Abstract
Anterior Gradient Protein (AGR-2) er rapportert å være over-uttrykt i mange epiteliale kreftformer og fremmer metastasering. En entydig mekanisme for sin funksjon observert (e) har ikke tidligere blitt identifisert. Vi fant signifikant oppregulering av AGR-2 uttrykk i en beinmetastatisk prostatakreft cellelinje, PC3, etter dyrking i benmargen kondisjonerte medium. Betydelig AGR-2 uttrykk ble også bekreftet i prostata kreft vevsprøver fra pasienter med bein lesjoner. Ved å utvikle stabile kloner av PC3 celler med varierende grad av AGR-2 uttrykk, identifiserte vi at oppheving av AGR-2 betydelig redusert cellulær vedlegg til fibronectin, kollagen I, kollagen IV, laminin jeg og fibrinogen. Tap av cellulær adhesjon ble assosiert med kraftig nedgang i uttrykket av a4, a5, αV, P3 og p 4 inte. Unnlatelse av å gjennomgå apoptose etter løsrivelse er et kjennetegn på epitelial kreft metastasering. De AGR-to-forstummet PC3 celler viste høyere motstand mot Tumor nekrose faktor-relatert apoptose- induserende ligand (TRAIL) indusert apoptose
in vitro
. Denne observasjonen ble også støttet av signifikant redusert Caspase-3 ekspresjon i AGR-2-dempede PC3-celler, som er et nøkkel effektor av både ytre og indre død signalveier. Disse data tyder på at AGR-2 innflytelse prostatakreft metastase ved regulering av mobilnettet vedheft og apoptose
Citation. Chanda D, Lee JH, Sawant A, Hensel JA, Isayeva T, Reilly SD, et al. (2014) Anterior Gradient Protein-2 er en regulator av Cellular Adhesjon i prostatakreft. PLoS ONE 9 (2): e89940. doi: 10,1371 /journal.pone.0089940
Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 22 oktober 2013; Godkjent: 25 januar 2014; Publisert: 27 februar 2014
Copyright: © 2014 Chanda et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Finans støtte av National Institutes of Health gir R01 AR560948, R01 CA133737 og P30 AR046031 er takknemlig verdsatt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Raj Singh er en ansatt av Vivo Biosciences Inc. Det er ingen patenter, produkter i utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft har den høyeste insidensraten blant alle krefttilfeller hos menn i den industrialiserte verden og er det tredje ledende dødsårsak bak lunge og kolorektal kreft [1]. Patogenesen av prostata kreft og dens fortrinnsrett metastaser til bein og andre organer er regulert av gener, som fungerer samarbeide for å fremme hvert trinn i kreftutvikling og metastatisk kaskade [2] – [4]. Selv om forskjellige gen signaturer som styrer fasen av kreft progresjon er rapportert i brystkreft, blir en slik informasjon angående prostatacancer fortsatt mangler [5]. Identifisere rollen av nye molekyler av diagnostiske og terapeutiske betydning er fortsatt et stort fokus på nåværende kreftforskning. Ved genekspresjonsanalyser, observerte vi betydelig styrking av AGR-2 i PC3 prostatakreft cellelinje, spredning til bein, etter vedlikehold i normal benmarg-kondisjonert medium. AGR-2 ble først identifisert som XAG-2 i
Xenopus laevis
, som induserer differensiering av sement kjertel som bidrar til embryoene forbli festet til underlaget gjennom sekresjon av en mucinous stoff [6]. Pattedyr-homolog, AGR-2, er et protein-disulfid-isomerase (PDI), som inneholder en tio-redoxin domene og er ansvarlig for tarmslimproduksjon [7]. Mus som mangler AGR-2 er utsatt for å utvikle kolitt [7]. AGR-2 har trukket betydelig oppmerksomhet de senere årene for sin antatte rolle i neoplastisk progresjon og metastase [8] – [15]. AGR-2 er blitt funnet å være overuttrykt i forskjellige adenokarsinomer og har vært knyttet til dårlig overlevelse av pasienter med bryst og prostata-kreft [16], [17]. Få de siste rapportene har belyse de regulatoriske elementer av AGR-to-funksjonen, men dens spesifikke rolle (r) i tumorigenesis og progresjon til metastase mangler fortsatt [18] – [20]. I prostata cancer, er AGR-2 rapportert å være androgen induserbar og bare over-uttrykt i løpet av tidlig fase av carcinogenese [13], [21]. Tvert imot, også en fersk undersøkelse observert redusert AGR-2 uttrykk i høy klasse svulster, som falt sammen med metastatisk sykdom [13].
