Abstract
Vi har utført den første studie for å bestemme den diagnostiske potensiale for CD14 CD16 + ++ mellomliggende monocytter i forhold til pro-angiogene undergruppe av CD14 CD16 + ++ + Tie2 Tie2-uttrykkende monocytter (tems ) i kreft. Disse monocytter populasjoner ble undersøkt ved flowcytometri hos friske frivillige (N = 32) og i kolorektal karsinom pasienter med lokalisert (N = 24) eller metastatisk (N = 37) sykdom. Vi videre bestemmes blod nivåer av cytokiner assosiert med monocytt regulering. Resultatene viste mellom monocytt undergruppe å være signifikant forhøyet hos pasienter med kolorektal kreft, og for å vise de høyeste frekvensene i lokalisert sykdom. Multivariat regresjonsanalyse identifisert mellom monocytter som en betydelig uavhengig variabel i kreft prognose. Med en cut-off-verdi på 0,37% (mellomliggende monocytter av totale leukocytter) diagnostisk sensitivitet og spesifisitet varierte ved 69% og 81%, respektivt. Derimot ble TEM nivåer forhøyet i lokalisert kreft, men ikke signifikant forskjellig mellom gruppene og ingen av cytokiner korrelerte med monocytter subpopulasjoner. Av interesse,
in vitro
analysene støttet observasjon at mellom monocytter ble mer potent indusert av primær motsetning til metastatiske kreftceller som kan relateres til det immunsuppressive miljøet etablert i avansert stadium av metastatisk sykdom. I konklusjonen, mellom monocytter i forhold til Tie2-uttrykke monocytter er en mer sensitiv diagnostisk indikator for tykktarmskreft
Citation. Schauer D, Starlinger P, Reiter C, Jahn N, Zajc P, Buchberger E et al . (2012) Mellom Monocytter men ikke Tie2-Uttrykke Monocytter er en følsom diagnostisk indikator for tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (9): e44450. doi: 10,1371 /journal.pone.0044450
Redaktør: Isaac Yang, UCLA, USA
mottatt: 25 februar 2012; Godkjent: 07.08.2012; Publisert: 04.09.2012
Copyright: © Schauer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Medical Scientific fondet av ordføreren i byen Wien (https://www.wien.gv.at/gesundheit/einrichtungen/med-wiss-fonds/) av stipend no. 8064 utstedt til T. Gruenberger. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
monocytter anses sentrale aktører i medfødt immunitet ; de står for omtrent 8-10% av humane leukocytter og er preget av uttrykket av co-reseptoren CD14 for toll-like receptor 4 (TLR4) [1]. En liten undergruppe av humane perifere blod monocytter som co-uttrykker CD16 (Fcy reseptor III) har blitt identifisert i 1988 [2], og funnet å utgjøre om lag 10% av det totale blod monocytter [3]. Heterogenitet innenfor denne CD16 + populasjonen ble senere gjenkjent [4]. Eksistensen av 3 monocytter subpopulasjoner basert på differensial uttrykk for CD14 og CD16 har nylig blitt implementert i den nye nomenklaturen av monocytter som skiller mellom CD14 ++ CD16- «klassiske», den CD14 ++ CD16 + «middels» og CD14 + CD16 ++ «non-klassisk» monocytt undergruppe [5]
Nyere studier på genuttrykk profiler peke på en utviklingsmessig sammenheng mellom de tre undergrupper med gradvise endringer i overflatemarkører under modning [6] -. [7]. Til sammenligning
in vitro
kultur og modning av blodmonocytter resulterer i en gradvis økning av CD16-ekspresjon [8] – [9], som er utløst av cytokiner så som MCP-1 (monocyttkjemotiltrekkende protein 1), TGF -β (transformerende vekstfaktor beta), eller M-CSF (makrofag-kolonistimulerende faktor) [10] – [12]. Videre er de tre subpopulasjoner utviser distinkte funksjonelle forskjeller, med klassiske monocytter som viser den høyeste fagocytose potensialet [6]. I kontrast, ikke-klassiske monocytter har lav kapasitet for fagocytose, viser en patruljering atferd langs karveggene og reagerer sterkt mot nukleinsyrer og virus [13]. Genet ekspresjonsprofilen av mellomliggende monocytter har knyttet dem til antigen prosessering og presentasjon, med inflammatoriske responser på bakterielle patogener og lipopolysakkarid (LPS) [6], [14]. Av interesse, pro-angiogene markører som endoglin, vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGFR-2) og Angiopoietin reseptoren Tie2 selektivt overuttrykt i den mellomliggende monocytt undergruppe [6], [15].
