspyttkjertelen lesjoner.
In situ
hybridisering viste mye lavere Mir-26a uttrykk i PDAC vev (C) enn i ABPT (D). Det innfelte viser negativ kontroll (kryptert sekvens probe). Cytoplasmatisk farge i ductal epitelceller står i kontrast med negativ farging med det forvrengte sonde. (E, F)
In situ
hybridisering for MIR-21 (positiv kontroll) i bukspyttkjertelen lesjoner.
In situ
hybridisering viste mye sterkere MIR-21 uttrykk i PDAC vev (E) enn i ABPT (F). Det innfelte viser negativ kontroll (kryptert sekvens probe). Cytoplasmisk farging i tumorceller som står i kontrast med negativ farging av det forvrengte sonden. Original forstørrelse, 100 ×.
Oppfølgings data fra 73 av de 106 pasientene viste at totalt 18 pasienter ble behandlet med adjuvant kjemoterapi av gemcitabin og oksaliplatin, mens de resterende 55 pasientene ble ikke behandlet med kjemoterapi eller strålebehandling. Blant de 73 pasientene som fikk oppfølging, 68 døde, med 16 pasienter som får kjemoterapi og 52 uten tilleggsbehandling. Imidlertid 5 av de 73 oppfølgings pasienter overlevde. Den målte total overlevelse var kreft-spesifikke; median overlevelse var 8,7 måneder i MIR-26a-negativ gruppe ( 3;
n
= 43) og 12 måneder i MIR-26a-positive gruppen (≥3;
n
= 30). 1- og 3-års overlevelse var 39,5% og 0%, henholdsvis i MIR-26a-negative gruppe, men var 50% og 6,3%, henholdsvis i MIR-26a-positive gruppen. Den totale overlevelsesanalyse viste at MIR-26a-negative gruppen hadde signifikant kortere overlevelse enn den positive gruppen (
P
= 0,029, Fig. 1B). Adjuvant kjemoterapi var ikke assosiert med overlevelse av pasienter med PDAC (
P =
0,417). Sammenhengen mellom MIR-26a ekspresjon og andre parametere (slik som alder, kjønn, tumormasse plassering, tumorstørrelse, tumorcelledifferensiering, neural invasjon, lymfeknute nummer, fjern metastase) var ikke statistisk signifikant (Tabell 2). Den multivariate overlevelsesanalyse (Cox regresjonsmodell) av konvensjonelle kliniske prognostiske faktorer og MIR-26a hevdet at MIR-26a er en uavhengig prognostisk faktor i bukspyttkjertelkreft (
P =
0,001; 95% CI, 0,185 til 0,650; Tabell 3).
Cyclin D2, Cyclin E2, og PCNA immun i bukspyttkjertelen vev og deres forening med Survival
de immun vevsprøver avslørte at både kreftceller og duct epithelial celler av de tilstøtende godartede bukspyttkjertelvev uttrykte ikke cyclin D2 (fig. 2A og 2D). Imidlertid viste cyklin E2 sterk positiv farging i tumorcellene (90/106) og kanalsystem epitelceller i de tilstøtende benign pankreatiske vev (76/106;
P
= 0,024; Fig. 2B og 2E). Det var ingen signifikant forskjell i total overlevelse hastighet mellom 73 oppfølgings pasienter som var positive (
n =
61) eller negative (
n =
12) for cyclin E2 (
P
= 0,676, fig. 2G). Resultatene presentert PCNA-positiv farging for tumorceller (93/106) og for kanal epitelceller de tilstøtende benign pankreatiske vev (68/106;
P
0,01). Den sterke positive farging av PCNA i PDAC vev indikerte en større celle proliferativ aktivitet i bukspyttkjertelkreft (fig. 2C og 2F), sammenlignet med negativ farging i tilstøtende normale vev. Den totale overlevelsesanalyse viste at tilfeller med en PCNA høy proliferativ indeks (
n
= 51) i PDAC vev hadde signifikant kortere overlevelse enn de tilfeller med PCNA lav proliferativ indeks (
n
= 22;
P
= 0,007, fig 2 H).. Pasienter med høy PCNA proliferativ indeksen var også cyclin E2 positive.
PDAC tumorvev (PDAC) var negative for cyclin D2 (A) og sterkt positivt for cyclin E2 (B), med en høy PCNA proliferativ indeks (C). De tilstøtende godartet pankreatiske vev (ABPT) var negative for cyclin D2 er (D), og positiv for cyclin E2, som observert i ductal epitelceller ABPT (E). PCNA var meget lav i normale pankreatiske vev (F). De innfellinger av A, B og C viser de negative kontrollene. Det innfelte i D indikerer at cyclin D2 er en positiv kontroll av lunge adenokarsinom. Original forstørrelse, 200 ×. Total overlevelse etter reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen med cyclinE2-positive versus cyclinE2-negative grupper var ikke signifikant (
P
= 0,676) (G), mens total overlevelse etter reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen med PCNA høy proliferativ indeks versus PCNA lav proliferative indeksgruppene hadde signifikant kortere overlevelse (
P
= 0,007) (H).
en korrelasjonsanalyse for både MIR-26a og cyclin E2 uttrykk (Pearson koeffisient,
R
2
= 0,004) og for MIR-26a og PCNA uttrykk (
R
2
= 0,024), viste en signifikant sammenheng. De punktdiagrammer av korrelasjonsanalyse er vist i figur S1.