Denne studien benyttet AGR-2 genet Slå metode i beinmetastaserende menneskelig prostatakreft cellelinje PC3 å forstå dens biologiske funksjon i prostata kreft bein metastasering. Resultatene indikerte tap av AGR-2 i PC3-celler resulterte i signifikant reduksjon i tumor celleadhesjon, tap av ekspresjon av a4, α5, αV, P3 og ß4 integriner og utvikling av apoptose motstand, noe som tyder på rollen av AGR-2-in metastatisk kaskade av prostata kreft ved å påvirke svulst celle adhesjon og migrasjon.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
En osteolytic human prostatakreft cellelinje, PC3, ble kjøpt fra ATCC (Manassas , VA), og en klonal derivat av PC3 celler, uttrykker ildflue luciferase, var en generøs gave fra Dr. Kenneth J. Pienta (University of Michigan, Ann Arbor, Michigan). Begge cellelinjer ble holdt i RPMI-1640 medium (Mediatech Inc Hendron, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Mediatech Inc.) og penicillin /streptomycin (Mediatech Inc). Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og renset ved anvendelse av et QIAGEN mini-sett (Valencia, CA). cDNA microarray analyse ble utført ved Kreft Genomics delte ressurser på Winship Cancer Center of Emory University (Atlanta, Georgia) ved hjelp av en Illumina Beadstation 500 og data ble analysert ved JAVA Utforsker, Spotfire, Gene Cluster 3.0 og oppfinnsomhet pathway analyse. iScript cDNA syntese kit ble kjøpt fra Bio-Rad (Hercules, CA). AGR-2 primere (Forward 5′-TTGGGGTGACCAACTCATCT-3 «; Omvendt 5’GGACAAACTGCTCTGCCAAT-3») for RT-PCR-analyse ble utformet med Primer 3 (versjon 4.0) programvare og oligonukleotider ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). cDNA-prøver ble analysert i Bio-Rad iCycler (Hercules, CA). Tre-dimensjonal (3-D) PC3 perler for vekst i benmarg kondisjonert medium ble samlet etter en vekst på PC3-celler på hu-Biogel matriser og levert av Vivo Biosciences (Birmingham, AL). En Vybrant ® MTT Cell Proliferation Assay Kit ble kjøpt fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). 3-D Kultur Matrix ™ basalmembran ekstrakt ble kjøpt fra Cultrex (3445-00501, Gaithersburg, MD). En Cytoselect ™ 48-brønners celle adhesjon analysesettet ble kjøpt fra Cell Biolabs, Inc. (CBA-070, San Diego, California). Alle kits og reagenser ble brukt etter produsentens anvisninger.
Antistoffer
Mus og menneske monoklonale antistoffer, og polyklonale antistoffer for AGR-2 ble kjøpt fra Abcam Ltd (Cambridge, MA, og brukes på en fortynning av 1:1000 for immunoblotter og 1:500 for IHC). En inte antistoff sampler kit ble kjøpt fra Cell Signaling (4749S, Danvers, MA, og brukes ved en fortynning på 1:1000 for immunoblotter og 1:500 for IHC). Caspase-3, ble spaltet caspase-3 og beta-actin-antistoffer kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA, og anvendt i en fortynning på 1:500 for immunoblot). Sekundær immuno-deteksjon ble utført ved hjelp av geit-anti-rotte /mus /kanin IgG ABC kits kjøpt fra Vector Laboratories (Burlingame, California) og GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). For immunfluorescens sekundær deteksjon, ble geit-anti-rotte /mus /kanin IgG merket med Alexa-Fluor-594 kjøpt fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, 2 mikrogram /ml).