tems (Tie2-uttrykkende monocytter) er innledningsvis blitt beskrevet i mus for å omfatte en pro-angiogen monocytt-populasjonen som kan øke tumorvekst med parakrin sekresjon av angiogene faktorer som VEGF og basisk fibroblast-vekstfaktor [16]. Sirkulerende temer blir detektert i det perifere blod fra friske individer og kreftpasienter, og er hovedsakelig funnet i de mellomliggende monocytt undergruppe [15], [17]. De svarer til Angiopoietin-2 (ANG-2), et protein sterkt uttrykt i tumorer, via overflate-reseptoren Tie2 og dens ko-reseptor TIE1 som kan fremme signalering ved å belyse et oppløselig fragment TIE1 [18] – [19]. Således tems fortrinnsvis akkumuleres i svulst områder, inkludert kolorektalt karsinom, men ser ut til å være fraværende fra normalt vev [17].
Monocyttnivåene delsett har vært overvåket i humant blod i sammenheng med sykdommer. Imidlertid gjorde de fleste studiene ikke diskriminere mellom ikke-klassisk og mellom monocytter, men fokusert på skillet mellom CD16-positive og negative subpopulasjoner. Forhøyede nivåer av sirkulerende CD16 + monocytter er rapportert for patologiske tilstander som sepsis [20], kronisk hepatitt B [21], koronarsykdom [22], og kreft [23]. Derfor har CD16 + monocytter vist diagnostisk og prognostisk potensial i inflammatorisk og ondartet sykdom. Nyere undersøkelser viser at jo lenger skille mellom ikke-klassisk og mellom monocytter kan tilby bedre informasjon. Spesielt ble det mellomliggende monocytter i motsetning til ikke-klassiske monocytter vist å bli selektivt forhøyet i alvorlige astmapasienter [24], og for å forutsi negativt resultat hos pasienter med høy risiko for kardiovaskulær [25]. Sammenlign analysene i kreftpasienter mangler oppdatert.
Gitt romanen innsikt i de forskjellige egenskapene til mellom monocytter og den pro-angiogene (pro-tumor) fenotype av temer vi en hypotese om at disse monocytter populasjoner kan ha diagnostisk potensial i tykk- og endetarmskreft (CRC). Vi forventet løsninger og mellom monocytter å være signifikant forhøyet i perifert blod hos pasienter med CRC og økes ytterligere i avansert sykdom. For å møte dette temaet vi gjennomført en utforskende studie på 93 deltakere inkludert friske frivillige, CRC stadium I-III pasienter (lokalisert kolorektal kreft) og CRC stadium IV pasienter (metastasert kolorektal kreft, mCRC). Vi karakteriserte subpopulasjoner av mellomliggende monocytter og temer i perifert blod i relasjon til kliniske parametere så vel som til monocytt-assosierte cytokiner inkludert MCP-1, ANG-2, kan oppløses TIE1 (sTIE1), og vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGF-A ). Det mellomliggende monocytter undergruppe i motsetning til TEMS ble funnet å være fortrinnsvis indusert i tidlige stadier av sykdommen og å utgjøre en roman, sensitiv markør for tykktarmskreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne ikke-intervensjons, klinisk undersøkelse ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Analysen av blodprøver ble godkjent av institusjonell «Ethics Committee of Medical University of Vienna» (# 331/2010 og # 791/2010); alle pasienter og friske frivillige ga skriftlig informert samtykke
Pasient Collective
Blodprøver ble samlet inn fra tre faggrupper:. friske frivillige (N = 32), pasienter med lokaliserte tykktarmskreft (N = 24 ) og pasienter med spredning tykktarmskreft (N = 37). Flertallet av mCRC pasientene hadde sitt primære svulst resected og presentert med levermetastaser sekundære til tykktarmskreft. Blod ble tatt ut før pasientbehandlingen, det vil si vanligvis en dag før operasjon eller umiddelbart før neoadjuvant kjemoterapi. Den fasen av sykdommen i henhold til Union for International Cancer Control (UICC) ble bestemt for alle CRC pasienter etter CT scan og tumor reseksjon. Friske frivillige var tilsynelatende fri for kroniske og inflammatoriske sykdommer.
