Abstract
Vitamin E inntak har vært innblandet i reduksjon av blærekreft risiko. Men mekanismene forblir unnvikende. Her rapporteres vi at δ-tokotrienol (δ-T3), en av vitamin E-isomerer, hadde den mest potente cytotoksiske kapasiteten mot humane blærecancerceller, sammenlignet med andre vitamin E-isomerer. δ-T3 hemmet kreft celle spredning og colonogenicity gjennom induksjon av G1 fase og apoptose. Western blotting-analyse avslørte at δ-T3 øket uttrykket nivåer av cellesyklus inhibitorer (p21, P27), pro-apoptotiske protein (Bax) og undertrykket uttrykk nivåer av cellesyklusen protein (Cyclin D1), anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 , Bcl-x
L og Mcl-1), noe som resulterer i caspase-3 aktivering og spaltning av PARP. Videre er δ-T3 behandling inhiberte ETK fosforylering nivå og indusert SHP-1-ekspresjon, som ble korrelert med nedregulering av STAT3 aktivering. I tråd med dette, δ-T3 redusert STAT3 proteinnivå i atomfraksjon, så vel som dens transkripsjon aktivitet. Knockdown av SHP-en delvis reversert δ-T3-indusert cellevekst arrest. Viktigere, lav dose av δ-T3 sensibilisert gemcitabin-indusert cytotoksiske effekter på human blære kreftceller. Samlet sett våre funn demonstrert for første gang, den cytotoksiske effekten av δ-T3 på blærekreftceller og foreslår at δ-T3 kan være en lovende chemosensitization reagens for gemcitabin i blærekreft behandling
Citation. Ye C, Zhao W, Li M, Zhuang J, Yan X, Lu Q, et al. (2015) δ-Tocotrienol induserer Menneskelig Blære kreft celle vekst Arrest, apoptose og Chemosensitization gjennom Hemming av STAT3 Pathway. PLoS ONE 10 (4): e0122712. doi: 10,1371 /journal.pone.0122712
Academic Redaktør: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, USA
mottatt: 02.12.2014; Godkjent: 13 februar 2015; Publisert: 07.04.2015
Copyright: © 2015 Ye et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og teknologi i folke~~POS=TRUNC Kina (2011CB944104), Natural Science Foundation of China National (81172009, 81372168) , Doctoral Fund of Ministry of Education of China (20110091120028) til Dr. J. Yan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er et stort klinisk problem over hele verden. Det er den nest vanligste typen av urinveiskreft i de utviklede landene, med estimering av 74,690 nye tilfeller og 15,580 dødsfall i USA i 2014 [1]. Dessverre er blærekreft også en av de mest tilbakevendende og dyre kreftformer, med $ 4000 millioner årlig kostnad på blærekreftpasienter i USA i løpet av 2010 [2-4]. Kirurgisk reseksjon, stråling og kjemoterapi er vanlige terapeutiske tilnærminger for blærekreft. Imidlertid er forskjellige bivirkninger assosiert med hver behandling, og enkelte kreftceller til slutt blir resistent. Derfor er det viktig å utvikle nye strategier for å bekjempe blærekreft, inkludert komplementære behandlinger som kan brukes i kombinasjon med nåværende behandlinger.
Vitamin E inntak er omvendt relatert til blære kreftrisiko blant eldre personer eller tunge røykere fra flere epidemiologiske studier [5,6]. Begge tokoferoler (TP) og tokotrienoler (T3) hører til vitamin E-familien, og hver av underfamilien er sammensatt av fire isomerer: α-, β-, δ- og γ. Den største forskjellen mellom TP og T3 er strukturen i sine sidekjeder, med farnesyl for T3 og mettet fytyl for TP [7-9]. Sammenlignet med TPer, som vanligvis finnes i bladene og frøene av de fleste planter, T3s er mindre rikelig og hovedsakelig finnes i palmeolje og ris kli. To kliniske studier på kvinner Health Study (WHS) prøving og selen Vitamin E og prostatakreft Kjemoprevensjon Trial (VELG), ble utført for å undersøke kreftforebygging eiendom α-TP [10,11]. Verken studien viste signifikant effekt av α-TP mot lunge, brystkreft og tykktarmskreft hos kvinner og prostatakreft hos menn. Derfor har forskjellige T3 isomerer fremkalt mer forskning oppmerksomhet den siste, på grunn av deres potensielle anvendelse som ikke-giftig kost middel mot kreft [12-14]. Blant dem, δ-T3 viste sterk effekt mot ulike typer kreft, inkludert bukspyttkjertelen, tykktarmskreft og brystkreft [15-17]. Men om δ-T3 innehar anticancer aktivitet mot blærekreft er ennå ikke utforsket.
