Abstract
Bakgrunn
Forskjellig denaturert regioner (DMRs) er forbundet med mange trykt gener. Hos mus metylering ved en DMR oppstrøms for
H19
-genet er kjent som forlaget kontrollområdet (IC1) er ervervet i hann germline og påvirker metylering status av DMRs 100 kb bort i tilstøtende Insulin-lignende vekstfaktor 2 (
Igf2)
gen gjennom langtrekkende interaksjoner. Hos mennesker kimcellelinje-avledet eller post-zygotically kjøpt imprinting defekter på IC1 er assosiert med avvikende aktivering eller undertrykkelse av
IGF2
, noe som resulterer i medfødte vekstforstyrrelser Beckwith-Wiedemann (BWS) og Silver-Russell (SRS) syndromer, respektivt. I Wilms tumor og tykktarmskreft, biallelic uttrykk for
IGF2
har blitt observert i forbindelse med tap av metylering på en DMR i
IGF2.
Dette DMR, kjent som DMR0, har vist seg å være denaturert på den tause mors
IGF2
allele antagelig med en rolle i undertrykkelse. Effekten av
IGF2
DMR0 metylering endringer i etiologi av BWS eller SRS er ukjent.
metodikk /Principal Funn
Vi analyserte metylering status for DMR0 i BWS, SRS og Wilms tumor pasienter ved konvensjonell bisulfitt sekvensering og pyrosekvensering. Vi viser her at i motsetning til tidligere rapporter,
IGF2
DMR0 faktisk denaturert på den aktive fars allelet i perifert blod og nyre. Dette ligner på IC1 metylering status og er uforenlig med den foreslåtte stanse funksjon av morens
IGF2
allel. Beckwith-Wiedemann og Silver-Russell pasienter med IC1 metylering defekter har lignende metylering defekter på
IGF2
DMR0, i samsvar med IC1 regulere metylering på
IGF2
i
cis
. I Wilms tumor, men metylering profiler av IC1 og
IGF2
DMR0 indikerer metylering endringene som skjer på begge foreldre alleler i stedet for i
cis
.
Konklusjon /Betydning
Disse resultatene støtter en modell der DMR0 og IC1 har motsatt mottakelighet til global hyper og hypometylering under tumorigenesis uavhengig av den overordnede opprinnelses forlag. I motsetning til under embryogenese DMR0 er denaturert eller demetylert henhold til kimcellelinje metylering avtrykk på IC1, noe som indikerer ulike mekanismer for imprinting tap i neoplastiske og ikke-neoplastiske celler
Citation. Murrell A, Ito Y, Verde G , Huddleston J, Woodfine K, Silengo MC, et al. (2008) Tydelig metylering Forandringer på
IGF2-H19
Locus i Medfødte vekstforstyrrelser og kreft. PLoS ONE tre (3): e1849. doi: 10,1371 /journal.pone.0001849
Redaktør: Suzannah Rutherford, Fred Hutchinson Cancer Research Center, USA
mottatt: 14 desember 2007; Godkjent: 19 februar 2008; Publisert: 26 mars 2008
Copyright: © 2008 Murrell et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CRUK Senior Cancer Research Fellowship (AM) og Società Italiana di Cancerologia og Fondazione Pezcoller fellesskap (FC) og tilskudd fra AICR (AM), MIUR PRIN 2005 (AR), Istituto Superiore di Sanita (AR), Associazione Italiana Ricerca sul cancro (AR og DP), TV-aksjonen-Italia Grant No. GGP04072 (AR), og Associazione Bianca Garavaglia, Busto Arsizio, Varese, Italia (DP)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Aberrant imprinting av Insulin-lignende vekstfaktor 2 (
IGF2
) genet spiller en rolle i patogenesen av overvekst lidelse Beckwith-Wiedemann syndrom (BWS, OMIM # 130650), veksten-begrensning tilstand Silver-Russell syndrom (SRS, OMIM # 180860), samt ulike kreft hos mennesker, inkludert Wilms tumor, rhabdomyosarkom, hepatoblastoma, kolorektal og brystcarsinomer [1] – [6] .