Analyse av Monocyttnivåene populasjoner
etylendiamintetra-eddiksyre (EDTA) ble behandlet helblod ble behandlet ved værelsestemperatur. Surface uttrykk for CD14, CD16 og Tie2 ble vurdert å bruke direkte immunfluorescence farging, etterfulgt av en lyse-no-vaskeprosedyren. I korte trekk, ble 100 ul av fullblod inkubert med følgende antistoffer ved metningskonsentrasjon i 20 minutter: CD14-FITC (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), CD16-PC5 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) og Tie2-PE (R D sytems, Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) og VEGF-A (Invitrogen Corp., Camarillo, CA, USA) kommersielt tilgjengelige ELISA kits ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Prøvene ble analysert i duplikater med en Varioskan mikroplateleser (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
Tumor Cell Kultur
tumorcellelinjer SW480, SW620 og HT-29 ble hentet fra American Type Culture Collection (LGC Standards, Bury, UK). Celler ble sådd ut ved en densitet på 4×10
5 per cm
2 i dyrkningsmedium med 10% føtalt kalveserum (FCS). Etter 24 timer ble mediet forandret til endotele basal medium 2 (Lonza, Walkersville, MD) med 0,1% bovint serumalbumin (BSA), og tumorcelle supernatantene ble samlet opp etter ytterligere 24 timer i kultur. Supernatantene ble sentrifugert for å fjerne cellerester og lagret i alikvoter ved -20 ° C.
In vitro
Stimulering av PBMC
Blod fra friske frivillige ble trukket inn i EDTA-rør og perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert med Ficoll Paque (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). PBMC ble vasket grundig for å gi rom for et minimum av blodplate-forurensning. 2×10
6 PBMC ble sådd i hver brønn av en 12-brønners plate (Corning Inc., Corning, NY, USA) og cellene ble utsatt for tumor kultursupernatant. Siden serum-avledede faktorer utløser induksjon av CD16 ekspresjon på monocytter i kultur, ble tilsetning av FCS holdes på et minimum på 1% støtte monocytt overlevelse. Etter 24 timers inkubasjon ble ikke-vedheftende cellefraksjon fjernes og man følger Cellene ble høstet ved skraping. Cellene ble farget for CD14 og CD16 og fast i formaldehyd for flowcytometrisk analyse.
Statistical Analysis
Statistiske beregninger ble basert på ikke-parametriske tester ved hjelp av SPSS programvare versjon 17 (SPSS Inc., Chicago , IL, USA). Forskjeller mellom de tre studiegruppene ble vurdert ved bruk av Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test. Sammenhenger mellom de undersøkte parametere ble bestemt av spearmans rang korrelasjonskoeffisient. Kreft prediksjon av uavhengige variabler ble vurdert i univariat og multivariat analyse med binær logistisk regresjon. En mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve tjente til å definere cut-off-verdien for CRC diagnose. De rapporterte p-verdier er et resultat av tosidige tester. P-verdier ≤0.5 betraktes som statistisk signifikant. Boksplott er avbildet uten ekstreme verdier for å forbedre oppløsningen.
