Abstract
metastaser og medikamentresistens er store barrierer for behandling av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). For å utforske nye terapeutiske muligheter, vi lykkes innkapslet mikroRNA-34a (MIR-34a), en potent endogen tumor suppressor i NSCLC inn S6 aptamer-konjugert dendrimer å danne lungekreft målrettet genet levering nanopartikler (PAM-AP /pMiR-34a NPs) . PAM-Ap /pMiR-34a NPS hadde en diameter på 100-200 nm og Zeta potensial på -30 mV til anvendt N /P-forholdet. Den aptamer konjugering betydelig forbedret cellulært opptak samt genet transfeksjon effektiviteten av PAM-AP /pMiR-34a NPs i dyrkede NSCLC celler. Vi viste at PAM-Ap /pMiR-34a NPs forbedret regulering av målrettede gener, BCL-2 og p53
in vitro
. I tillegg avslørte vi PAM-Ap /pMiR-34a NPS signifikant hemmet cellevekst, migrasjon, invasjon og induserte apoptose av lungekreftceller sammenlignet med ikke-målrettede NPS. Metoden ga en roman terapeutisk strategi for eksperimentell behandling av NSCLC
Citation. Wang H, Zhao X, Guo C, Ren D, Zhao Y, Xiao W, et al. (2015) Aptamer-dendrimer Bioconjugates for målrettet levering av MIR-34a uttrykke Plasmid og Antitumor effekter i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 10 (9): e0139136. doi: 10,1371 /journal.pone.0139136
Redaktør: Valentin Cena, Universidad de Castilla-La Mancha, Spania
mottatt: 5 mai 2015; Godkjent: 08.09.2015; Publisert: 25.09.2015
Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Science and Technology Development Plan Prosjekt i Shandong-provinsen (2013WS0273). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i verden [1]. Omtrent 85% av alle kliniske lungekreft tilfellene er ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [2, 3]. Til tross for mange fremskritt innen kirurgisk behandling, kjemoterapi og molekylære målrettede midler for NSCLC, metastaser og multiresistens er fortsatt viktige årsaker til svikt i behandling av lungekreftpasienter [4, 5]. Det er således meget ønskelig å utvikle nye terapeutiske tilnærminger utover konvensjonell behandling for NSCLC. MicroRNAs (mirnas) har vist seg å spille en viktig rolle i utviklingen av kreft hos mennesker og kan være effektive mål for kreftbehandling [6]. Mirnas er små RNA av ~ 22 nukleotid lang som er kritiske regulatorer av genuttrykk [7]. Moden mirnas mål-mRNA i det komplementære områder, noe som fører til mRNA degradering og translasjonelle undertrykkelse [8, 9]. Blant mer enn 700 mennesker mirnas identifisert, er MIR-34a en transkripsjonen mål av tumor suppressor p53 [10], og nedregulert MIR-34a uttrykk korrelerer med en høy sannsynlighet for tilbakefall hos NSCLC pasienter [11]. Videre overekspresjon av MIR-34a hindrer vekst og metastasering av NSCLC ved å regulere flere tumordempere eller onkogener, slik som p53, BCL-2, c-Met og CDK4 [12]. Tidligere rapporter avdekket at overekspresjon av MIR-34a kan hindre progresjon og metastasering av NSCLC, samt øke kjemoterapi følsomhet.
Utviklingen av miRNA-baserte legemiddelselskap har blitt et lovende alternativ strategi til konvensjonell behandling, inkludert kjemoterapi og strålebehandling for NSCLC behandling. Imidlertid er klinisk anvendelse av mirnas møter mange biologiske utfordringer, slik som rask blodklaring, dårlig stabilitet i serum og utilstrekkelig cellulært opptak [13]. Tumor målretting nano-avleveringssystemer er blitt utviklet for å overvinne disse problemene [14, 15]. Gene-lastet nanocomplexes anses å være en bedre plass for kreftbehandling på grunn av deres passive opphopning i solide svulster ved deres forbedret permeabilitet og oppbevaring (EPJ) egenskaper i den raskt voksende svulster [16]. Funksjonalisering av de polymerer med spesifikke celle-målsøkende ligander kan forbedre deres tumor akkumulering mer enn EPR effekt [17], som forbedrer transfeksjonseffektivitet og biokompatibilitet av disse genene belastede nanocomplexes.