Mus modeller har blitt brukt til å vise at trykt uttrykk for nært knyttet
Igf2 Hotell og
H19
gener styres av bestemte ulikt denaturert regioner (DMRs) [7 ] – [10]. En av disse DMRs (
H19
DMR) ligger 5 «av
H19
promoter er denaturert på fars kromosom og er kjent som imprinting kontrollområdet IC1 fordi den fungerer som en isolator mediert av CCCTC bindingsfaktor (CTCF) [11] – [14]. Sletting av mors IC1 resulterer i aktivering av normalt stille mors
Igf2
allel og nedregulering av
H19 product: [9]. I tillegg finnes et hierarkisk forhold mellom metylering ved IC1 og
Igf2
slik at sletting eller mutasjon i IC1 resulterer også i metylering endringer i DMRs i
Igf2
genet [15]. Vi har tidligere vist at IC1 faktisk samhandler med
Igf2
DMRs i et gjensidig utelukkende og foreldre opprinnelses bestemt måte påvirket av CTCF bindende og DNA metylering [16], [17]. Anvendelsen av denne modellen til den menneskelige har vært hemmet av forskjeller i organiseringen av genomet hos
IGF2
DMRs i mus og menneske. Spesielt
IGF2
DMR0, som ligger 5 «til hoved
IGF2
arrangører er denaturert på mors allel bare i placentas i mus [18], men har differensial metylering i alle vev hos mennesker [19]. Metylering av DMR0 på mors
IGF2
allel ble utledes ved hjelp av cellelinjer avledet fra en BWS pasient med faderlig uniparental disomy på 11p15.5 loci (UPD) [19] og i Wilms tumor nyrepasienter med tap av heterozygositet av morens allel [20]. Metylering analyse av
IGF2
DMR0 er blitt utført i mange kreftstudier etter den demonstrasjon at hypometylering av denne DMR er forbundet med tap av prege i Wilms tumor [20] og tykktarmskreft [21]. Den nåværende tolkning av disse resultatene er at tap av metylering på
IGF2
DMR0 spiller en rolle i reaktivering av taus mors allel [21].
Den molekylære grunnlaget for BWS er heterogen med 5 % av pasienter som viser gevinst på metylering ved IC1 med biallelic aktivering av
IGF2 Hotell og biallelic stanse av
H19.
en annen gruppe BWS pasienter har normal IC1 metylering men unormal metylering på IC2, en moderlig metylert imprinting kontrollregionen i
KCNQ1 Hotell og
KCNQ1OT1
genet klynge som synes å operere uavhengig av
IGF2 Hotell og
H19 product: [2]. BWS pasienter med IC1 defekter har en spesielt høy predisposisjon for utvikling av Wilms tumor, mens de pasienter med IC2 defekter er åpenbart mer utsatt for andre tumorer [2], [22]. Hypermethylation på IC1 er også en hyppig funksjon i ikke-syndrom Wilms tumorpasienter som sammen med de forskjellige tumor predisposisjon profiler i BWS pasienter som tyder på at lignende epigenetiske feil føre til soma-bred overvekst og kreft. SRS har også en kompleks heterogen molekylær etiologi og en undergruppe av personer har tap av metylering ved IC1 med biallelic stanse av
IGF2 Hotell og biallelic aktivering av
H19 product: [6].
til dags dato har det ikke vært noen rapporter om metylering status for
IGF2
DMR0 region i BWS og SRS pasienter, og det er ikke kjent i hvilken grad den foreslåtte stanse funksjonen til dette DMR bidrar til etiologi av BWS og SRS. Vi undersøkte derfor foreldre opprinnelses metylering ved DMR0 i ulike undergrupper av BWS og SRS pasienter og også i en kohort av Wilms tumorprøver. Våre resultater tyder på at den aktive faderlig
IGF2
allelet er denaturert ved DMR0 i
cis
med
H19
metylering i normale individer og som i SRS og BWS den DMR0 og IC1 har lignende metylering unormalt. I motsetning til dette, i Wilms tumorprøver DMR0 metylering er negativt korrelert med IC1 metylering. Disse resultatene antyder
IGF2
imprinting defekter i medfødte vekstforstyrrelser og Wilms tumor oppstår gjennom ulike epigenetiske mekanismer.