Menneske vevsprøver
Bone metastatisk prostatakreft vev ble hentet fra obduksjon ved University of Alabama i Birmingham i samsvar med godkjente Institutional Review board (IRB) protokoll. Formalinfiksert parafin innebygd vevsblokker hentet fra disse kildene ble seksjonert i 6 mikrometer. Alle vevsprøver ble anmeldt og preget av bord-sertifisert anatomiske patologer.
Isolering av Bone Marrow kondisjonerte Medium
Herre C57BL /6 mus ble ofret og både femur og tibia ble høstet og marg var spyles ut med steril serumfritt medium SIGMA Stemline (St Louis, MO, USA) under anvendelse av en 28,5 gauge nål festet til en 1 ml sprøyte i et 50 ml sterilt rør inneholdende 10 ml serumfritt medium Stemline. Benmarg klumper ble fjernet ved gjentatt føring gjennom en 16,5 gauge nål festet til en 10 ml sprøyte til en homogen enkelt cellesuspensjon blir oppnådd. Cellene blir pelletert via sentrifugering ved 1200 rpm, vasket tre ganger med serumfritt medium og til slutt resuspendert i 50 ml Stemline medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Cellene fortynnes videre med serum som inneholder Stemline medium til 100 ml og distribuert til fire 150 cm
2 cellekulturflasker (Corning Inc. Corning, NY) for vedlikehold i et fuktig kammer med 95% O
2 og 5% CO
2 forsyning. Etter to dager kulturmediet ble oppsamlet og sentrifugert ved høy hastighet for å kvitte seg med celler og rester. Supernatantene ble slått sammen og brukes direkte for kulturen i 3-D, PC3 perler.
Anleggs av rekombinant shRNA Vector og utvikling av enkeltcelle-avledet PC3 Clones med AGR-to knockdown
Twenty en-basepar målene ble utvalgt fra unike områder av AGR-2-kodende sekvensen ved hjelp av Tuschl et al., 1999 siRNA design retningslinjer [22]. Blant de testede shRNA-sekvensene, ble den som viste maksimal effekt anvendes i foreliggende studie, og bestod av 21-mer forstand (GACAAACACCTTTCTCCTGAT) og anti-sense tråder adskilt av en 9-bp region og inneholdt BamHI eller Hindlll restriksjonsseter, henholdsvis , for retnings kloning (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotidene ble hybridisert og ligert direkte inn i et pRNAT.U6 /Neo /GFP ekspresjonsplasmid (Genescript, Piscataway, NJ). En av de 21-mer sekvenser (CCTTGAGACTTGAAACCAGAA) som ikke klarte å slå AGR-2-ekspresjon ble anvendt som forsøks kontroll for å minimalisere eventuelle off-target effekt. PC3-celler ble dyrket i 6-brønns plater til omtrent 90% konfluens i antibiotika-fritt medium. Cellene ble deretter transfektert med AGR-2 shRNA uttrykker plasmider ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 24 timer ble transfeksjon mediet erstattet med fullstendig medium og etter ytterligere 24 timer, GFP-positive celler ble sortert strømning og opprettholdt i pre-standardiserte 600 ug /ml neomycin (10131, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Når neomycin-resistente celler utviklet, ble cellene trypsinisert og på nytt platet i 96-brønners kulturskåler ved en 1 celle /brønn frekvens, i duplikater. AGR-2 knockdown PC3 kloner (PC3
AGR-2SH) og kontrollcellekloner (PC3
Kontroll) ble valgt etter å ha testet for AGR-2 uttrykk via western blotting og immunfluorescens analyser.
sTRAIL- indusert apoptose Analyser
Rekombinant human TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) ble kjøpt fra EMD Millipore Corporation, Temecula, CA. PC3
Kontroll og PC3
AGR-2SH celler ble behandlet med 0, 12,5, 25, 50 og 100 ng /ml konsentrasjon av TRAIL. Celleviabilitet ble bestemt etter 12 timer og 72 timer med propidiumjodidfarging (BD Biosciences) og MTT Cell Proliferation Assay Kit hhv. Behandlede celler ble også høstet etter 0 timer, 1 time, 3 timer og 6 timer etter celle skraping, ble cellepelletene ble vasket to ganger med iskald PBS og underkastet Western blotting for påvisning av caspase 3 og aktive spaltes caspase-3-peptider.