Aktiveringen av signal Svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) blir ofte detektert i forskjellige krefttyper, inkludert blærekreft [18 ]. Fosforyleringen av 705 tyrosinrest i STAT3 protein, som er en viktig begivenhet for sin aktivering, fører til dannelse av STAT3 homodimerer og translokasjon inn i kjernene. Nuclear lokalisert STAT3 dimer binder seg til arrangører av ulike mål gener og regulerer sine transkripsjoner, som er involvert i kreftcelle spredning, overlevelse og invasjonen [19]. Videre er det rapportert at UV-indusert celle apoptose kan bli undertrykt ved STAT3 aktivering; mens STAT3 inhibering induserer Caspase avhengig apoptose og hemmer cellemigrering og angiogenese i kreftceller [20,21]. Fersk undersøkelse videre avdekket at konstitutivt aktivert STAT3 i urotelialceller akselererer utviklingen i muskel-invasiv blærekreft, noe som indikerer at STAT3 spiller en avgjørende rolle i blærekreft utvikling [22].
I denne studien har vi observert sterkere cytotoksisitet av δ-T3 på menneskeblærekreftcellelinjer enn ikke-maligne udødeliggjort urotelialceller. Mekanistisk viste vi at δ-T3 sperret ETK aktivering og oppregulert SHP-1-ekspresjon, som er korrelert med undertrykkelse av STAT3 signalveien. Vi viste også lav dose av δ-T3 forbedret følsomheten av blæren kreftceller til kjemoterapeutiske agent -. Gemcitabin
Materialer og metoder
Reagenser og cellelinjer
Alle kjemikalier og reagenser ble anskaffet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) med mindre annet er angitt. α-, γ-, δ-T3 og α-tokoferol (α-TP) ble vennlig levert av Davos Life Science Ltd (Synapse, Singapore). Gemcitabin var fra Eli Lilly Company (Indianapolis, IN). BCL-2, Bcl-x
L, Mcl1, PARP, pro-Caspase-3, pSTAT3 (Y705), pETK (Y40), Stat3, og SHP-1-antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers , MA). ETK, P21 og P27 antistoffer var fra BD Biosciences (San Jose, California). P-Actin antistoff ble kjøpt fra AbMax Bioteknologi Company (Beijing, Kina). Bax antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Den ikke-ondartet udødelig urothelial cellelinje SV-HUC-en, blærekreft cellelinjer T24, 5637, J82 og UMUC-tre ble hentet fra Cell Bank, Type Culture Collection, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 supplementert med 10% FBS, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler dyrkes in ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. Som for siRNA forstyrrer analysen, SHP-en målretting siRNA: 5′-GAGAACGCUAAGACCUACAtt-3 «og kontroll siRNA: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3» ble transfektert inn i kreftceller ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen), henholdsvis
. celleviabilitet assay
for celleviabilitet studium, 1,5 x 10
3 blærecancerceller ble platet ut i hver brønn av en 96-brønns plate. Cellene ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner (50, 100, 150, 200 uM) av de vitamin E-isomerer av 24, 48 og 72 timer. Etter behandling, ble 10 ul av 5 mg /ml MTT-oppløsning tilsatt til hver brønn og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 3 timer. De formazankrystaller ble deretter resuspendert i 100 ul DMSO og absorbansen ved 490 nm ble målt. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger, og vekstkurvene viste midler og standardavvik.
kolonidannelse assay
Etter 14 dagers inkubasjon av 100 uM α-TP, α-T3, γ- T3 og δ-T3, kolonier ble fiksert med 100% metanol, og farget med 0,5% krystallfiolett. Bare kolonier med 50 celler ble talt. Hver behandling ble gjentatt i triplikat.