MIR-26a Overuttrykte hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler ved nedregulering av Cyclin E2 og EZH2 Expression
For å utforske effekten av MIR-26a på bukspyttkjertelkreft cellevekst, de PDAC cellelinjer med ulike karakterer CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1 ble transient transfektert med en MIR-26a etterligne eller hemmer. Den QRT-PCR-analyse viste at transkripsjonen av MIR-26a i den etterligne gruppen ble betydelig økt (4,44-fold i CAPAN-2, 3,45-fold i SW-1990, og 3,59 ganger hos Panc-1), mens transkripsjon av MIR-26a i inhibitoren gruppen var signifikant redusert (0,35-fold i CAPAN-2, 0,43-fold i SW-1990, og 0,44 ganger hos Panc-1), sammenlignet med kontrollcellelinjer (
P
0,05;. fig. 3A-3C)
QRT-PCR analyse viste transkripsjon av MIR-26a i ligner, hemmer og kontrollgrupper (A, B, C), og ekspresjon av cyclin E2 i cyclin E2 siRNA, kontroll siRNA, og kontrollgrupper (D, E, F). Spredning av PDAC cellelinjer transient transfektert med MIR-26a etterligner, miR26a inhibitor eller cyclin E2 siRNA ble analysert ved hjelp av CCK-8 proliferasjonsanalyse (G, H, I). Reguleringen av cyclin E2 eller EZH2 ekspresjon av MIR-26a ble analysert ved hjelp av Western blot (J, K, L), og Western blot-analyse bekreftet også forventet effektiviteten av cyclin E2 siRNA i tre PDAC cellelinjer (M, N, O) .
for å utforske effekten av cyclin E2 på bukspyttkjertelkreft cellevekst, ble cyclin E2 siRNA transfektert inn i hver av de tre PDAC cellelinjer, og knockdown ble bekreftet ved QRT-PCR-analyse, som viste som uttrykk for cyclin E2 i siRNA-transfektert gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med kontrollceller (0,201-fold i CAPAN-2, 0.274-fold i SW-1990, og 0,327-fold i Panc-1) (fig. 3D -3F).
for å finne ut hvilken rolle MIR-26a i bukspyttkjertelkreft cellevekst, ble CCK-8 spredning analyse utført i CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1 celler som ble transient transfektert med en MIR-26a etterligne eller hemmer. Resultatene viste at MIR-26a-etterligner hemmet tumorcellevekst, mens den miR26a-inhibitor markedsført tumorcellevekst. I tillegg cyclin E2 siRNA hadde en tilsvarende rolle som MIR-26a-mimic ved hemming av tumorcelleformering (fig. 3G-3I).
MIR-26a ble rapportert til direkte å formidle cyclin E2 og cyklin D2 funksjoner i HCC [12] og brystkreft [19]. Uttrykket av polycomb protein EZH2 ble økt i PDAC, som dermed økt celleproliferasjon og chemoresistance [20]. Men våre studier viste at cyclin D2 flekker var nesten negativ i kreft i bukspyttkjertelen vev. Dermed ble forholdet mellom MIR-26a og cyclin E2 eller EZH2 analysert ved hjelp av Western blot. Resultatene viste at cyklin E2 og EZH2 nivåene var både redusert i MIR-26a ligne-transfekterte celler, men ble øket i de MIR-26a inhibitor-transfekterte celler (fig. 3J-3L) sammenlignet med kontrollcellene. Western blot-analyse bekrefter den forventede effektivitet av cyclin E2 siRNA i de tre PDAC cellelinjer (Fig. 3M-3o).
Deretter vi analyserte cellesyklusfordelingen av den CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1-celler som ble transfektert med MIR-26a etterligner eller MIR-26a-inhibitor, samt kontrollene. Cellene transfektert med MIR-26a ligne akkumulert i G
en fase, mens S-fasen befolkningen redusert. Imidlertid, en motstående resultat ble observert i celler transfektert med den MIR-26a-inhibitor (fig. 4). Disse resultatene antydet at den proliferative hemming av MIR-26a var delvis på grunn av en G
1-fase arrestasjonen av de tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer.
Celler ble enten tilført med MIR-26a etterligner eller hemmere. Kontrollene ble ubehandlet. D, H og L indikere statistisk cellesyklus distribusjon for CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1, henholdsvis.
