Abstract
Innledning
Selv
cetuximab og panitumumab viser en økt
effekt for pasienter med KRAS-NRAS-BRAF og PI3KCA villtype metastatisk kolorektalcancer, oppstår primære motstand i en relevant undergruppe av molekylært anrikede populasjoner.
pasienter og metoder
Vi evaluerte resultatet av 68 pasienter med avansert kolorektal kreft og RAS, BRAF og PI3KCA status i henhold til ALK genet status (disomic vs gevinst på ALK genkopitallet – definert som gjennomsnittet av tre til 5 fusion signaler i ≥10% av celler). Alle pasientene sammenhengende fikk cetuximab og irinotecan eller panitumumab alene for chemorefractory sykdom.
Resultater
Ingen ALK trans eller presiseringer ble oppdaget. ALK genkopitallet vinning ble funnet i 25 (37%) tumorer. Responsraten var signifikant høyere hos pasienter med disomic ALK sammenlignet med dem med gevinst på genkopitallet (70% vs. 32%, p = 0,0048). Tilsvarende progresjonsfri overlevelse var signifikant forskjellig når man sammenligner de to gruppene (6,7 vs. 5,3 måneder, p = 0,045). En trend ble observert også for total overlevelse (18,5 vs. 15,6 måneder, p = 0,885).
Konklusjon
Forsterkning av ALK genkopitallet kan representere en negativ prognostisk faktor i mCRC og kan ha en rolle i resistens mot anti-EGFR terapi
Citation. Pietrantonio F, Maggi C, Di Bartolomeo M, Facciorusso MG, Perrone F, Testi A, et al. (2014) Gevinst av
ALK
genkopitallet Kan Tippe Mangel på gode Anti-EGFR behandling hos pasienter med avansert tykktarmskreft og
RAS-RAF-PI3KCA
Wild-Type Status. PLoS ONE 9 (4): e92147. doi: 10,1371 /journal.pone.0092147
Redaktør: John Souglakos, Universitetet General Hospital i Heraklion og Laboratorium for Tumor Cell Biology, School of Medicine, University of Crete, Hellas
mottatt: Desember 23, 2013; Godkjent: 18 februar 2014; Publisert: 01.04.2014
Copyright: © 2014 Pietrantonio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av midler innhentet gjennom italiensk lov lov 12 november 2011 n. 183 som gjør at skattyterne å bevilge 0,5 prosent andel av sin inntekt skatt bidrag til en forskningsinstitusjon for sine valg. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Behandling med anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) monoklonale antistoffer – cetuximab og panitumumabs – forbedret utfallet av pasienter med avansert KRAS villtype tykktarmskreft (CRC) i kombinasjon med første- eller andrelinje fluorpyrimidin basert kjemoterapi eller i innstillingen for chemorefractory sykdom [1] -. [6]
Flere motstands biomarkører utover
KRAS
ble undersøkt for å bedre pasientenes valg. Det ble tidligere vist at svarprosenten til cetuximab nådde verdien på 41,2% for pasienter med
KRAS
,
BRAF
,
NRAS Hotell og ekson 20
PI3KCA
«quadruple villtype» status [7]. Men selv i molekylært anrikede populasjoner, er det fortsatt et relevant undergruppe av ikke respondere [8]. Identifiseringen av ytterligere motstand biomarkører er et udekket klinisk behov for anti-EGFR behandling tilpassing i denne innstillingen.
Anaplastisk lymfom kinase (ALK) er medlem av insulinreseptoren familie med tyrosin kinase aktivitet, noe som kan aktivere signal transduksjon av ligand binding, genamplifisering eller mutasjon [9]. Oppdagelsen av en ny potensielt relevant onkogene hendelse i lungekreft,
EML4-ALK
trans, og utviklingen av ALK-hemmere med lovende resultater i prekliniske modeller og randomiserte kliniske studier gir begrunnelsen for omfattende karakterisering av
unormalt ALK
hos pasienter med andre solide tumorer, som CRC [10], [11]. Endringer i ALK kan påvirke den biologiske aktivitet av EGFR gjennom krysstale av signalveier. Faktisk onkogene
ALK
kan aktivere uavhengig nedstrøms trasé inkludert
PI3KCA Twitter /Akt og
RAS-RAF-MAPK
, selv i nærvær av EGFR blokkering [12].