Western blotting
Cellene ble trypsinert, vasket og resuspendert i lyseringsbuffer protein før de blir fryse-tint en gang ved -80 ° C. Proteiner ble denaturert tilsetning av SDS-PAGE-buffer inneholdende β-merkaptoetanol og inkubering ved 95 ° C i 5 min. Genomisk DNA ble skåret av ultra-sonikering. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av Lowry-metoden (Biorad, Hercules, CA). Proteiner ble separert i enten 10 eller 15% polyakrylamid-gel og overført til nitrocellulosemembran. Membranen ble inkubert i 1 time i 2% ikke-fett tørrmelk i TBST for å blokkere ikke-spesifikke primære antistoff-binding. Membranen ble deretter inkubert over natten med passende fortynnet primære antistoffer i TBST-buffer. Beta-aktin-antistoff ble benyttet som kontroll lasting. Etter en 3 ganger vask i TBST, ble membranen inkubert i geite-anti-muse /kanin-IgG konjugert til pepperrotperoksidase (1:5000, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i 30 min. Membranen ble vasket igjen i TBST og utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence reagens (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Piscataway, NJ) og avbildes på en Fuji LAS-3000 chemiluminescence utvikler.
immunfluorescens
begge PC3
kontroll- og PC3
AGR-2SH-celler ble dyrket i kultur inntil 50% konfluens i kamret slides, vasket grundig i PBS og fiksert i iskald 3,7% paraformaldehyd i PBS inneholdende 0,1% Triton-X-100 , i 20 minutter, ved romtemperatur. Cellene ble vasket grundig og inkubert over natten ved 4 ° C i rotte monoklonale human AGR-2-antistoff. Etter PBS-vask ble cellene inkubert med Alexa-fluor-594-merket anti-rotte-IgG (Molecular Probes, Eugene, OR), i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble vasket og kjerner ble farvet med DAPI for kontrast. De fluoriserende merkede celler ble montert ved hjelp Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) og sett i et Leica DMRB fluorescens mikroskop.
Histomorfometri og Immunohistochemistry
Myke vev ble fiksert i 10% nøytral bufret formalinløsning i 48 timer før innebygging i parafin for histologisk analyse. Bein vev ble avkalkes i 0,5 mol /l EDTA i Ca
2 + – og Mg
2 + -fri Dulbeccos PBS (Cellgro) før innstøping i parafin. Seks um langsgående seriesnitt ble skåret fra femur og tibia og farget med hematoksylin og eosin (H E) for å bestemme egenskapene til tumorvekst i benet. For immunhistokjemi, ble 6 mikrometer parafinsnitt deparaffinized i xylen, og hydrert gjennom gradert-alkohol. Antigen gjenfinning ble utført i citratbuffer, pH 6,0, i henhold til damp i 20 min. Snittene ble avkjølt til romtemperatur og endogen peroksidase ble fjernet ved anvendelse av 0,3% H
2o
2 i metanol i 30 min og blokkert med 3% normalt geiteserum i 30 min. Vevssnitt ble deretter inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Snittene ble vasket i PBST og igjen inkubert ved romtemperatur (RT) med biotin-konjugert geite-anti-kanin /anti-rotte sekundært antistoff i 2 timer. Etter vasking ble snittene inkubert med streptavidin-konjugert pepperrotperoksidase i 1 time ved romtemperatur. Etter nok en vask med PBST, ble immundeteksjon utføres ved hjelp av DAB-H
2o
2 (Vector Labs, Burlingame, California) og kontra med hematoksylin der dette er aktuelt.