Strømningscytometri-analyse
Celler ble inkubert med angitte konsentrasjoner av δ-T3 i 48 timer før prøver ble fiksert med 70% etanol. Celler ble inkubert i 10 mg /ml RNase A inneholdende PBS i 30 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av tilsetning av 1 mg /ml propidium jod (Sigma). Etterpå ble cellene analysert ved anvendelse av en fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) Calibur strømningscytometer (BD FACS Calibur, BD Biosciences, San Jose, CA).
Apoptose analyse
Annexin V /propidium jodid (PI) farging ble utført ved hjelp av Alexa Fluor 488 Annexin V /død celle apoptose Kit (Invitrogen, Cat # V13245, Inc., Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens retningslinjer. I korthet, 1×10
6-celler ble trypsinert, etterfulgt av resuspensjon i 100 ul bindingsbuffer og inkubert med 1,0 ul PI og 5,0 ul av Annexin V-fluorescein isotiocyanat i 15 minutter i mørket ved romtemperatur. Etterpå ble cellene oppdaget ved hjelp av FACS Calibur Instrument (Becton Dickinson) og analysert ved hjelp av FlowJo 7.6 software.
Sanntids revers-transkripsjon polymerase chain reaction analyse
Total RNA ble ekstrahert med Trizol (Invitrogen ). Uttrykket nivåer av
BCL2
,
bclxl og mcl1
genene ble oppdaget av kvantitativ revers-transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR). Primerne er oppført som følger:
BCL2
: fremover, 5′-CGTACAGTTCCACAAAGGCA-3 «og omvendt, 5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3»;
bclxl
: fremover, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3 «og omvendt, 5′-TTCAGTGACCTGACATCCCA-3»;
mcl1
: fremover, 5′-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3 «og omvendt, 5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3»;
β-actin
ble anvendt som en intern kontroll. Primerne for
p-aktin
var 5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3 «og 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3». qPCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn (Takara Bioteknologi Co Ltd, Dalian, Kina) dye gjenkjenning metoden på ABI StepOne Sequence Detection System i henhold til standardvilkårene: 95 ° C i 10 min og 40 sykluser på 95 ° C i 5 s og 55 ° C i 31 S. Comparative Ct metoden ble brukt for kvantifisering av transkripsjoner.
Western blotting-analyse
Celler ble lysert i en RIPA buffer som inneholder proteasehemmer cocktail tablett (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) og fosfatase-inhibitor cocktail I (Sigma). Cellelysater (20 mikrogram) ble løst på SDS-PAGE og overført til PVDF membran. Etter blotting i 5% fettfri tørrmelk i fosfatbufret saltvann inneholdende 0,1% Tween-20 (PBST), ble membranene inkubert med primære antistoffer ved 1: 500 til 1 000 fortynning i PBST eller 5% BSA over natten ved 4 ° C ifølge produsentens instruksjoner. Blottene ble vasket og inkubert med pepperrotperoksydase-konjugert sekundært antistoff i 1 time, og til slutt detektert av ECL-reagens (Thermo Scientific).
luciferase aktivitetsanalyse
Effekten av δT3 på STAT3 responsive Elementer som inneholder promoter (STAT3-Luc) aktivitet ble analysert ved hjelp av et luciferase-assay. T24-celler (2,5 x 10
5 per brønn) ble sådd ut i 24-brønners plater. Etter dyrking over natten ble cellene transfektert med lipofektamin 2000 (Invitrogen) med 0,5 ug STAT3-Luc og 1 ng av TK-Renilla luciferase plasmid. Etter 24 timer med transfeksjon, ble cellene inkubert med δT3 i 24 timer og høstet. Luciferase-aktivitet ble målt ved bruk av dual luciferase-analysesystemet (Promega) og påvises ved å bruke Victor mikroplateleser (Perkin-Elmer).
Nuclear ekstrakter fremstilling
T24-celler ble sådd ut i 10 cm plate, etterfulgt av behandling med 150 pM δ-T3 i 24 timer. Cellene ble høstet ved trypsinering og vasket to ganger med iskald PBS. Cellepelleten ble forsiktig resuspendert i 4X volumer iskald hypotonisk lyseringsbuffer (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl
2, 10 mM KCl, 0,3% NP-40, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM DTT) med proteasehemmere (Roche), og holdt på is i 30 min. Celler ble holdt i bufferen før de har hovne. Cellelysatene ble sentrifugert i 10 minutter ved 10 000 x g. Supernatantene ble cytosoliske ekstrakter. Suspender bunnfallet (kjernefraksjon) i 4X volumer av sterk protein lyseringsbuffer (10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl
2, 420 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 25% glyserol, 0,5 mM DTT) med protease inhibitor i 15 minutter. Supernatanten ble samlet opp som kjerneprotein ved sentrifugering ved 12 000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C.