Resultater
Intermediate Monocytter er betydelig økt i CRC Pasienter
Vi søkte flowcytometri for å undersøke hyppigheten av monocytter subpopulasjoner i sunn enkeltpersoner og pasienter med kolorektal kreft. De tre kollektiver av friske personer (N = 32), pasienter med lokalisert sykdom trinn I til III (N = 24) og pasienter med metastatisk sykdom i stadium IV (N = 37) viste sammenlignbar kjønnsfordeling, men forskjeller i deres aldersgruppe ( Tabell 1).
den dominerende befolkningen i klassisk (CD14 ++ CD16-) monocytter og totalen (CD14 positive) monocytter teller ikke skiller mellom gruppene (fig. 1). I kontrast, middels (CD14 ++ CD16 +) monocytter var 2,6 ganger økt hos pasienter med lokalisert CRC sammenlignet med friske frivillige (p 0,001) som strekker seg på en medianverdien på 0,66% mot 0,25% av totalt antall blod leukocytter, henholdsvis. I avansert sykdom, mellom monocytter redusert igjen resulterer i en median frekvens på 0,40% i metastatisk CRC pasienter, men nivåene fortsatt betydelig høyere enn hos friske kontroller (p = 0,003). Når man skal vurdere mellom monocytter i celler per ml perifert blod eller i prosent av forvaltnings monocytter, ble sammenlignbare resultater oppnådd (data ikke vist).
Monocyttnivåene subpopulasjoner ble bestemt ved flowcytometri og er gitt i% av totale leukocyttverdiene hos friske individer, pasienter med lokalisert CRC og pasienter med mCRC. Hyppigheten av totalt (CD14 positive) monocytter (A) ble sammenlignet med klassiske CD14 ++ CD16- monocytter (B), middels CD14 ++ CD16 + monocytter (C), og CD14 ++ CD16 + Tie2 + TEMS (D).
på samme måte, (CD14 CD16 + ++ + Tie2) TEM delsett av monocytter viste en ikke-signifikant tendens til å stige i lokal sykdom (p = 0,055) med en midlere frekvens på 0,05%, 0,07%, og 0,05% i totale blodleukosytter for friske, lokale CRC og mCRC kollektiver, henholdsvis. Evaluering av temer basert på co-uttrykk for CD14 + Tie2 + i motsetning til trippel gating for CD14 ++ CD16 + Tie2 + endret ikke resultatene (data ikke vist).
blod nivåer av Intermediate Monocytter er en diagnostisk indikator av CRC
Vi har evaluert videre utviklingen av mellomliggende monocytter i CRC diagnose uavhengig av sykdom scenen. ROC-analyse ble brukt for å bestemme den diagnostiske effekt ved arealet under kurven (AUC = 0,785, p 0,001) og for å etablere en terskelverdi for diagnose av kreft (Fig. 2). Med en cut-off-verdi på 0,37% mellomliggende monocytter av samlede leukocytter diagnostisk sensitivitet og spesifisitet varierte ved 69% og 81%, respektivt.
Balansen i diagnostisk sensitivitet og spesifisitet av mellomliggende monocyttnivåer ble evaluert ved ROC diagram og området under kurven.
Monocytter av CRC Pasienter Vis Altered uttrykk nivåer av CD14 og CD16
den midlere fluorescens intensitet (MFI) av strømningscytometriske målinger gjenspeiler den gjennomsnittlige uttrykk nivået av de undersøkte overflatemolekyler på celler og er knyttet til monocytt-funksjon. Mens CD14 ekspresjon korrelerer med monocytt reaksjonsevne og cytokinsekresjon [27], er deres CD16-nivåer assosiert med deres evne til antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet [28].