Resultater
IGF2 DMR0 metylering status i BWS og SRS pasienter
Vi undersøkte metylering status av DMR0 i perifert blod leukocytter DNA avledet fra BWS pasienter med IC1 hypermethylation (n = 7), IC2 hypometylering (n = 37) eller normal metylering ved både IC1 og IC2 (n = 27) og SRS pasienter med IC1 hypometylering (n = 2), ved hjelp av bisulfitt og pyrosekvensering analyse. Regionen analyserte er vist i figur 1A. Til vår overraskelse, 6/7 BWS pasienter med hypermethylation på IC1 hadde også hypermethylation på DMR0 (Median metylering 69,2%, interkvartilt område (IQR) 60,5%, 75,1%) og 2/2 SRS med IC1 hypometylering hadde også DMR0 hypometylering (28,2% og 36,28%). Pasienter med normal metylering ved IC1 eller hypometylering på IC2 hadde normale metylering nivåer på DMR0 (Median metylering 53%, IQR 48,2%, 57,1%). Disse resultatene tyder på at enten metylering endringer i BWS og SRS ble forekommer hos
trans
eller at metylering ved DMR0 er på fars allel.
A. Plassering av DMR0 i
IGF2
genet i forhold til faderlig metylert imprinting kontroll region IC1 som er oppstrøms
H19.
Pyrosekvensering ble brukt til å analysere metylering på seks CPGs innenfor DMR0 regionen (NCBI 36 : 11, 2125904-2126160, inneholder SNP rs3741210). Bisulfitt (BSQ) og pyrosekvensering (PSQ) primer stillinger er som angitt. Denne regionen inneholder CPGs (nummerert 15,16,17) som er merket med grått som tidligere har vært publisert som skal hypomethylated i endetarmskreft [21]. Vertikale linjer indikerer
Msp
I /
Hpa
II områder i DMR0. B. boksplott som viser medianverdier, IQR, maks. og min. verdier for
IGF2
DMR0 metylering nivåer målt ved pyrosekvensering av bisulfitt konverterte DNA hentet fra perifere blodprøver fra BWS og SRS pasienter. Metylering prosenter reflektere andelen av bisulfitt-konverterte cytosines på CPGs målt i analysen. Normale metylering nivåer for trykt DMRs er 45-55% (se C). Kategorier av BWS pasienter inkludert de med: ingen imprinting defekt på IC1 regionen og IC2 regionen (NM); lav metylering (LM) ved IC2 (IC2-LM); økt fars 11p15 gjennom fars duplisering eller uniparental disomy (pUPD); og hypermethylation på IC1 (IC1-HM). SRS pasienter inkludert to hver av mors duplisering av 11p15 (Matt Dup) og hypometylering på IC1 (IC1-LM). BWS med hypermethylation på IC1, har også hypermethylation på DMR0, mens SRS med hypometylering IC1 har hypometylering på DMR0. C. Parent opprinnelses bestemt metylering i normal, BWS og SRS pasienter. De BWS og SRS pasienter har imprinting defekter på IC1. Bisulfitt omdannes DNA ble forsterket med allel-spesifikke primere for rs3741210 polymorfisme i
IGF2
DMR0 før pyrosekvensering for metylering. T-allelet er vist med torg og C alleler vist ved trekanter i tomter. Circles viser prosentandelen av total metylering av CPGs analysert. Fedre allelet er mer denaturert ved DMR0 enn mors allelet. Begge alleler er hypermethylated i BWS og begge alleler er hypomethylated i SRS.