Formålet med vår analyse var å vurdere rollen til gevinst på
ALK
genkopitallet i form av responsrate, progresjonsfri overlevelse (PFS) og total overlevelse (OS) i pasienter behandlet med irinotecan og cetuximab eller panitumumab som monoterapi for avansert, chemorefractory CRC og villtype
RAS-RAF-PI3KCA
status.
pasienter og metoder
pasient~~POS=TRUNC befolkningen
Sixty-åtte påfølgende pasienter med histologisk påvist metastatisk CRC med
KRAS
,
NRAS
,
BRAF
,
PI3KCA
villtype status ble prospektivt samlet 2007-2013 på «Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori» og ble ansett som kvalifisert for denne studien. Pasientene fikk en kombinasjon av cetuximab og irinotecan eller panitumumab etter kliniske tegn på refraktær mot standard kjemoterapi inkludert fluoropyrimidiner, oksaliplatin og irinotekan. The Institutional Review Board of «Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori» godkjent denne studien og alle undertegnet skriftlig informert samtykke.
mutasjonsanalyse av RAS-RAF-PI3KCA
Formalin fiksert parafin-embedded tumorvev ble anmeldt for kvalitet og tumor innhold. En vev inneholdende minst 80% av neoplastiske celler ble valgt for hvert enkelt tilfelle. Macrodissection av 7 mikrometer metylenblått-farget seksjoner tillatt separasjon av neoplastiske og normale celler. Genomisk DNA ble ekstrahert ved hjelp av Qiamp FFPE DNA kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) etter produsentens anvisninger. Mutasjonsanalyse av
KRAS
eksoner 2, 3 og 4 ble utført som tidligere beskrevet [13], [14].
KRAS
exon 2 status ble ytterligere bekreftet gjennom en spesifikk mutant anriket polymerase kjedereaksjon (PCR), som er kjent for å være en mer følsom metode [15].
BRAF plakater (ekson 15),
NRAS plakater (eksoner 2 og 3) og
PI3KCA
(eksoner 9 og 20) mutasjonsanalyse ble utført ved hjelp av PCR med spesifikke primere tidligere beskrevet [13], [15]. PCR-produktene ble utsatt for direkte sekvensering ved bruk av en ABI Prism 3500 DX Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og deretter evaluert ved hjelp av ChromasPro programvare.
ALK genkopitallet status
Tre til fire um tykke seksjoner ble kuttet fra parafinblokker og montert på positivt ladet objektglass og tørket i minst 1 time ved 56 ° C. Vevssnitt ble deparaffinized i xylen (3 ganger hver av 10 minutter), rehydrert med en ethanol-i-vann-serien (100% -85% -70%). Deretter ble seksjonene forbehandlet i TE (Tris-5 mM EDTA 1 mM, pH = 7) ved 96 ° C i 15 minutter, skyllet i destillert vann og enzymatisk spaltet med pepsin 0,4% i 0,01 N HCl i 6 til 10 minutter ved 37 ° C, med overvåking av progresjonen av den enzymatiske fordøyelse ved hjelp av et fasekontrastmikroskop.