Vi fant at de totale monocytter viste et betydelig tap av CD14 i avansert stadium av metastatisk CRC (fig. 3). Dette CD14 reduksjon ble også observert ved separat evaluert for klassisk og mellom monocytter. Innenfor undergruppe TEMS høyeste CD14 uttrykk nivåer ble registrert i lokal sykdom. Intermediate monocytter og TEMS viste i tillegg betydelig forbedrede uttrykk nivåer av CD16 i kreftpasienter sammenlignet med friske frivillige (Fig. 4), mens Tie2 uttrykk nivåer av TEMS ikke ble endret på sykdom.
CD14 uttrykk nivåer i friske individer, hos pasienter med lokalisert CRC eller mCRC ble vurdert ved midlere fluorescensintensitet (MFI) av CD14-FITC flekker på total (CD14 positive) monocytter (A) eller på de undergrupper av klassiske CD14 ++ CD16- monocytter (B), mellomprodukt CD14 + + CD16 + monocytter (C), og CD14 ++ CD16 + Tie2 + TEMS (D).
uttrykket nivået av CD16 og Tie2 på monocytter undergrupper ble bestemt for friske personer og pasienter med lokalisert eller metastatisk kolorektal kreft. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) av CD16-PC5 farging ble vurdert for mellomliggende CD14 CD16 + ++ monocytter (A), og CD14 CD16 + ++ + Tie2 mene (B). Tie2 uttrykk nivåer reflekteres av MFI av Tie2-PE antistoff bundet til TEMS (C).
Intermediate Monocytter er en uavhengig prediktor for tykktarmskreft
For å vurdere om kreftrelaterte endringer i monocytt subpopulasjoner kan være forbundet med faktorer som er kjent for å regulere rekruttering og aktivering av monocytter og mellomliggende temer, vi undersøkte blodnivåer av MCP-1, ANG-2, sTIE1 og VEGF-A hos friske frivillige og CRC-pasienter. Analysen av løselige parametere i plasma viste en sterk økning i VEGF-A (p 0,001) og ANG-2 (p = 0,004) hos pasienter med spredning sykdom (Fig. 5), mens løselige TIE1 nivåer var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene ( data ikke vist). MCP-1-konsentrasjoner ble bestemt i plasma (Fig. 5) og i en undergruppe av serumprøver (data ikke vist), men ikke gi noen signifikant forskjell mellom de tre undersøkte kollekt. For sammenligning ble tumoren markør CEA (som etablert ved rutine sykehus analyse) evaluert hos pasienter og viste en signifikant økning av CEA blodnivåene i mCRC i forhold til lokalisert kreft således dokumentere avansert stadium av sykdommen. Av notatet, ingen av de undersøkte plasma parametrene viste en signifikant korrelasjon med monocytter subpopulasjoner.
Løselige parametere inkludert VEGF-A (A), MCP-1 (B) og ANG-2 (C) ble målt i plasma prøver av friske individer, pasienter med lokaliserte CRC eller mCRC. Blodkonsentrasjoner av svulsten markør CEA (D) var tilgjengelig fra rutine sykehus analyse av kreftpasienter, men ble ikke bestemt (ND) for sunn kontroll kollektive.
logistisk regresjonsanalyse ble videre utført for å vurdere betydningen av de tilgjengelige parametre i kreft prognose. Tabell 2 angir de respektive betydning nivåer og odds ratio med 95% konfidensintervall. Univariat analyse avslørte alder, plasma, VEGF-A og blod nivåer av CD14 ++ CD16 + mellom monocytter (p = 0,004, odds ratio = 22) som predikator for tykktarmskreft. I multivariat analyse, pasientens alder og mellom monocytter (p = 0,024, odds ratio = 83) seiret som signifikante uavhengige variabler i kreft prognose.