For å skille mellom disse mulighetene, undersøkte vi 13 BWS pasienter med overflødige kopier av faderlig 11p15.5 (12 pasienter hadde faderlig UPD og en pasienten hadde en 11p15.5 duplisering) og to SRS pasienter med mors 11p15.5 duplikasjoner. Vi har også bestemt direkte foreldre opprinnelsen metylering på
IGF2
DMR0 i noen av våre BWS og SRS pasienter og 6 kontrollpersoner for å bekrefte våre funn. Pasientene med maternal duplisering hadde redusert metylering nivåer (44%), mens alle fars UPD og fars duplisering pasientene hadde hypermethylation ((Median metylering 60,2%, IQR 56,1%, 64,3%), figur 1B.). I alle informative familier var vi i stand til å bekrefte at fars allelet ble fortrinnsvis metylert ved DMR0 (spesielt CPGs 15-17) i
cis
med metylering ved IC1 (Fig. 1C og S1 fig.). Disse resultatene tyder derfor på at metylering ved IC1 påvirkninger metylering på
IGF2
DMR0. BWS og SRS tilfeller med metylering defekter på IC1 erverve samme metylering mangelen på DMR0 i germline eller tidlig fosterutvikling slik at mors
IGF2
allel gevinster metylering og er aktivert (BWS) eller fars allelet svikter å bli metylert og er brakt til taushet (SRS). Disse allel-spesifikk metylering endringene har effekt av et avtrykk bryter slik at begge allelene ser ut som enten en faderlig allel (BWS) eller en mors allel (SRS). Pyrosekvensering resultatene ble bekreftet av bisulfitt sekvensering (fig. S1).
IGF2 metylering analyse i Wilms Tumor prøver
Vi analyserte DMR0 metylering i to Wilms svulst pasienter som hadde oppstått i personer som berøres av BWS og en serie av ikke-syndrom Wilms tumorpasienter. En av BWS pasientene hadde konstitusjonell hypermethylation på IC1, den andre hadde faderlig UPD. De ikke-syndrom Wilms svulst pasienter består av individer som hadde tumor-spesifikke IC1 hypermethylation (n = 10), 11p15.5 LOH med tap av morens allel (n = 13) eller normal metylering (n = 10) ved IC1. Bemerkelsesverdig, alle svulster med hypermethylation på IC1 og de fleste av dem med LOH, inkludert de oppstått i personer som berøres av BWS, viste redusert metylering ved DMR0 (Median metylering 24,8%, IQR 16,52, 34,9), mens de med normal IC1 metylering hadde normal DMR0 metylering (Median metylering 45,1%, IQR 34,2; 52,3) (fig 2A-B.). Faktisk kan en signifikant invers korrelasjon (Pearson r = 0,7118, CI -8718 til 0,4146) bli vist mellom DMR0 og IC1 metylering nivåer i Wilms tumor pasient (Fig. 2C). Som i blodleukocytter, tilstøtende ikke tumorvev viste overveiende metylering av fars allelet (fig. 2D og data ikke vist). Disse resultatene viser tydelige epigenetiske forandringer i Wilms tumor i forhold til medfødte vekstforstyrrelser.
boksplott som viser medianverdier, IQR, maks. og min. verdier for
IGF2
DMR0 metylering nivåer målt ved pyrosekvensering av perifert blod (åpen boks), normal nyre (skravert boks) og tumor biopsier (grå boks) fra Wilms Tumor pasienter som ikke har BWS. Metylering prosenter reflektere andelen av bisulfitt-konverterte cytosines på CPGs målt i analysen. Normale metylering nivåer for trykt DMRs er 45-55% (se D). Wilms «tumor pasientprøver inkluderer perifert blod og tumor-DNA fra pasienter med normal metylering ved IC1 i deres tumorer (NM); perifert blod, normal nyre og tumor DNA-prøver fra pasienter med hypometylering av IC1 i sine tumorer (IC1-HM); og tumor-DNA-prøver fra pasienter med tap av heterozygositet (LOH) i deres tumorer. Påfallende, Wilms Tumor pasienter med hypermethylation på IC1 har hypometylering på DMR0 i sine svulster. B metylering nivåer i perifert blod, upåvirket nyrevevet og Wilms tumor nyrevevet fra to BWS pasienter (en med IC1 hypermethylation og ett med pUPD). Begge pasientene har hypometylering av
IGF2
DMR0 i sine svulster. C Lineær regresjon kurven viser inverse forholdet mellom metylering nivåer på IC1 og DMR0 i Wilms «tumor. Svulster med hypermethylation på IC1 har tap av metylering ved DMR0. D. Perifert blod og nyrevev fra en pasient med Wilms «tumor som ikke har hypermethylation ved IC1. C-allelet er hypermethylated, mens T-allelet er hypomethylated i både blod og nyre-indikerer lignende forelder opprinnelses metylering i disse vev.