Migrasjon Analyser
migrerings~~POS=TRUNC analyser ble utført ved en «sårlukking» -metoden og ved hjelp av Boyden kammer analysen. I den til lukking av sår analysen ble AGR-2-dempede PC3-celler og kontroll-PC3-celler sådd ut på 10
5 per brønn i en seks-brønns plate. Ved å nå 90% konfluens, ble cellene serum sultet over natten. Friskt medium ble tilsatt til cellene, og sårene ble laget ved hjelp av en steril 200 mL pipettespissen. Fotografier av den til lukking av sår ble tatt ved 0 timer og 22 timer for å sammenligne forskjellen i hastigheten for sårheling mellom AGR-2-taushet og kontroll PC3 cellelinjer. En Boyden kammeret migrasjon analysen ble utført ved å plate 4 × 10
4 PC3
kontroll og PC3
AGR-2SH celler per brønn på en cellekultur innsatsen (8 mikrometer porestørrelse, 24-brønners format; Becton Dickinson Labware) i serumfritt medium i tre eksemplarer. For å initiere overføringen 10% FBS ble anvendt som en chemo-tiltrekningsmiddel i det nedre kammer. Celler ble inkubert i 6 timer ved 37 ° C og fjernet fra det øvre kammer ved hjelp av en bomullspinne. Celler på undersiden av kammeret ble visualisert under et fluorescensmikroskop og telles ved hjelp av Image J programvare. Effekten av AGR-2 lyddemping på PC3 cellemigrasjon ble presentert som relative verdier i forhold til kontroll (100%).
Statistical Analysis
Data ble analysert ved Student
t
-test. Verdiene som er oppgitt er de Mean ± SEM og forskjellene ble betraktet som signifikant hvis p. 0,05
Resultater
AGR-2 Expression økes i metastatisk prostata kreft celler i nærvær av Betinget mikromiljøet i benmargen
Bone metastase er et kjennetegn på prostatakreft formidling, som tilbyr en ideell setting for å studere metastasering av slike kreftceller innenfor mikromiljøet og spesielt de molekylære signaler som fremmer deres overlevelse i metastatisk nisje. For å klargjøre om svar på slike signaler i mikromiljøet endrer AGR-2-ekspresjon i prostatakreftceller, ble PC3-celler dyrket i 3-dimensjonale sfæroidene og opprettholdes i 3 dager i benmarg-kondisjonert medium. Total RNA ble isolert fra disse cellene og utsatt for cDNA microarray analyse (figur 1A), som senere ble bekreftet av sanntids kvantitativ RT-PCR (Gene Expression Omnibus, GEO tiltredelse # GSE38714; NCBI sporingssystem # 16589736). AGR-2 ble overuttrykt signifikant (p 0,05) sammenlignet med PC3-celler dyrket i vanlig medium (figur 1B), noe som tyder på AGR-2 kan være nødvendig for innledende bearbeidelse av metastatiske tumorceller til den nye mikromiljøet. AGR-2 uttrykk ble også bestemt i beinmetastatisk prostatakreft vevsprøve. Intense AGR-2-ekspresjon ble påvist, noe som tyder på kravet om AGR-2 for etablering av benmetastase (figur 1C).
A. cDNA microarray varme kart som viser høyere AGR-2 uttrykk (rød) i PC3 celler dyrket i benmargen kondisjonert medium i forhold til vanlig medium (grønn). B. Sanntids RT-PCR-data som viser en signifikant (p 0,05) økning i AGR-2-ekspresjon i PC3-celler etter vekst i normal benmarg kondisjonert medium (BMCM) i forhold til når dyrket i vanlig medium (RM). C. Immunhistokjemisk analyse som viser intens AGR-2 farging i den menneskelige prostata kreft celler spredning til bein (Original Forstørrelse 400x).