polyamidoamin (PAMAM) er kationiske forbindelser med dendrittisk struktur. Gjennom elektrostatiske interaksjoner, PAMAM og negativt ladede pDNA danner nanocomplexes som er mye brukt som ikke-virale vektorer genet for å transfektere eksogent DNA eller RNA i celler [18]. Viktigere, kan molekylet vekt og ladetettheten PAMAM lett manipuleres til å ha overlegen sikkerhet. Hittil har en rekke forskjellige potensielle biomarkører for lungekreft blitt identifisert, slik som EGFR, TP53, CA-125 og CEA, men fraværet av spesifisitet og sensitivitet var fremdeles et problem i praksis for målrettet medikamentavlevering [19].
aptamerer er korte, enkeltstrengede oligonukleotider (DNA eller RNA) som er valgt fra SELEX prosess (systematisk utskilling av ligander av eksponensiell anrikning). Sammenlignet med antistoffer, fordelene ved aptamerer er tydelig, slik som praktisk syntese og modifikasjon, høy affinitet og spesifisitet for målmolekylene, lav immunogenisitet, lavere toksisitet, bedre stabilitet og penetrasjon hurtig vev [20, 21]. Derfor kan aptamer-konjugert nanocomplexes levere oligonukleotider i en celletype spesifikk måte med forbedret transfeksjonseffektiviteten og /eller reduserte bivirkninger til normale celler [22]. Flere cellespesifikke aptamerer har vært brukt for genavlevering, men en aptamer-konjugert Nanokompleks brukes i behandling av NSCLC er begrenset. I vårt arbeid har vi utviklet PAMAM-PEG-aptamer tilkobling (PAM-Ap) med S6, en aptamer valgt mot A549 lungekreft celler ved celle-SELEX [23] og vedtok å functionalize PAMAM G5.0, så vi blandet PAM- Ap med pMiR-34a å konstruere PAM-Ap /pMiR-34a nanopartikler (PAM-Ap /pMiR-34a NPs) for å levere fra pDNA til lungekreft celler. Neste vurderes vi genet transfeksjon effektivitet og antitumor effekt av PAM-AP /pMiR-34a NPs i A549 celler. Våre data viser Aptamer-dendrimer bioconjugates system er en effektiv måte å levere MIR-34a uttrykker plasmid til ikke-småcellet lungekreft celler.
Materialer og Metoder
Material
polyamidoamin (PAMAM, etylendiamin kjerne, G5.0) og 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Maleimide polyetylenglykol succinimidyl ester (Mal-PEG-NHS, Mw 2000) ble kjøpt fra Bio-matrise Inc. (Jiaxing, Kina). Gelred
TM DNA gel stain ble kjøpt fra Biotium (CA, USA). Føtalt bovint serum (FBS), RPMI-1640 dyrkningsmedium, Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS), trypsin, penicillin-streptomycin og YOYO-1-jodid ble innkjøpt fra Invitrogen /Life Technologies (Carlsbad, CA). Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) farging kit var fra BD Biosciences (San Jose, CA). Celletelling Kit 8 (CCK-8), RIPA protein lysis buffer og BCA protein assay kit ble kjøpt fra Beyotime (Nanjing, Kina). A549-celle binding aptamer (S6, sekvens: GTGGCCAGTCACTCAATTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG) med sulfhydrylgruppe i 5′-enden ble syntetisert ved RiboBio Co Ltd (Guangzhou, Kina). MIR-34a og forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) ko-uttrykkende plasmid (pMiR-34a, sense: 5′-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3 «, antisense: 5′-AACCAGCUAAGACACUGCCAUU-3) og negative kontroll plasmid (pMiR-NC, sense: 5»-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 «, antisense: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3») ble oppnådd fra SunBio Co.Ltd (Shanghai, Kina). A549 human NSCLC cellelinjen ble hentet fra Institutt for biokjemi og cellebiologi, SIBS, CAS (Kina). Celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert med 10% FBS, penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C inkubator med 5% CO
2.
Syntese av aptamer konjugert dendrimer (PAM-Ap)
for å syntetisere den aptamer konjugert dendrimer, 100 mg PAMAM (metanoloppløsning) ble tørket under nitrogen og oppløst i 5 ml PBS (pH 7,2). Deretter 20 mg Mal-PEG-NHS (Mw 2000) ble tilsatt til PAMAM-løsning og omrørt i 6 timer, og deretter ble blandingen dialysert i destillert vann ved hjelp av dialysemembran (MWCO 3500 Da) i 24 timer for å fjerne uomsatt Mal-PEG- NHS, etterfulgt av lyofilisering for å få pegylert PAMAM (PAM-PEG-Mal). For konjugering av S6 aptamer, ble 25 mg PAM-PEG-Mal oppløst i 2 ml PBS (pH 7,2). Deretter 50 nM S6 aptamer ble blandet med løsningen i 6 timer, produktet ble deretter dialysert mot destillert vann ved bruk av dialysemembran (MWCO 7500 Da) i 12 timer og lyofilisert for å få PAMAM-PEG-Ap (PAM-Ap).