objekt~~POS=TRUNC ble deretter vasket i destillert vann i to ganger hver på 5 minutter, dehydratisert i 96% etanol i 3 minutter, lufttørket. Etter påføring av sonden (ALK FISH-DNA-probe, Split signal Dako) på det området av interesse ble prøvene codenatured ved 85 ° C i 1 minutt og deretter hybridisert ved 37 ° C over natten ved anvendelse av en hybridizer (Dako). Den følgende dag, Dekkglass ble fjernet og objektglass ble neddykket i posthybridization oppløsning 2xSSC /0,3% NP40 (73 ° C i 2 minutter) deretter i 2xSSC /0,1% NP40 (1 minutt ved værelsetemperatur) og til slutt brifly skylt i destillert vann. Preparatglassene ble deretter igjen for å tørke i mørke ved romtemperatur, og kjerner ble motfarget i Vectashild Antifade oppløsning med DAPI (4,6-diamino-2-phenyindole-2-hydroklorid) (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA).
et minimum av 60 ikke-overlappende kjerner av invasive tumorceller ble scoret ved hjelp av Olympus epifluorescence mikroskop utstyrt med en 100 × oljeneddyppingsobjektivet og 4,6-diamidino-to-phenylindole /Spectrum Grønn /Orange singel og trippel båndpass filtre. De to DNA-probe innenfor ALK FISH-DNA-probe, Split Signal, er utformet for å hybridisere oppstrøms og nedstrøms for stoppunkt klyngen regionen. Samlokalisering av de probes resulterer i en gul signal, mens trans hendelser i brytningspunktet klyngen regionen vil dele ett signal i egen grønn (fluorescein) og rød (Red Texas) signaler. Kriteriene for ALK trans positivitet var tilstedeværelsen av splittelsen av sondene i på lest 15% av cellene.
Som kriterier for kopitall avvik av
ALK
er ikke klarlagt, vi vilkårlig brukte følgende avskjær tilpasset fra de kriterier som er fastsatt for
EGFR
og
HER-2
i ikke-småcellet lungekreft prøvene [16], [17]. Ifølge Cappuzzo et al. [16], pasienter kan bli klassifisert i seks FISH strata med stigende antall av kopier av EGFR-genet per celle i henhold til frekvensen av tumorceller med bestemt antall kopier av EGFR-genet. I vår studie, vedtok vi avskjær for å klassifisere ALK genkopitallet endringer som tidligere beskrevet for ikke-småcellet lungekreft [18]. I korthet gevinst på
ALK
genkopitallet (inkludert både lav og høy genomisk gain) ble definert som gjennomsnittlig kopiantall av 3 til 5 fusjons signaler i ≥10% av celler og amplifisering som tilstedeværelsen av ≥6 kopier av
ALK
per celle i ≥10% av analyserte celler. I tilfeller der klynger ble observert rapporterte vi prosentandelen av celler med klynger og vurderes forsterket tilfeller med ≥10% av
ALK
klynger [18] (figur 1).
Forsterkning av ALK GCN (inkludert både lav og høy genomisk gain) ble definert som et gjennomsnitt av 3 til 5 fusjons signaler i ≥10% av celler (figur på høyre). Disomic celler er vist i figur på venstre side.
Statistical Analysis
Beskrivende statistisk metode ble benyttet for å analysere resultatene og kvalitative data ble sammenlignet med chi-kvadrat-test, som passer.
PFS ble definert som tiden fra dato for påmelding til datoen for den første dokumenterte progressiv sykdom (PD) eller død for enhver årsak. OS ble beregnet fra datoen for påmelding til datoen for død på grunn av enhver årsak, eller sensurert på datoen for siste oppfølging for levende pasienter. Overlevelseskurver ble plottet i et Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med log-rank test. For ordens variabler, ble en log-rank test av trend brukt. Dataanalysen var i SPSS versjon 16.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). Resultatene ble rapportert med 95% konfidensintervall (KI). Alle de statistiske testene ble utført ved tosidig 0,05 signifikansnivå.