Fastsettelse av AGR-2 mRNA uttrykk på ulike Prostate Cancer Cell Lines
Relativ AGR-2-mRNA-ekspresjon ble bestemt i beinmetastatisk PC3, LnCap og C4-2B humane prostatacancercellelinjer og hjernemetastatisk Du145 prostatakreft-cellelinje ved RT-PCR. Resultatene indikerer signifikant høyere AGR-2-ekspresjon i PC3, LnCap og C4-2B cellelinjer sammenlignet med Du145 cellelinje, hvilket antyder viktigheten av AGR-2 i prostatacancer benmetastase (figur 2A).
A. AGR-2-nivåer ble bestemt ved RT_PCR analyse i forskjellige humane prostatacancercellelinjer. Den beinmetastatiske PC3 celler har den høyeste AGR-2 mRNA uttrykk, mens hjernemetastatiske Du145 celler har minst mulig AGR-2 uttrykk. B. Utvikling av AGR-2 forstummet PC3 celler. Western blot-analyse som viser betydelig nedregulering av AGR-2-protein følgende stabil innføring av shRNA konstruksjon målretting AGR-2 i PC3-celler. beta-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. C. Immunofluorescensanalyse sammenligne AGR-2 uttrykk i AGR-2 forstummet PC3 celler versus kontroll PC3 celler (Original forstørrelse 400X).
Fastsettelse av AGR-2 Expression i PC3
Kontroll og PC3
AGR-2SH cellelinjer
Mengde AGR-2 genet Slå i PC3
Kontroll og PC3
AGR-2SH celler ble evaluert ved Western blotting (figur 2B) og immunfluorescens farging (figur 2C ). Over nitti prosent nedregulering av AGR-2 uttrykk ble oppnådd i PC3
AGR-2SH celler sammenlignet med PC3
Kontrollceller.
Endrede Vekst Kjennetegn på PC3 celler etter AGR-2 genet Slå
Når PC3 celler med varierende grad av AGR-2 uttrykk ble analysert
in vitro
, var det ingen signifikant forskjell i spredning priser mellom PC3
AGR-2SH og PC3
Kontroll -cellelinjer (figur 3A). Men i monolag-kulturer, PC3
Kontrollceller som syntes å være fibroblast-lignende og godt festet til plastoverflaten. Cellene ble løst forbundet med hverandre og bare via pseudopodiekrave utvidelser. Den PC3
AGR-2SH celler på den annen side opprettholdt mer epitelial fenotype med avrundet eller cuboidal morfologi og dannet en brostein som utseende når sammenflytende. I motsetning til de PC3
Kontrollceller, PC3
AGR-2SH-celler syntes å være løst festet til plastoverflaten (figur 3B).
A. MTT celleproliferasjonsanalyse viser tilsvarende vekstrater i PC3
kontroll og PC3
AGR2sh celler. B. PC3
kontrollcellene (ovenfor) viser en fibroblast-lignende utseende med pseudopodia lignende forlengelse for celle-celle kontakter. PC3
AGR2sh celler (nedenfor) viste en mer epitelial celle-lignende, avrundet fenotype. Disse cellene ble også løst festet til kulturskåler sammenlignet med kontrollceller. Den grønne fluorescens i de høyre panel viser både PC3
kontroll og PC3
AGR2sh celler konstitutivt uttrykte GFP på grunn av tilstedeværelsen av GFP uttrykke kassetten i vektorene som brukes til å opprette kontroll og AGR-2-dempede PC3 cellelinjer.
AGR-2 Fremmer Cellular Heft
Når PC3
Kontroll og PC3
AGR-2SH celler ble sammenlignet for deres evne til å binde seg til ulike ekstracellulære matriks (ECM) proteiner, inkludert fibronektin, kollagen i, collagen IV, laminin og fibrinogen benytte en celle adhesjon analysesett, indikerte resultatene signifikant reduksjon i evnen til PC3
AGR-2SH-celler til å forbli festet til alle komponentene i ECM testet. PC3
AGR-2SH adhesjon til fibronektin er maksimalt redusert (70%) blant andre ECM-proteiner, noe som indikerer AGR-2 påvirkninger reaksjonsvei (er) som fremmer cellulær adhesjon (figur 4A).