CD16 uttrykk på Monocytter er indusert av Colon Cancer Celler
in vitro
Siden ingen av de undersøkte plasma parametrene korrelerte med induksjon av mellom monocytter i kreftpasienter, rettet vi undersøke ved å
in vitro
eksperimenter om tumor-avledet stimuli kan faktisk utløse CD16-ekspresjon på blodmonocytter og øke frekvensen av den mellomliggende delsett. PBMC ble isolert fra friske frivillige og analysert for CD14 og CD16 ekspresjon etter 24 timer inkubasjon med tumor-cellesupernatanter. Vi sammenlignet stimulering med supernatanter avledet fra primære (SW480 og HT-29) og metastatisk (SW620) tykktarmskreft linjer. Ved baseline mellom monocytter utgjorde 22% av CD14 ++ celler (Fig. 6). Etter 24 timers
in vitro
inkubasjon med supernatant fra primær-avledet (SW480 og HT-29) CRC-celler, ble frekvensen av mellomproduktet CD14 CD16 + ++ monocytter signifikant øket til 71-87%. Interessant nok ble PBMC inkubering med supernatanten av metastatisk kreft i tykktarmen linje SW620 resulterte i en moderat økning til 37% mellomliggende monocytter hos CD14 ++ celler etter 24 t.
PBMC isolert fra friske frivillige og ble inkubert i 24 timer med supernatant av tumorcellekulturer avledet fra CRC linjer HT-29, SW480 og SW620. Festede celler ble høstet og farget med CD14-FITC og CD16-PC5 antistoffer; mIgG
1-PC5 ble brukt for isotypekontroll. Strømningscytometriske data for en representativ forsøket er illustrert for isotype kontroll (A) i forhold til CD16-PC5 farging av SW480 (B), og SW620 (C) stimulert PBMC-kulturer. Gjennomsnitt og standardavvik for tre uavhengige eksperimenter med forskjellige blodgivere er gitt i et søylediagram (D) som illustrerer prosenten av CD16 + (mellomprodukt) versus CD16- (klassisk) celler i CD14 ++ monocytt befolkning.
diskusjon
Overvåking av monocytter subpopulasjoner i perifert blod har opprinnelig vært basert på det enkle påvisning av CD14 og CD16-overflatemarkører [10], [23], [29]. Dette har ført til den konklusjon at CD16 + monocytter utgjør omtrent 10% av totale blodmonocytter og mengde til 50 celler pr mikroliter av helblod [30]. En to-fold økning i denne provoserende monocytt undergruppe er observert under systemiske infeksjoner, korrelerer med sykdommens alvorlighetsgrad og er gjengitt pasient behandling og gjenvinning [31] -. [33]
En avansert protokoll for evaluering av monocytt undergrupper ble utgitt i 2010 [34] basert på samtidig påvisning av HLA-DR, CD14, og CD16 for å unngå forstyrrelser av granulocytter og naturlige drepecellepopulasjoner. I vår studie, valgte vi å fokusere på mellom CD14 ++ CD16 + og Tie2-uttrykker monocytter populasjoner med markøren kombinasjon av CD14, CD16, og Tie2. Det bør bemerkes at denne deteksjons tilnærmingen ikke tillater for utvetydig påvisning av ikke-klassiske monocytter som kan være «forurenset» av naturlige dreperceller, og som har derfor blitt utelatt fra denne analysen. En tilsvarende flekker strategi har tidligere blitt rapportert for vellykket TEM påvisning innenfor mellom monocytt undergruppe [35]. Vi vurderte konsentrasjonen av disse monocytter populasjoner i blodet hos friske frivillige og oppdaget en median nivå av 16 (interkvartilt område 11-30) mellom CD14 ++ CD16 + monocytter og 3 (interkvartilt område 2-6) TEMS per mikroliter av perifert blod. Når regnet i prosent, middels og TEM undergrupper utgjorde 0,25% og 0,05% av totalt antall blod leukocytter og til 3,39% og 0,63% av monocytter, henholdsvis.