Resultater
Pasient befolkningen
Sixty-åtte påfølgende pasienter med avansert villtype
RAS-RAF-PI3KCA
CRC ble inkludert i denne prospektive datasettet på Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori i Milano. Pasient og sykdoms egenskaper er vist i tabell 1 og oppsummert i figur 2. De fleste av de pasienter (n = 60, 88%) ble klassifisert som chemorefractory og har tidligere blitt behandlet med både oksaliplatinbasert og irinotecan-kjemoterapi, og etter svikt av minst to foregående linjer av kjemoterapi. Men åtte (12%) av pasientene ble vurdert irinotecan kvalifisert og fikk panitumumab som andrelinjebehandling etter svikt i oksaliplatinbasert kjemoterapi. Total, vi observerte en delvis respons på 34 pasienter (50%), og progressiv sykdom i 17 tilfeller (25%). Ytterligere 17 pasienter (25%) viste stabil sykdom (SD), mens ingen måte komplett remisjon ble oppnådd. Median oppfølging av hele serien var 32,5 måneder. Overall, 67 pasienter hadde en dokumentert PD, og totalt 41 (60%) pasienter døde. Alle dødsfallene skyldtes PD, mens en pasient ble tapt for oppfølging. Median PFS og OS var 6,3 og 16,4 måneder, henholdsvis. OS kurver ble avkortet på 3 år, nemlig ved et tidsintervall litt lengre enn median oppfølging.
Pasienter utfallet ifølge ALK genkopitallet status
Nei
ALK
trans eller presiseringer ble oppdaget.
ALK
genkopitallet gevinst ble funnet i 25 (37%) svulster, med en median antall
ALK
signaler per celle med unormale FISH resultatene var 3,52 (rekkevidde, 3,0 til 5,8); disomic
ALK
status ble funnet i 43 (63%) prøver, som vist i figur 1. Når det gjelder korrelasjonen av
ALK
status med resultater, bare 8 av 25 (32%) pasienter i gruppe med økt
ALK
genkopitallet viste en delvis respons i henhold til RECIST 1.1 kriterier [19], mens opp til 30 av 43 (70%) pasienter med disomic
ALK
status svarte. Denne forskjellen var statistisk signifikant (p = 0,0048). PFS ble betydelig forverret i nærvær av økt
ALK
genkopitallet vs. disomic
ALK
status (5,3 vs. 6,7 måneder; Hazard Ratio [HR] = 1,759, 95% KI, 1.013- 3,053; p = 0,045; figur 3). OS var litt forverret hos pasienter med økt
ALK
genkopitallet, selv om denne forskjellen ikke statistisk signifikant (15,6 vs. 18,5 måneder, HR = 1,181, 95% KI, 0,623 til 1,738; p = 0,885; Figur 4)
Kaplan-Meier kurver for progresjonsfri overlevelse i henhold til ALK status:.. økning av genkopitallet vs. disomic status
Kaplan-Meier kurver for total overlevelse ifølge ALK status. økning av genkopitallet vs. disomic status
Diskusjoner
Internasjonale retningslinjer anbefaler
KRAS
mutasjonstesting før forskrivning anti-EGFR den monoklonale antistoffer cetuximab og panitumumab for pasienter med avansert CRC og sier at alternativ behandling foreskrevet når mutasjoner er påvist [20]. Faktisk,
KRAS
mutasjoner er blitt validert som prediktive biomarkører av resistens mot anti-EGFR behandling [4] – [7]. Men en betydelig prosentandel av pasienter med villtype
KRAS
svulster unnlater å svare på behandling. Derfor til identifisering av ytterligere biomarkører kjøre «negative» utvalg av pasienter med avansert CRC er et udekket klinisk behov. En mer nøyaktig behandling tilpassing kan bidra til å unngå unødvendig toksisitet og sociosanitary kostnader for pasienter som ikke vil dra nytte av behandlingen. De fleste biologiske faktorer som ble analysert i et forsøk på å forbedre pasientens utvalg i denne innstillingen fokusert enten på EGFR nedstrøms signalveien eller på reseptoren selv. Nylig har en bredere mutasjonstesting av
RAS
genet (ved eksoner 2, 3 eller 4 av begge
KRAS Hotell og
NRAS
) er godkjent for behandling tilpassing i avansert kolorektal kreft gjennom støtte fra flere studier [21]. I likhet med RAS gener,
BRAF