A. Vedheft av PC3
kontroll og PC3
AGR2sh celler ble evaluert etter vekst i kulturskåler belagt med ulike ECM proteiner. Først ble cellene sådd ut i duplikat på de belagte substrater og lov til å følge. Deretter ble ikke-bundne cellene vasket vekk, og de adherente celler ble fiksert og farget. Til slutt ble flekken ekstrahert og kvantifisert kolorimetrisk. Betydelig reduksjon i cellulær adhesjon til fibronektin (*** p 0,001), kollagen I (** p 0,01), kollagen IV (*** p 0,001), laminin (* p 0,05) og fibrinogen (* p 0,05) ble observert i tilfelle av PC3
AGR2sh celler når sammenlignet med PC3
kontrollceller. BSA-belagte brønner ble benyttet som reagens kontroll (p 0,1). Data presentert her er gjennomsnitt ± SEM. B. Betydelig nedregulering av a4, a5, αV, P3 og ß4 griner ble observert i PC3
AGR2sh celler sammenlignet med PC3
kontrollceller. Det ble ikke observert forskjell i ß1 integrin nivåer mellom de to celletyper. Beta-aktin ble benyttet som kontroll lasting. Flere proteinbåndene som finnes i blotter inkluderer inte forløper og modne proteiner samt spaltede produkter forventes molekylvekt i henhold til produsentens informasjon (Cell Signaling Technology, Cat # 4749S).
Tap av Inte Expression in PC3 celler som mangler AGR-2
integrin heterodimerer i ulike kombinasjoner er kjent for å formidle cellulær adhesjon til ECM og spiller en viktig rolle i tumorvekst og metastase [23]. For å avgjøre om modulasjoner av AGR-2 nivåer under tumorvekst og metastasering er assosiert med endrede integrin nivåer og funksjon, bestemt vi uttrykk for et panel av inte (a4, a5, αV, B 1, P3, p 4, B5 inte) i PC3
AGR-2SH og PC3
Kontroll celler ved Western blotting. Betydelig redusert uttrykk for a4, a5, αV, P3 og p 4 griner ble observert i PC3
AGR-2SH celler. Sammenlignbare mengder av ß1 intenivåer ble observert i begge cellelinjene mens ingen β5 integrin ble påvist i noen av cellelinjen. Disse dataene antyder sterkt en rolle for AGR-2 i regulering cellular heft via inte uttrykk. (Figur 4B).
Redusert av Tumor Cell Migrasjon i AGR-to-forstummet PC3 celler
For å finne ut om redusert celle adhesjon og inte uttrykk i AGR-to-forstummet PC3 celler påvirkes PC3 celle migrasjon, både en «sårlukking» analysen, så vel som et Boyden kammer migrering analysen ble utført. Resultatene indikerte signifikant redusert (p 0,01) tumorcellemigrering i AGR-2-dempede PC3-celler når sammenlignet med kontroll PC3-celler. Begge disse analysene også tyder på mobilnettet vedheft via inte uttrykk er avgjørende for svulst celle migrasjon (Figur 5 A B).
Høy AGR-2 uttrykker PC3
kontrollceller og lav AGR-2 uttrykker PC3
AGR-2SH-celler ble dyrket i 6 brønners dyrkningsskål opp til 90% konfluens. De ble serumsultede for natten og lov til å migrere etter etableringen av såret med en 200 mL pipette og legge nytt komplett medium. Fotografier ble tatt ved 0 timer og 22 timer for bestemmelse av hastighet for sårheling mellom de to cellelinjer. B. Boyden kammer Analyse: PC3
kontrollcellene og PC3
AGR-2SH-celler ble sådd ut på celledyrkningsinnsatser i serumfritt medium og migrering av celler ble stimulert tilsetning av 10% FBS som kjemoattraktant i bunnkammeret. Etter 6 timers inkubasjon ble celler fjernet fra toppen av innsatsen ved hjelp av en bomullspinne og cellene på undersiden av innsatsen ble fotografert og tellet. Effekten av AGR-2 lyddemping på PC3 cellemigrasjon er presentert her som relative verdier i forhold til kontroll (100%).