Chromatin immunoutfelling (chip)
ChIP-analysen ble utført ved bruk av ChIP analysesett (Kat. 17- 295, Millipore), i henhold til produsentens instruksjoner. Etter nukleære ekstrakter ble isolert slik det er vist ovenfor, antistoff mot STAT3 (CAT # 9139, Cell Signaling Technology) ble anvendt for å immunoutfelle kromatin i atomfraksjoner, mens en ikke-spesifikk IgG-antistoff ble anvendt som en teknisk negativ kontroll. Målinger ble gjort i tre eksemplarer og utført av Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (AppliedBiosystems, Carlsbad, CA, USA). Sekvensene av primere som brukes for chip-qPCR analyse av
bclxl gen
arrangøren er som følger: BCL-XL-primer 2F 5′-CTGGGTTCCCTTTCCTTCCA-3 «, BCL-XL-primer 2R 5»-TCCCAAGCAGCCTGAATCC -3 «[23]; BCL-XL-primer 1F 5»-CCCTTGCAGCTAGTTTTCTA-3 «, BCL-XL-primer 1R 5′-TGAATTCTGAGGCCAAGGGAA-3′; Bcl-xL-primer 5»-NCF TGCCAGGCCTTCGCTCAA-3 «, Bcl-xL-primer NCR 5-CAGATAAACTCTGTCCACAGA-3». Primer satt en er 954 bp nedstrøms fra transkripsjon start stedet, mens primer sett to er 1277 bp nedstrøms fra TSS, som dekker et konservert STAT3 bindende motiv spådd av nettsiden (www.dcode.org). Primer NC er lokalisert på 1880 bp nedstrøms fra den siste exon, som tjener som en negativ kontroll.
Statistisk analyse
Alle numeriske verdier er representert som gjennomsnittet ± SD. Student uparet t-test ble anvendt for statistisk analyse. Betydning ble angitt som
P
0,05.
Resultater
cytotoksiske effekten av vitamin E isomerer på blæren kreftceller
For å undersøke hvilke vitamin E isomerer har cytotoksiske effekter på menneskeblærekreftceller
in vitro
, behandlet vi fire mest brukte human blære kreft cellelinjer, T24, 5637, J82 og UMUC-3. Disse fire cellelinjer inneholder ulike grader av genetisk kompleksitet, som dekker de vanligste genetiske mutasjoner funnet i humane blærekreft prøver. Disse inkluderer inaktivering av TP53 og RB1, aktivering av K-Ras og H-Ras eller tap av PTEN (www.atcc.org). Resultatene viste at både γ- og δ-T3 vises anti-kreft effekt på en konsentrasjonsavhengig måte, mens α-T3 samt α-TP viste ingen cytotoksiske effekter innen området av doseringer som vi har testet (Fig 1A ). For å teste cytotoksiske effekten av vitamin E isomer på normale blære celler, vi behandlet også SV-HUC-en, en udødelig ikke-ondartet urothelial celle med vitamin E isomerer. Av notatet, γ- og δ-T3 utøves mindre toksisitet på ikke-ondartet blære epitelceller (fig 1A). I tillegg er behandling av δ-T3 og T3-γ også betydelig redusert kolonitall, sammenlignet med a-T3 og α-TP (fig 1B). Ved anvendelse av MTT-analysen og kolonidannelsesbestemmelsen, demonstrerte vi at rekkefølgen av inhibitorisk effekt av vitamin E-isomerer er δ-T3 γ-T3 α-T3 og α-TP i alle fire humane blærecancercellelinjer; Derfor ble δ-T3 valgt for videre studier.