også koder for proteiner som fungerer i RAS-RAF-MAPK signalveien og kan være involvert i resistens mot anti-EGFR behandling. Men disse innledende observasjoner var ofte motstridende, og begrenset til en liten del av pasientene. For eksempel, foreløpige data om rollen BRAF status virket lovende for en enkel applikasjon i klinisk praksis [22], men en stor påfølgende analyse fra CRYSTAL ( «Cetuximab kombinert med Irinotecan i førstelinjebehandling for metastatisk kolorektalcancer») knyttneve -line test viste at BRAF mutasjoner er en dårlig prognostisk faktor, men ikke en prediktiv on [23]. Det ble også vist at, i likhet med hva observert for onkogene aktivering av MAPK vei, den konstituerende dereguleringen av
PI3KCA
kunne omgå EGFR signalveien og være ansvarlig for klinisk resistens [13]. En tidligere systematisk gjennomgang fant at
PI3KCA
exon 20 mutasjoner ble assosiert med en lavere responsrate, kortere progresjonsfri overlevelse og total overlevelse og dermed kan være en potensiell biomarkør for resistens mot anti-EGFR monoklonale antistoffer i
KRAS
villtype metastatisk CRC, mens
PI3KCA
ekson 9 mutasjoner syntes å ha noen slik rolle [24].
Siden svarprosenten til cetuximab er 41,2% i pasienter med «firedoble wild-type» tumorer [7], er det åpenbart at andre biomarkører må være involvert i behandling primær motstand. Endringer av membranen tyrosin-kinase-reseptorer «konkurrerer» med EGFR – som HER-3, MET eller IGFR – kan spille en rolle i behandlingen Ingen respons, på grunn av krysstale i signale nedstrøms [25] – [27]. Til tross for det aktuelle antall prekliniske observasjoner, er det få kliniske studier er gjennomført for å utforske den antatte funksjon av vekstfaktor reseptor gjensidig avhengighet og komplementaritet i å påvirke kliniske utfall med anti-EGFR behandling. Videre medfører dette forskningsfeltet ofte har vært motstridende og ikke lett overføres til klinisk praksis. Faktisk kan tidligere studier i denne innstillingen har betydelige skjevheter som følge av analyse av en serie med tilbakevirkende kraft-identifiserte undergrupper og inkludering av RAS, BRAF og PI3KCA mutante svulster. Dette kan i betydelig grad påvirke resultatene, som den lille størrelsen på utvalget kunne ha vært klart statistisk utilstrekkelig for multiple sammenligninger av andre medvirkende faktorer.
Nylig har ALK trans blitt rapportert hos omtrent 2,5% av CRC preget av C2orf44-ALK og EML4-ALK genfusjoner [28], [29]. Imidlertid har andre ALK fusjonspartnere er beskrevet i ikke-småcellet lungekreft og andre tumortyper, noe som begrenser muligheten for å syntes alle ALK translokasjoner som kan være til stede i CRC-prøver. Videre er signal oppregning i solide svulster seksjoner ved FISH utfordrende å tolke og retningslinjer for analysemetoder og poengsystemer er ikke tilgjengelig for CRC, delvis forklarer hvorfor
ALK
genkopitallet som biomarkør har ikke blitt grundig undersøkt ennå. Når det gjelder rollen ALK i utvikling og progresjon av CRC, en fersk studie av Aisner et al. funnet merket intratumoral heterogenitet for både KRAS mutasjon og ALK omorganisering i barnekonvensjonen og i regionen høygradig dysplasi [30]. Forfattere foreslå som dette bevis kan skape grunnlag for flere hypoteser som forklarer mekanismer som kombinasjoner av KRAS og ALK status kan eksistere gjennom klonal kreft evolusjon [30]. Når det gjelder prognostisk rolle ALK, ble sammenhengen mellom kopitall endringer og klinisk utfall ikke omfattende studert i CRC. Nylig ble økningen av ALK genkopitallet anerkjent som en selvstendig dårlig prognostisk faktor i en retrospektiv serie av 770 pasienter med CRC [31]. ALK genkopitallet (amplifikasjon /gevinst) ble funnet ut bare i 3,4% av alle CRC prøvene undersøkt, muligens gjenspeiler det relativt lave antall av trinn IV pasienter inkludert, og på grunn av den statistisk signifikant sammenheng av ALK kopitall forandringer med mer avansert stadium av sykdommen [31].