Formulering og karakterisering av pDNA belastede nanopartikler
for det pDNA bindingsevnen evaluering, 1 ug av pDNA ble blandet med PAM-Ap på N /P-forhold varierende fra 0,5 til 16 i PBS (pH 7,2 ). Hver prøve ble vortex-blandet i 20 s, inkubert i 30 minutter ved romtemperatur for å danne PAM-AP /pDNA NPS. Da prøvene ble underkastet elektroforese i 1,5% agarose-gel inneholdende Gelred
TM i 20 min (100 V), og bånd pDNA ble visualisert under UV-lys. For partikkelstørrelse og Zeta potensial måling, PAM-AP /pDNA NPs var forberedt på ulike N /P-forholdet i destillert vann og bestemmes av en Zetasizer Nano ZS (Malvern Inc., Westborough, MA). For serum stabilitetstesten, det blotte pMiR-34a, PAM /pMiR-34a og PAM-Ap /pMiR-34a-komplekser (N /P = 40) ble inkubert i 50% FBS ved 30 ug /ml. Blandingene ble inkubert ved 37 ° C i forskjellige tidsintervaller. Etter dette ble 20 pl av blandingen ble behandlet med 10 ul heparinløsning (1000 U /ml) for å frigjøre den lastede pDNA etter elektroforese på en 1,0% vekt /volum agarosegel inneholdende Gelred
TM i 15 min. Den ikke nedbrutt pDNA ble visualisert under UV-lys.
Strømningscytometri for cellulært opptak assay
A549-celler ble utsådd i 6-brønns plater ved en densitet på 3 x 10
5 celler pr brønn og dyrket i 24 timer. PAM-Ap /pDNA eller PAM /pDNA NPS ble fremstilt med YOYO-1 merket pDNA (1 molekyl YOYO-1-jodid til 20 basepar av nukleotid) ved N /P-forhold på 40. Før transfeksjon, ble kulturmediet fjernet. Deretter 2 ml serumfritt RPMI 1640 medium inneholdende PAM-AP /pDNA eller PAM /pDNA NPS ble tilsatt til hver brønn (pDNA 4 ug /brønn). Etter 4 timers inkubasjon ble mediet fjernet transfeksjon. Cellene ble vasket, trypsinisert og resuspendert i DPBS og prøvene ble umiddelbart bestemt ved strømningscytometri (BD, San Jose, CA). For konkurranse studier av S6 aptamer mediert cellulært opptak av PAM-Ap, ble A549-cellene sådd i 6-brønns plater, 30 min før PAM-Ap /pDNA NPS behandling, ble et 50-gangers overskudd av S6 aptamer tilsatt til kulturmediet og inkubert i 4 timer før analyse av cellene som ovenfor.
Confocal laser scanning mikroskopi (CLSM) studie
A549-celler ble sådd ut på dekkglass i 24-brønners plater i en tetthet på 5 x 10
4 per brønn og dyrket i 24 timer. Den YOYO-1 merket PAM-Ap /pDNA eller PAM /pDNA NPS ble fremstilt med samme fremgangsmåte som beskrevet ovenfor. Cellene ble transfektert med PAM-AP /pDNA eller PAM /pDNA NPS ved en pDNA konsentrasjon på 1 ug /brønn. Etter 4 timers inkubering ble cellene vasket og fiksert med 4% formaldehyd, farvet med DAPI. Den ekstracellulære polymerer /pDNA nanopartikler ble vasket med DPBS inneholder heparin. Bildene ble tatt med konfokal laser scanning mikroskop (Olympus, Japan).
Transfeksjon effektivitet evaluering
For å evaluere transfeksjonseffektiviteten, 1,5 × 10
5 av A549 celler ble sådd på 12 -vel plater og dyrket i 24 timer. A549-celler ble transfektert med PAM-AP /pMiR-34a eller PAM /pMiR-34a NPS (2 ug pMiR-34a per brønn) i N /P-forhold på 10, 20 og 40 i 4 timer. Etter transfeksjon, ble mediet erstattet og cellene ble dyrket i en annen 48 timer. Den EGFP uttrykker cellene ble fotografert av fluorescens mikroskop (Leica, Tyskland) og kvantifisert ved flowcytometri.