Diskusjon
Resultatene fra våre genetiske studier viser at DMR0 er denaturert på fars allelet motsier konklusjonene fra to tidligere studier som har rapportert at DMR0 metylering er på mors allel [19], [20]. I den første rapporten metylering ble undersøkt for hele
IGF2
genet i Wilms tumorprøver med og uten tap av imprinting [20]. I denne studien ble differensial metylering ved DMR0-regionen er vist i normal nyre og i tumorer med monoallelic uttrykk, mens tumorer med tap av preging, ble hypomethylated [20]. De CPGs at vi analysert i våre metylering analyser ble også undersøkt av disse forfatterne bruker
Msp
I
/Hpa
II restriksjonsanalyse (figur 1), og regionen er spredt av probe 9 i figur 1 og 3 i [20]. I fire tilfeller med tap av heterozygositet av 11p15.5 hvor mors allelet var tapt, ble beholdt faderlig allel funnet å være unmethylated og dermed mors allelet ble inferred å være normalt denaturert allel [20]. Vi undersøkte 13 tilfeller med LOH og viste lignende hypometylering mønstre, noe som antyder at celler med LOH er tilbøyelig til å metylering endringer på DMR0 som følge av å være svulster. Den andre studien for å rapportere at DMR0 er matern denaturert karakterisert nye utskrifter av
IGF2
under utvikling. Disse forfatterne undersøkt en cellelinje etablert fra pUPD pasient og fant at DMR0 ble hypomethylated [19]. Vi har funnet at DMR0 en tendens til å demetyleres i hybridoma cellelinjer med et enkelt humant kromosom 11, uavhengig av foreldre opprinnelse (upublisert observasjon) og anta at dette kan være en cellekultur fenomen.
Funksjonen til DMR0 er fortsatt ukjent. Det er blitt hevdet at rollen DMR0 metylering er å opprettholde stanse på mors
IGF2
allel. Men vissheten om at foreldre opprinnelsen til
IGF2
DMR0 metylering er faderlig eliminerer en rolle i metylering-mediert undertrykkelse av morens
IGF2
allel. Faktisk snarere enn å virke som en autonom regulator av prege Våre resultater tyder på at DMR0 metylering påvirkes av IC1-metylering i ikke-neoplastiske celler. Dermed under embryogenese, forelder Opprinnelsesland spesifikke metylering mønstre på menneske
IGF2 Anmeldelser -.
H19
locus er etablert i
cis
lik observasjoner i mus [15]
Hos mus hvor CTCF nettsteder har blitt mutert, har utelukkelse av CTCF fra mors IC1 resulterte i metylering av IC1 [23] og
Igf2
DMRs [16]. Videre i voksen mus årehinnen plexus, en hjernevev der
Igf2
uttrykkes fra begge alleler og
H19
er ikke uttrykt, IC1 og
Igf2
DMRs er metylert på begge foreldre kromosomene [24]. Vi viser her at avvikende gevinst eller tap av metylering ved IC1 er koblet til samme metylering endre på
IGF2
DMR0. Den viktigste forskjellen er at mus har en DMR1 og en morkake bestemt DMR0, mens hos mennesker, er DMR1 mangler og DMR0 ser ut til å oppføre seg mer lik mus DMR1. Den ultimate effekten av IC1 påvirke
IGF2
metylering er at epimutation av IC1 har konsekvensen av begge foreldrelene viser en faderlig avtrykk i tilfelle av BWS eller en mors avtrykk i tilfelle av SRS (Fig. 3).
i normale individer,
IGF2
uttrykk er fra fars allel og
H19
er fra mors allelet. IC1 og DMR0 er denaturert på fars kromosom. I BWS, er epigenotype og uttrykk mønster av morens kromosom konvertert til faderlig og SRS, er epigenotype og uttrykk mønster av fedre kromosom konvertert til mors (forlaget switching). I Wilms tumor,
IGF2
aktivering og
H19
lyddemping er forbundet med forstyrrelse av både mors og fars forlagene (somatisk tap av imprinting).