Ektopisk Uttrykk av MIR-26a hemmet kreft i bukspyttkjertelen Vekst i Nude Mice
in vivo
tumorigenesis analysen viste at tumorvekst var betydelig tregere i nakne mus inokulert med PTM-transfekterte SW-1990 celler, sammenlignet med nakne mus inokulert med PT-transfekterte SW -1990 celler (fig. 5A). Dette resultatet ble bekreftet av tumorvolummålinger på 5 uker (Fig. 5B). Den cyclin E2 nivået var mye lavere i tumorvev overekspresjon MIR-26a og PCNA uttrykk fulgt et lignende mønster. Cyclin D2 forble uoppdaget i svulstene (figur 5C-5H.)
(A) Nude mus ble subkutant inokulert med SW-1990 celler transfektert med PTM (PTM: hTERT-MIR-26a plasmid). Eller PT ( pT: hTERT kontroll plasmid), i flankene. Bildet er representativt for tumorer dannet i 8 mus. (B) vekstkurver for tumorvolumer. Grafen er representativ for tumorvekst, 5 uker etter inokulering. Tumorvolumet ble beregnet, og alle data er vist som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 8). (C-H) Ekspresjon av cyclin D2, E2 cyclin, og PCNA ble målt ved immunhistokjemi i vevet hos mus inokulert med pTM- transfektert SW-1990 celler eller kontrollcellene. Figuren innfellinger i C, E og G indikerer en negativ kontrollfelt. Celler farget brun indikerer positiv farging. Original forstørrelse, 200 ×.
Diskusjoner
Den modne sekvens av MIR-26a er observert i 3
p
23, som er en skjør kromosomal regionen assosiert med forskjellige humane cancere [21] – [23]. Omtrent halvparten av alle menneskelige mirnas befinner seg i kreft-assosiert genomiske regioner; således kan de fungere som tumor-suppressor eller onkogene mirnas, avhengig av deres mål [3] – [5]. Således kan MIR-26a fungere som et onkogen i gliomer, men tjener som en tumor suppressor i leverkreft [12], [23] – [26]. Men til dags dato, det er begrenset rapporter om rollen og tumorigenesis av MIR-26a i bukspyttkjertelkreft.
I denne studien fant vi at uttrykket av MIR-26a var signifikant nedregulert i PDAC vev sammenlignet med at av ABPT. For ytterligere å utforske de molekylære mekanismene for cellevekst promotering av MIR-26a downregulation i kreft i bukspyttkjertelen vev, analyserte vi rollen som MIR-26a overekspresjon eller downexpression i bukspyttkjertelkreft celleproliferasjon, cellesyklus, og tumorvekst ,. Våre data viser at uttrykket nivået av MIR-26a påvirker spredning av tre PDAC cellelinjer av ulik-karakterer. MIR-26a nivåer var assosiert med G
1 arrest i kreft i bukspyttkjertelen celler. I tillegg MIR-26a overekspresjon i SW-1990 celler trykt bukspyttkjertelen tumorigenesis i nakne mus, noe som antydet at Mir-26a fungerer som en tumor suppressor i denne typen kreft.
Cyclin D2 og cyclin E2 er viktige regulatorer av G
en-til-S-fase overgang i løpet av cellesyklusen. Disse cykliner er av særlig interesse i bukspyttkjertelkreft. Kota [11] og Zhou [27] rapporterte at MIR-26a oppregulerer direkte ekspresjon av cyclin D2 og cyklin E2 mRNA i HCC. Dermed begge genene er mulige mål for Mir-26a i bukspyttkjertelkreft. På den annen side ble EZH2 nivåene økt i PDAC for å fremme celleproliferasjon og chemoresistance [20]. Derfor fant vi ut om MIR-26a kunne regulere bukspyttkjertelkreft cellesyklusen gjennom sine mål gener, cyclin D2 og cyclin E2. Cyclin D2 ble ikke påvist i kreftceller og kanal epitelceller ABPT, mens cyclin E2 var positivt korrelert med MIR-26a uttrykk i bukspyttkjertelkreft. Cyclin E2 redusert med MIR-26a oppregulering i CAPAN-2, SW-1990, og Panc-1 celler. Effektene observert på celleproliferasjon og cyclin E2 uttrykk var i samsvar med det som ble observert for EZH2 i PDAC celler. Disse data tyder på at MIR-26a nedregulering førte til oppregulering av cyclin E2 og EZH2, men ikke av cyclin D2, i PDAC vev. Dermed bidro downregulated MIR-26a til celleproliferasjon og dårlig overlevelse i bukspyttkjertelkreft. Disse resultater er konsistente med studier på andre tumorer, slik som HCC, brystkreft, NPC, og lymfomer [12], [27] – [30]. Den endrede ekspresjon av spesifikke mirnas i tumorer er angivelig forbundet med cancer metastase og dårlig prognose [29] – [32]. Heinzelmann et al., [33] oppdaget en miRNA signatur som skiller mellom metastatisk og ikke-metastatisk klarcellet nyrecellekarsinomer. En gruppe på 12 miRNAs, inkludert utleid-7 familie, MIR-30c, og MIR-26a, ble funnet å avta i svært aggressive primære metastatiske svulster.