Målet med vår studie var å finne ut om disse monocytter subpopulasjoner er forhøyet i kolorektal karsinom pasienter og har en diagnostisk markør potensial. Vi fant undergruppe av mellom monocytter til å være 2,2 ganger forhøyet i sykdommen til en median nivå på 0,55% av blod leukocytter i CRC pasienter (0,66% i lokalisert sykdom og 0,40% i metastatisk sykdom). ROC-analyse førte til valg av en cut-off på 0,37%, noe som resulterte i en diagnostisk sensitivitet på 69% og spesifisitet på 81%. Den prediktive verdien av denne monocytt undergruppe ble ytterligere bekreftet ved multivariat regresjonsanalyse inkludert alle tilgjengelige parametre. Bortsett fra pasientens alder, mellom monocytter var den eneste signifikante uavhengige variabelen for kreft prediksjon. I denne sammenheng bør det bemerkes at de rekrutterte kollektiv av friske personer og kreftpasienter skilte seg i median alder (56 og 68 år, henholdsvis) – en skjevhet som er redegjort for i multivariat analyse
begrensning av. monocytt populasjoner i kreftdiagnose er gitt ved det faktum at variasjoner i monocytt tellinger i blod er også observert for andre tilstander, spesielt inflammatoriske sykdommer [20], [22]. Blodet profilen til monocytter undergrupper kan derfor gjenspeile en epiphenomenon relatert til svulsten. For å løse dette problemet, har vi sammenlignet leukocyttverdiene blant våre studiegrupper, siden en økning i leukocytter konsentrasjonen er vanligvis forbundet med smittsomme og inflammatoriske tilstander. Det var ingen signifikant forskjell mellom de friske individer og pasienter med kolorektal kreft undersøkt i vår studie (fig. S2). Videre blodnivåer av inflammatorisk markør C-reaktivt protein (CRP) var tilgjengelig fra rutine sykehus analyse av kreftpasienter. Mens CRP nivåer korrelerte signifikant med leukocyttverdiene (P 0,001; k = 0,474), var det ingen sammenheng mellom CRP nivåer eller leukocytter konsentrasjoner med mellomliggende monocytter teller. Disse funnene støtter ideen om at økt grad av mellom monocytter i kreftpasienter ikke ble indusert av uoppdagede betennelsestilstander i vår studie.
Tidligere publiserte analyser av kreftpasienter ble fokusert på enkle diskriminering mellom CD16-positive eller negative monocytter , dvs. var å kombinere de ikke-klassiske og mellomcellepopulasjoner i sin strategi for å avsløre. Den CD16 + monocytter undergruppe ble rapportert å være signifikant forhøyet hos pasienter med ondartet sykdom [36]. Spesielt en fersk studie på brystkreft viste at CD16 + monocytter var 1,7 ganger økt hos pasienter sammenliknet med friske kontroller. Forfatterne merket seg at nivåene var høyere i stadium I enn stadium II-IV sykdom [10]. Til sammenligning fant vi mellom CD14 ++ CD16 + monocytter undergruppe å være signifikant forhøyet hos pasienter med kolorektal kreft, men for å vise høyere tall i lokal enn metastatisk sykdom. I tillegg til frekvensen for mellom monocytter, deres midlere ekspresjon av CD16 økes, og dette kan forsterke deres evne til antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet [28].