(A) Menneske blærekreftceller T24, 5637, J82 og UMUC-3, så vel som ikke-maligne humane urothelial SV-HUC-1-cellene ble behandlet med hver vitamin E-isomerer (α-TP, α-T3, γ-T3 og δ-T3) mellom 0 og 200 pM i 72 timer og cellelevedyktigheten ble påvist ved MTT-analyse. (B) kolonidannelse analyse av T24 5637, J82 og UMUC-3-celler med 100 uM α-TP, α-T3, γ-T3 og δ-T3 til 14 dager. Vertikale linjer indikerer middelverdien legemer ± SD i hver behandlingsgruppe. *,
P
0,05; ***,
P
0.001, sammenlignet med kjøretøy behandlingsgruppen.
δ-T3 fører G1 arrest og apoptose
For ytterligere å demonstrere anti-kreft effekt av δ-T3, vi analyserte cellesyklus distribusjon av flowcytometri (fig 2A-2D). T24 og 5637-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av δ-T3 (0, 50, 100 og 150 uM) i 48 timer. Flowcytometri analyse viste at δ-T3 behandling (≥ 100 mm) indusert G1 fase arrest og reduksjon av cellepopulasjonen i S-fasen. Videre apoptotisk cellepopulasjonen (sub-G1) økte på en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2A-2D). For ytterligere å karakterisere induksjon av apoptose, utførte vi Annexin V /PI farging assay. Som vist i figur 3, δ-T3 behandling indusert apoptotisk indeks i begge T24 (figur 3A) og 5637 (figur 3B) celler i en konsentrasjonsavhengig måte.
Cellene ble behandlet ved δ-T3 som strekker seg fra 0-150 uM i 48 timer. Cellesyklus distribusjon og under G1-forhold ble bestemt ved flow-cytometri. *,
P
0,05; **
P
0,01; ***,
P
0.001.
Annexin V /PI-analyse viste at δT3 indusert apoptose i T24 (A) og 5637 (B) blærekreftceller, sammenlignet med vehikkelbehandlede kontrollceller.
δ-T3 induserer cellesyklus inhibitorer og ned-regulerer pro-overlevelsesreaksjonsveien
Western blotting-analyse ble utført for å ytterligere undersøke uttrykket nivåer av proteiner involvert i cellesyklus og apoptose. Etter 24 timers behandling med δ-T3 ved forskjellige konsentrasjoner i T24 og 5637 celler, vi har observert de økte uttrykk nivåer av cellesyklus-hemmere, p21
Waf1 /Cip1 og p27
Kip1, og redusert uttrykk nivåer av Cyclin D1 ( figur 4A). Videre δ-T3 behandling aktivert også pro-Caspase-3, og resulterte i PARP-spaltning (figur 4B). Siden aktiveringen av caspase-3 kan være via mitokondrie vei, testet vi apoptose-relaterte proteiner på mitokondriene. Som vist på figur 4C, ekspresjonsnivået i den pro-apoptotiske protein, ble Bax forbedret; På den annen side, anti-apoptotiske proteiner, BCL-2, Bcl-x
L og Mcl-en ble undertrykt på δ-T3 behandling. Som vist i S1 Fig, spaltingen av apoptotiske markører (Caspase-3 og PARP), induksjon av pro-apoptotiske Bax protein, så vel som reduksjon av anti-apoptotiske proteiner ble også bekreftet i ytterligere to blærecancercellelinjer (J82 og UMUC-3).
Western blotting-analyse av cellesyklusen (A), apoptose (B) og andre apoptose-relaterte (C) proteinnivåene i T24 og 5637-celler, ved den δ-T3 behandling for 24 h. β-Actin ble brukt som lasting kontroll.