Utvikling av TRAIL Resistance i PC3
AGR-2SH Cells
Tidligere forsøk indikerte AGR-to-forstummet PC3 celler viste redusert celle adhesjon, inte uttrykk og migrasjon. Normale epitelceller gjennomgå apoptose etter løsgjøring fra den basalmembran (anoikis), mens anoikis motstand er et av kjennetegnene på ondartede kreftceller. For å finne ut om AGR-2 Slå har bidratt til mottakelighet for anoikis, både PC3
Kontroll og PC3
AGR-2SH celler ble dyrket
in vitro
i 72 timer i nærvær av 0, 12,5, 25, 50 og 100 ng /ml rekombinant humant løselig (e) TRAIL-protein. Resultatet av forsøket ble analysert ved cellenes levedyktighet assay ved å bruke en MTS-celleproliferasjonsanalyse sensoren ved å følge TRAIL behandling. Selv celledød ble observert i begge PC3
Kontrollceller og PC3
AGR-2SH celler, PC3
AGR-2SH cellene overlevde TRAIL utfordringen betydelig bedre enn de PC3
Kontrollceller (Figur 6A) tyder tap av AGR-2 kan være forbundet med utvikling av resistens anoikis i maligne tumorceller. Celleviabilitet følgende sTRAIL utfordring ble også bestemt ved farging av cellene med propidiumjodid (PI). PC3
Kontroll og PC3
AGR-2SH-celler ble dyrket
in vitro
i 12 timer i nærvær av 0 ng /ml og 100 ng /ml konsentrasjon av sTRAIL etterfulgt av PI farging. Fase kontrast, fluorescerende og overlappende bildene ble tatt med en Leica DMI 4000B mikroskop og analysert med bilde J programvare. Både levende og døde celler ble tellet og ikke-levedyktige celler (PI positiv) ble representert som prosentandel av totalt antall celler. Resultatene viste signifikant høyere PI-positive celler (p 0,05) i PC3
Kontrollceller i forhold til PC3
AGR-2SH-celler (Figur 6 B p 0,02 av Fishers Exact Test) mellom AGR -2 og Caspase-3 antyder en tendens til co-forekomst av disse to molekyler [26].
A. PC3
kontroll og PC3
AGR2sh celler ble behandlet
in vitro
med ulike konsentrasjoner av sTRAIL. Celleviabilitet ble testet etter 72 timer ved hjelp av en celle levedyktighet analysen kit. Betydelig høyere celledød (p 0,001) ble observert i PC3
kontrollceller sammenlignet med PC3
AGR2sh celler. B. Celleviabilitet følgende sTRAIL utfordring ble også bestemt mellom PC3
kontroll og PC3
AGR2sh celler ved PI farging og ser etter fluorescens mikroskop (Original forstørrelse 200X). C. Flere fotografier ble tatt for hver cellelinje følgende sTRAIL behandling og PI farging. Både live og døde celler ble manuelt telles ved hjelp av Image J programvare og grafisk plottet. D. Western blot analyse viser caspase-3 og kløyvde caspase-3 nivåer i ikke-indusert og TRAIL-indusert kontroll og AGR-to-forstummet PC3 celler.
Diskusjon
Prostatakreft metastasizes til bein og produserer osteoblastiske /osteolytiske lesjoner, som forårsaker alvorlig skjelettsmerter, mottakelighet for brudd og ryggmargskompresjon [27]. Bone metastatisk kreft er uhelbredelig og fører til betydelig sykelighet og dødelighet hos disse pasientene. Adhesjon av ekspandert, sirkulerende kreftceller i benmarg ECM-proteiner er det viktigste trinnet som er nødvendig for etablering av benmetastase [28]. I vår microarray studien betydelig oppregulering av AGR-2 mRNA uttrykket etter vedlikehold i benmargen kondisjonert medium antyder en rolle AGR-2 til rette for vekst av prostata kreft celler i beinet mikromiljøet.