Hvis lang treet interaksjoner mellom DMRs på dette locus er lik hos mus og mennesker, vil dette forklare imprinting feil som finnes i overvekst lidelser BWS og SRS. Men imprinting defekter i Wilms tumor fortsatt vanskelig å forene med enhancer konkurranse og langtrekkende DMR samhandlingsmodeller. I vår analyse av denne utvalgt gruppe av Wilms svulst pasienter, er metylering ved DMR0 tapt på fars allelet, mens IC1 gevinster metylering på mors allelet. DMR0 metylering nivåer er spesielt lav i noen av tumorene, hvilket indikerer en nesten fullstendig utrydding av metylering på dette området sannsynligvis fra begge allelene (fig. 2A-C). Epigenetisk omprogrammering oppstår dermed på begge foreldrenes kromosomer i stedet for i
cis
, noe som indikerer at ulike mekanismer kontrollere
IGF2
imprinting i neoplastiske og ikke-neoplastiske celler (Fig. 3). Soma-wide IC1 hypermethylation i BWS predisponerer for Wilms tumor og lignende epigenetiske forandringer skjer i nyrene som pre-neoplastiske hendelser i Wilms tumorigenesis [25]. Det er mulig at DMR0 hypometylering er assosiert med en mer vedvarende aktivering av
IGF2
i tumorceller som følge av alternativ høyt nivå kromatin konformasjon fremmet av tumor-spesifikke aktivatorer.
I løpet tumorigenesis global hypometylering oppstår i gjentatte rike regioner, LINE og SINE elementer, mens CpG øyer forbundet med arrangører er underlagt hypermethylation [26]. DMRs metylert i germline og DMRs metylert i somatiske celler kan variere i sin evne til å være nytt i løpet tumorigenesis. Videre sammenligning av ulike DMRs i form av germline versus somatisk og matern versus faderlig metylert samt genetiske og epigenetiske egenskaper bør føre til dypere forståelse av epigenetisk omprogrammering i kreft. Før våre studier, tap av metylering er den eneste som er beskrevet epimutation ved DMR0 i kreftformer, mens både hyper og hypometylering har blitt beskrevet ved IC1 [21], [27]. Dessuten, ikke alle rapporter viser en direkte sammenheng mellom
IGF2
uttrykk og DMR0 metylering endringer på dette locus, og vi har rapportert unntak i brystkreft (Ito
et al.
Innsendt), mens andre har rapportert unntak i eggstokkene og blærekreft [28], [29]. De studier som gjør viser en sammenheng mellom tap av DMR0 metylering og tap av imprinting trenger å bli tolket fordi metylering ved DMR0 regionen er tapt fra det aktive fars allel snarere enn fra den stille allel.
I sammendraget, vi viser tre forskjellige omprogrammering hendelsene skjer på
IGF2-H19
locus og forbundet med imprinting tap i BWS, SRS og Wilms tumor. I vekstforstyrrelser, germline allel-spesifikk metylering endringene har effekt av et avtrykk bryter slik at begge allelene ser ut som enten en faderlig allel (BWS) eller en mors allel (SRS), mens i kreft både foreldre merker er tapt og omprogrammeres. Våre funn viser at tap av
IGF2
imprinting er et komplekst fenomen som oppstår med ulike mekanismer i menneskelig sykdom, sannsynligvis gjenspeiler ulike molekylære årsaker og tiltak.
Materialer og metoder
emner
85 BWS og 3 SRS saker ble rekruttert fra forskjellige italienske barneavdelinger og ble klinisk diagnostisert i henhold til de kriterier som er beskrevet i litteraturen (https://www.geneclinics.org). Studien involverte også 40 Wilms Tumor pasienter som deltok ved Pediatrisk Oncology tilsluttet Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica (AIEOP). Alle tumorer ble histologisk diagnostisert.