δ-T3 dephosphorylated ETK og oppregulert SHP-en for å undertrykke STAT3 signale
For ytterligere å dissekere effektene av δ-T3 på nedstrøms signalering, analyserte vi STAT3 signalveien, som er en av de store anti-apoptotiske reaksjonsveier, overdragelse overlevelse og kjemo-motstand av blærecancerceller mot forskjellige kjemoterapeutiske midler [18-21]. Vi fant at δ-T3 trykkes fosforylering nivået av STAT3 (Y705) på en konsentrasjonsavhengig måte i begge T24 og 5637 blærecancercellelinjer (figur 5A). Aktivering av STAT3 reguleres av oppstrøms kinaser og fosfataser. I blærekreft, er epiteliale og endoteliale tyrosin kinase (ETK) ofte overuttrykt [24]. Som en ikke-reseptor tyrosinkinase er ETK aktivering /uttrykk som er nødvendig for STAT3 aktivering i kreftceller. I tråd med dette, observerte vi at den aktive formen av ETK (fosforylering ved Y40) ble redusert med δ-T3 behandling, med start fra den konsentrasjon av 50 uM i begge T24 og 5637-celler. Videre δ-T3 påfallende indusert ekspresjon nivået av protein tyrosin fosfatase SHP-1, som virker som en negativ regulator for STAT3 aktivering (figur 5B). Nukleær translokasjon av STAT3 er viktig for dens funksjon som transkripsjonsfaktor. De nukleære og cytosol fraksjoner av protein lysatet fra δ-T3 behandlede celler ble separert. Ved δ-T3 behandling, ble STAT3 proteinnivå i kjerner ble redusert i T24-celler (figur 5C). For ytterligere å bekrefte reduksjon av kjernefysisk STAT3 belegg på sine mål gener, utførte vi ChIP analyse ved hjelp av antistoff mot STAT3. Som vist i figur 5D, δ-T3 betydelig redusert rekrutteringen av STAT3 på dets bindingsseter i
bclxl
locus av 5,55 folder (primersett 1) og 5,93 folder (primersett 2), mens negativ kontroll primersett (NC) ikke vist noen forskjell. I samråd med dette resultat, ble den transkripsjonelle aktivitet av STAT3-responsive promoter signifikant undertrykt av δ-T3 behandling i et luciferase reporter-analyse (figur 5E). Videre QRT-PCR resultater viste at tre Stat3 direkte målgener (
BCL2
,
bclxl Hotell og
mcl1
) ble nedregulert på mRNA nivåer i begge to blærekreft cellelinjer (figur 5F), noe som indikerer at reduksjonen er hovedsakelig på grunn av transkripsjonsregulering. For å undersøke om SHP-1 er viktig for STAT3 aktivering indusert celleoverlevelse, vi slått ned endogen SHP-1 av RNA interferens (Fig 5G) og funnet ut at det depletion delvis opphevet δ-T3 indusert toksisitet for T24 celler (Fig 5H). Dette bekreftet også at δ-T3 indusert blærekreft celleproliferasjon hemming delvis gjennom SHP-en induksjon. Tatt sammen, våre data viste at δ-T3 behandling minsket fosforyleringen nivå sammen med den nukleære translokasjonen av STAT3 protein, noe som resulterer i den transkripsjonelle reduksjon av dens nedstrøms målgener i humane blærecancerceller.
Western blotting-analyse av de STAT3 /ETK signalveien relaterte (A) og SHP-1 (B) proteinnivåer i T24 og 5637-celler under δ-T3 behandling i 24 timer. Vestlige band ble kvantifisert av Image J programvare og sifrene som vises under den øvre panelet var de relative Stat3 uttrykk nivåer normalisert ved lasting kontroller. (C) Reduksjon av kjerne STAT3 proteinnivå ved behandling av 150 uM δ-T3 i T24-celler. LaminB1 ble brukt som en kjernefysisk lasting kontroll. Tubulin ble anvendt som en cytoplasmatisk lastekontroll. (D) Genomisk strukturen i
bclxl
genet ble vist, med etikettene av tre primer sett for ChIP analysen. Primer sett 1 og 2 inneholder STAT3 bindende element; mens primersett 3 (NC) tjener som negativ kontroll. STAT3 belegg i
bclxl
promoter i blærekreft cellelinje T24 behandlet med 150 mikrometer δ-T3 eller kjøretøy i 18 timer, ble analysert av Chip analysen. Input DNA og immunopresipitert DNA ble analysert ved qPCR analyser med primersett avbildet ovenfor og normalisert ved IgG-kontroll. Feilen linjen viser gjennomsnitt ± SD. ***,
P
0,001. (E) δ-T3 behandling reduserte Stat3 nedstrøms målgener (
BCL2
,
bclxl Hotell og
MCL-en
) uttrykk på mRNA nivå. (F) Luciferase-aktivitet analyse av STAT3-Luc ved behandling av 150 uM δ-T3 i T24-celler i 24 timer. TK-Renilla luciferase plasmid ble benyttet som intern kontroll. (G) knockdown effektivitet av SHP-1 i T24-celler ved Western blotting-analyse. p-aktin ble benyttet som intern kontroll. Sinc, negativ kontroll siRNA. siSHP-en, siRNA rettet mot å SHP-1. (H) T24-celler ble behandlet med siRNA til SHP-1 eller sinc, etterfulgt av behandling med δ-T3 eller kjøretøy. Cellelevedyktigheten ble testet ved MTT-analyse. **
P
0,01; ***,
P
0,001.