ekspresjon av CD16 på monocytter kan induseres av cytokiner så som MCP -1 [10], TGF-β [37], eller M-CSF [11]. Omvendt, kan denne effekten bli blokkert av Th2-type cytokiner som IL-4 [12] og av GM-CSF [37]. Således er det tenkelig at økningen i mellomproduktet (CD14 CD16 ++ +) monocytter er mer aktivt utløses av den primære tumor, mens tumorprogresjon hos pasienter med metastatisk sykdom resulterer i en Th2-type cytokin miljø med motvirkende effekten. Når screening våre pasientkollektiver for MCP-1 i blodet vi ikke påvise noen økning eller sammenheng med hyppigheten av innsats monocytter. Imidlertid kan andre tumor-avledede faktorer står for det høyeste antall mellomliggende (CD14 CD16 ++ +) monocytter observert hos kreftpasienter. I tråd, vår
in vitro
analyser viste at inkubasjon av PBMC med svulst cellekultursupernatanter resulterer i rask induksjon av CD14 ++ CD16 + monocytter. Bemerkelsesverdig, var denne økning mindre uttalt i respons til kultursupernatanten fra de metastatisk cellelinjen SW620 avledet fra den samme pasient som primær carcinoma-cellelinjen SW480 eller urelatert primær CRC linje HT-29. Selv om disse
in vitro
eksperimenter ikke identifiserer opprinnelsen til CD14 ++ CD16 + monocytter induksjon
in vivo
, de støtter forestillingen om at mellom monocytter kan mer effektivt indusert i tidlige stadier av sykdommen.
CD16 + monocytter er angivelig hoved monocytt befolkningen i anti-kreft-respons og utskiller høye nivåer av TNF-α og IL-12 ved tumorcelleinteraksjon [38]. Imidlertid mangler funksjonell forskjell mellom ikke-klassiske og mellomliggende monocytter i denne sammenheng. Det faktum at mellom monocytter kan uttrykke pro-angiogene (og dermed potensielt pro-tumor) faktorer som Tie2, endoglin eller VEGFR-2 har bedt oss om å undersøke en bestemt undergruppe av mellom monocytter, den CD14 ++ CD16 + Tie2 + TEMS. Mens potente kreftfremmende effekter er påvist for TEMS i museforsøk [16], [39], kliniske studier på sin markør potensial i kreftpasienter er i stor grad mangler [17]. I tråd med en veldig fersk rapport om TEM frekvenser i kolorektal kreft [40], fant vi at TEMS ikke var signifikant forhøyet i blodet hos pasienter med kolorektal kreft og viste ingen sammenheng med den sirkulerende angiogenese faktorer ANG-2, sTIE1 og VEGF-A kjent for å regulere TEM rekruttering eller aktivitet [18]. Selv om vi ikke finner noen signifikant forskjell i TEM teller mellom friske individer og kreftpasienter, observerte vi en trend for høyere TEM nivåer i lokalisert sykdom. Den konklusjon at sirkulerende tems utgjør et dårlig diagnostisk markør for kolorektal kreft kan derfor være på grunn av en mindre økning i TEM-nivåer sammenlignet med mellomliggende monocytt teller i sykdom. En større kollektiv av deltagerne ville være nødvendig for å fastslå om denne forskjellen er statistisk signifikans.
I sammendraget, når man sammenligner mellom CD14 ++ CD16 + monocytter og CD14 ++ CD16 + Tie2 + temer i blodet hos 32 friske fag og 61 CRC pasienter, fant vi at mellom monocytter i motsetning til TEMS ble signifikant forhøyet i sykdom. Den høyeste frekvensen av CD14 ++ CD16 + celler var, intrigere, innspilt for lokalisert i motsetning til metastatisk sykdom som kan gjenspeile fortrinnsrett induksjon av mellom monocytter i de tidlige stadier av kreft – et konsept som ble støttet av
in vitro
studier. Hyppigheten av mellomliggende monocytter ble funnet å være en uavhengig prediktor for kolorektal kreft. Mens du tar i betraktning at mellom monocytter kan også være forhøyet i andre inflammatoriske tilstander, kan denne parameteren bevise et verdifullt tillegg til de etablerte CRC diagnose markører ved å reflektere tidlig immunrespons mot svulsten. Det representerer en mindre invasiv screening alternativ som videre bør vurderes i en større pasient kollektiv støtte for koloskopi og andre diagnostiske tester, særlig for å oppdage de tidlige stadier av sykdommen.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