Etisk godkjenning
Denne studien ble godkjent av de etiske komiteer av andre University of Naples og Istituto Nazionale Tumori, INT, Milano.
Identifikasjon av IC1 og IC2 metylering, UPD, LOH og kopiere nummer unormalt
DNA metylering ved IC1 og IC2 ble analysert ved Southern blotting med metylering sensitive restriksjonsenzymer eller COBRA, som beskrevet [2]. Tre prøver med IC1 hypermethylation avledet fra BWS pasienter også hadde arvet microdeletions [30], [31]. UPD, LOH og duplisering på 11p15.5 loci ble bestemt ved mikroanalyse, som beskrevet [32].
Analyser av DMR0 metylering
Vi har konstruert en standard pyrosekvensering analyse for
IGF2
DMR0 region (NCBI36: 11,2125904-2126160) som inkluderte seks CPGs, tre av dem tidligere ble rapportert å være hypomethylated i colorectal pasienter med LOI på
IGF2 product: [21]. De CPGs innenfor denne regionen er inkludert i DMR0 region analysert ved hjelp av andre, [19], [20]. 100 ng-2 pg av genomisk DNA per prøve ble behandlet ved hjelp av bisulfitt EZ-DNA-metylering kit (Zymo Research). Bisulfitt behandlet DNA ble brukt for å generere PCR forsterket maler for pyrosekvensering ved hjelp av følgende forover primer: 5’TGAGGATGGGTTTTTGTTTGGTAT3 «og biotinylert reverse primer 5’TCCTCAATCCACCCAAAATAATAT3». 10 pl av biotinylert PCR-produkt ble anvendt for hver sekvenseringsanalyse ved hjelp av følgende sekvenseringsprimere 5’GGGGTGGAGGGTGTA 3 «og 5′-AAAAGTTATTGGATATATAGT 3». Pyrosekvensering ble gjennomført på PSQ HS 96 System og PyroMark MD System ved hjelp Pyro Gold reagenser (Biotage, Uppsala, Sverige). Allel-spesifikk pyrosekvensering ble utført ved å erstatte de ovennevnte biotinylerte primer med allel-spesifikke biotinylerte primere, 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAC3 «, eller 5’CCCAAAATAATATCTATAAAAAAAAAATTCAT3» som gjenkjennes G eller A allel av rs3741210 polymorfisme på den motsatte tråden etter bisulfitt konvertering.
metylering ble kvantifisert ved hjelp av Pyro Q-CpG programvare (Biotage, Uppsala, Sverige) som beregner forholdet mellom konverterte Cs (TS) å uomvendte Cs på hvert CpG og uttrykker dette som en prosentandel metylering. Gjennomsnittlig metylering over DMR0 for alle 6 CPGs ble beregnet. Median og IQR metylering for ulike kategorier av pasienter ble analysert ved bruk av Prism Graphpad programvare.
Vi bekreftet allel-spesifikk metylering ved konvensjonell bisulfitt sekvensering av klonede PCR-produkter i alle våre informative tilfeller.
Støtte Informasjon
Figur S1.
bisulfitt sekvense analyser av IGF2 DMR0 Metylering i normale, medfødte vekstforstyrrelser og Wilms tumor. IGF2 DMR0 Metylering i normale, medfødte vekstforstyrrelser og Wilms tumor. Metylering av 6 CPGs ble bestemt av bisulfitt genomisk sekvensering på DNA ekstrahert fra perifert blod leukocytter (Normal, BWS og SRS) eller svulstvev (Wilms tumor) av individer informative for rs3741210 polymorfisme. Fylte sirklene representerer denaturert CPGs og åpne sirkler unmethylated CPGs. Den mors (MAT) og fars (PAT) alleler av IGF2 DMR0 regionen er indikert
doi:. 10.1371 /journal.pone.0001849.s001 plakater (1,33 MB TIF)
Takk
Vi takker bidraget av AIEOP Wilms Tumor vitenskapskomiteen og alle pasienter og deres familier for deres deltakelse i denne studien.