Lav konsentrasjon av δ-T3 forsterket apoptotisk effekt av gemcitabin på T24 blærekreftceller
Gemcitabin er førstelinje kjemoterapi for blærekreft [25,26]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt lav konsentrasjon av δ-T3 kan øke følsomheten av blærecancerceller til gemcitabin. MTT-analysen viste at behandlingen av 25 uM δ-T3 forsterket den cytotoksiske effekt av gemcitabin på T24, 5637, J82 og UMUC-3 cellelinjer (figur 6A og S2 Fig). Flowcytometri data av Annexin V /PI costaining viste at kombinert behandling økte den apoptotiske effekt, sammenlignet med Gemcitabin behandling alene. Den apoptotiske satsen økt fra 34,6% og 19,28% i gemcitabin-behandlede celler til 53,3% og 28,4% i det sammenslåtte behandlet T24 og 5637 celler, henholdsvis (figur 6B). Kolonidannelse analyse viste også at behandling av gemcitabin pluss δ-T3 undertrykte betydelig kolonidannelse kapasitet av T24 kreftceller (figur 6C). Som vist i figur 6D, samtidig behandling med lave konsentrasjoner av δ-T3 og gemcitabin påfallende indusert Bax og trykt Bcl-xL og Bcl-2, sammen med tilstedeværelsen av PARP spaltning. Konsekvent, også har vi funnet at samtidig behandling redusert fosforylering nivå av ETK, indusert SHP-1 uttrykk og hemmet deres nedstrøms STAT3 aktivering (Fig 6E).
(A) T24 og 5637 celler ble inkubert i 48 timer i nærvær av 25 uM δ-T3 og /eller 0,08 uM GEM. Deretter ble den prosentandel av cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analyse. (B) T24 og 5637-celler ble dyrket i 48 timer i fravær eller nærvær av 25 uM δ-T3 og /eller 0,08 uM GEM, henholdsvis. Apoptotiske rater ble analysert ved hjelp av Annexin V /PI farging assay. (C) Kombinert behandling med GEM (0,08 uM) og δ-T3 (25 uM) i 14 dager fullstendig eliminert den kolonidannelse kapasiteten til T24 celler. (D) Western blotting-analyse av apoptose-relaterte og STAT3 signale-relaterte proteinnivåer i T24-celler, behandlet med δ-T3 og /eller GEM i 48 timer. (E) Western blot-analyse av STAT3 signal-relaterte proteinnivåer i T24-celler, behandlet med δ-T3 og /eller GEM i 24 timer. **
P
0,01; ***,
P
0,001.
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om den cytotoksiske effekten av δ-T3 på menneske blæren kreftceller. I sammenligning med andre vitamin E-isomerer, våre resultater viste at både δ- og γ-T3 er potente inhibitorer i blærekreft celleproliferasjon. I motsetning til dette trenger α-T3 og α-TP ikke har anti-kreft effekt overfor blærekreftceller under de samme eksperimentelle innstillinger. Selv om både δ- og γ-T3 ha sterk cytotoksisitet mot blærecancerceller, δ-T3 synes å være mer potent enn y-T3, noe som tyder på at det er mer bioaktivt. Dette stemmer overens med observasjonene når δ-T3 anvendes i behandling av andre krefttyper, inkludert lungekreft og kreft i bukspyttkjertelen [13,15,27]. Videre, i forhold til y-T3, det er mindre kjent om anti-kreft-effekter av δ-T3. Derfor ville det være interessant å undersøke om δ-T3 kan potensielt bli brukt som en av de ledende vitaminer for chemoprevention og behandling av blærekreft.