så vidt vi vet, er det første å undersøke hvilken rolle ALK som en prognostisk faktor hos pasienter med avansert CRC mottar cetuximab eller panitumumab vår studie. I vår analyse, undergruppen av pasienter med chemorefractory CRC og økt ALK genkopitallet hadde HA signifikant lavere sannsynlighet for å svare på anti-EGFR behandling, til tross for en RAS-RAF-PI3KCA villtype status. ALK status så ut til å påvirke bare den responsrate og PFS, men ikke OS varighet, og dermed begrense begrunnelsen for dens anvendelse som et prognostisk faktor. Det må imidlertid påpekes at potensielle forskjeller i OS ifølge ALK status kan ha blitt forvirret av post-progresjon behandlinger vanligvis foreskrevet på vårt høyere kreftsenter – inkludert kjemoterapi reintroduksjon, regorafenib, anti-EGFR reintroduksjon, temozolomid i MGMT metylert svulster og molekylær profilering for inkludering i fase i-studier med målrettede midler [32] – [34]. Videre liten prøve størrelse og mangel på en kontrollgruppe av vår studie la åpne muligheten for at ALK kopiere nummer endringer kan være en prognostisk faktor snarere enn en prediktiv en, siden det er ingen måte å dissekere den prediktive fra prognostisk betydning. Faktisk er det mulig prediktive rollen til ALK-genet status som nøkkel banen til resistens mot anti-EGFR behandling må ytterligere bekreftet ved tilstrekkelig drevet, randomiserte studier. Imidlertid, til tross for noen iboende begrensninger, pasienter inkludert i denne analysen ble oppnådd fra en prospektiv database og ble behandlet homogent med anti-EGFR-monoklonale antistoffer for chemorefractory sykdom. Alle pasientene ble valgt ut gjennom en «molekylær anrikning» -prosessen -. Og de med mulige confounding RAS, BRAF, og /eller PI3KCA mutasjoner ble ansett som uegnet
Til slutt, om høy
ALK
genkopitallet kan representere en sann prediktiv faktor av respons på ALK-hemmere er ikke undersøkt hos CRC. Interessant nok kan ALK være en mulig molekylære mål som del av en behandlingsprotokoll rettet mot kontroll av enten EGFR og ALK-reseptorer, eller den PI3KCA pathway. Muligheten for å bruke ALK-hemmere i biologisk utvalgte anti-EGFR-resistente svulster lover å være en avgjørende utfordring for den fremtidige utviklingen av målrettet terapi i CRC pasienter. Mangelen på ALK translokert tilfeller, sammen med den lave prosentandelen av celler med forsterkning i alle tilfeller, antyder at forsterkningen av genkopitallet ikke kan være en biologisk relevant hendelse eller forutsi respons på Alk rettet mot molekyler. Videre
ALK
genkopitallet forsterkning kan være forbundet med kopiantall avvik av andre konkurrerende gener, slik som MET eller EGFR i seg selv [35], [36]. Likevel gjør disse observasjonene ikke definitivt utelukke potensielle nytten av ALK-hemmere i denne populasjonen, som demonstrert i colorectal pasienter uten EGFR protein uttrykk som responderer på terapeutiske monoklonale antistoffer rettet mot EGFR [37].
Takk
Disclaimer: manuskriptet er ikke publisert eller innsendt for publisering andre steder. Alle forfattere har bidratt betydelig, og er i overensstemmelse med innholdet i manuskriptet.