I denne rapporten har vi videre vist at δ-T3 hemmet STAT3 signale veien, noe som spiller en kritisk rolle i kreftcellevekst og overlevelse. Det er rapportert at STAT3 ofte aktivert i forskjellige krefttyper, inkludert blærekreft. Ved å bruke fosforylering nivå STAT3 på Y705 som surrogatmarkør, Lin og kolleger fant at STAT3 er overactivated i 19% menneskelig blærekreft vev (
n
= 100) [28]. Weissmann og medarbeidere fant at pSTAT3 forhøyet i kreft stilk cellepopulasjonen i UBC prøver, noe som tyder på at aktivering av STAT3 spiller en rolle i opprettholdelsen av kreftcellen stemness [29]. I tråd med disse, transgen uttrykk for STAT3 i basal celler av mus blæren epitel akselerert progresjon fra carcinoma
in situ
til invasiv blærekreft etter kreftfremkallende nitrosamin behandling, sammenlignet med villtype mus under samme behandling [22 ]. Av notatet, avbrudd av STAT3 signalveien ved enten knockdown STAT3 eller overekspresjon av dominerende negativ form for STAT3 induserer cellevekst og apoptose [30], noe som indikerer at målretting STAT3 signalering er et lovende terapeutisk tilnærming for blærekreftpasienter.
Aktivering av STAT3 er regulert av oppstrøms kinaser og phosphotases. ETK, også kjent som BMX, er et medlem av Tec familien av ikke-reseptor-tyrosin-kinase. Den inneholder flere kritiske områder, inkludert Plekstrin homologi (PH), Tec homologi (TH), Src-homologi SH3, SH2 og SH1 kinase domene. Forhøyet uttrykk for ETK er påvist i huden hyperplasi og prostatakreft [31,32]. Nylig, ETK ble foreslått for å brukes som en biomarkør for å forutsi overlevelse av pasienter med cystektomi i blærekreft [24]. Dens onkogene funksjon har vært knyttet med sin samhandling med og aktivering av STAT3 [24,33]. Som overexpressed i glioblastom stamceller (GSCs), aktiverer ETK STAT3 å opprettholde selvfornyelse og tumorigent potensialet GSCs [34]. Videre knockdown av ETK undertrykker aktivering av STAT3 i to blærekreft cellelinjer T24 og UM-UC-3 [24], noe som indikerer at ETK funksjoner oppstrøms av STAT3 i blæren kreftceller.
I tillegg SHP- 1 er en ikke-transmembran PTP som fungerer som en negativ regulator av STAT3 veien [35]. Som en tumor suppressor, er arrangøren av SHP-en ofte hypermethylated i leukemi og lymfom celler [36]. Vi først rapportert at δ-T3 induserer SHP-1 på en doseavhengig måte i blærecancerceller. Siden γ-T3 også indusere SHP-1-ekspresjonen for å inhibere STAT3 signalering ved myelom og hepatocellulære karsinomceller [36,37], både γ- og δ-T3 kan fungere på en lignende måte for å inhibere STAT3 signalering ved å indusere SHP-1-ekspresjon. I samsvar med den undertrykkelse av STAT3 veien, noe som er svært relevant for blære karsinogenese [22], undertrykkelse av STAT3 ble ytterligere bekreftet ved reduksjon av dets nedstrøms mål, slik som Bcl-2, Bcl-x
L og Mcl- 1, både på mRNA og proteinnivå. Cellular fraksjonering med Western blotting og luciferase assay bruker STAT3-Luc plasmid bekreftet at δ-T3 påvirker STAT3 aktivisering gjennom hemming av sitt atom translocalization å indusere sine mål gener. Disse dataene ytterligere bekreftet ved inhibering av STAT3 signalveien ved δ-T3.
Gemcitabin er ofte brukt kjemoterapeutisk medikament til behandling av blærekreft. Vi har funnet at en lav dose av δ-T3 forbedret Gemcitabin-indusert apoptose. Sammenlignet med Gemcitabin behandling alene, samtidig behandling med δ-T3 og gemcitabin påfallende undertrykket aktiveringen av ETK, STAT3 og induksjon av SHP-1. Dette underbygger at S-T3 forsterker gemcitabin mediert apoptose gjennom induserende cellene i SubG1 befolkningen etterfulgt av spalting av PARP. Konsekvent, Kanai
et al
funnet at vitamin E succinate indusert blærekreft celle apoptose og forbedret chemosenstivity til paclitaxel [38]. 0,01;