RNA isolering og qPCR analyse
Nivåene av BCL-2 og p53 mRNA ble bestemt ved kvantitativ real-Time PCR (QRT-PCR). A549-celler ble utsådd i 6-brønners plater i en tetthet på 3 x 10
5 per brønn og dyrket i 24 timer. Transfeksjon av PAM-AP /pMiR-34a eller PAM /pMiR-34a NPS ble utført som beskrevet ovenfor. Etter 48 timers inkubasjon ble kulturmediet fjernet, og cellene ble vasket med PBS. Total RNA ble isolert ved hjelp RNeasy mini-sett (Qiagen, Germantown, MD) i henhold til produsentens protokoll. BCL-2 og p53 mRNA nivåer ble kvantifisert ved hjelp iScript
TM ett-trinns RT-PCR kit med SYBR grønn (Bio-Rad, CA) ved hjelp av iQ
TM5 RT-PCR deteksjon system. Relative genuttrykk nivåer ble beregnet etter en komparativ Ct metode mot endogen kontroll β-actin uttrykk nivå. Dataene er normalisert til BCL-2 eller p53-ekspresjon nivå av ubehandlede celler. Sekvenser av genspesifikke primere for qPCR er som følger: β-aktin (sense) 5′-GGATCCGACTTCGAGCAAGAGATGGCCAC-3 «(antisens) 5′-CAATGCCAGGGTACATGGTGGTG-3′; BCL-2 (sense) 5»-TTGGATCAGGGAGTTGGAAG-3 «(antisens) 5′-TGTCCCTACCAACCAGAAGG-3′; p53 (sense) 5»-ACCAGGGCAGCTACGGTTTC-3 «(antisens) 5′-CCTGGGCATCCTTGAGTTCC-3».
Western blot-analyse
A549-celler ble dyrket og behandlet som beskrevet ovenfor. Totalt protein ble ekstrahert med RIPA-lyseringsbuffer og ble kvantifisert ved BCA-proteinanalyse kit. 40 mg protein ble lastet og separert på 10% Klar Gel Tris-HCl gel (Bio-Rad, CA) og deretter overført til en polyvinyliden fluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). PVDF-membranen ble blokkert med 5% skummet melk i 1 time, og probet med primære antistoffer ved romtemperatur i 1 time. Deretter ble membranen farget med HRP-konjugert sekundært antistoff og båndene ble påvist med ECL Plus kit (Beyotime, Nanjing, Kina).
Cvtotoksisitetsmålinq
In vitro cytotoksisitet ble evaluert av CCK-8-analyse. A549-celler ble sådd i 96-brønns plater ved en densitet på 6000 celler per brønn og dyrket over natten. Cellene ble transfektert med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a eller PAM-Ap /pMiR-34a NPS for 4 h (2 ug /ml pMiR-34a), og deretter ble mediet erstattet og cellene ble videre inkubert i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller 96 timer. Etter fjerning av mediet, 100 ul dyrkningsmedium inneholdende 10 ul CCK-8 ble tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 1 time, absorbansen av hver brønn ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Thermo Scientific, MUTISKAN MK3) ved 450 nm bølgelengde . Cellen levedyktighet av A549 celler ble uttrykt i forhold til ubehandlede celler.
Cell apoptose analyse
A549 celle apoptose ble bestemt ved flowcytometri som rapportert tidligere [24]. Kort sagt ble A549-celler sådd i 12-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
5 celler pr brønn og inkubert over natten. Cellene ble transfektert med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a eller PAM-AP /pMiR-34a NPS for 4 h (2 ug /ml pDNA), deretter ble transfeksjonen ble mediet erstattet og cellene ble videre inkubert i 48 timer. Deretter ble cellene vasket, trypsinert og oppsamlet ved sentrifugering. Den celle apoptose ble bestemt ved flow-cytometri etter farging med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) farging sett i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
In vitro
migrering og invasjon assay
migrering og invasjon evne til A549-celler ble evaluert ved anvendelse av den modifiserte 6,5 mm transwell kammer med polykarbonatmembraner (8,0-mm porestørrelse) (Costar, Cambridge, Mass). A549-celler (1 x 10
5 celler) ble transfektert i 24 timer og ble trypsinert og suspendert i 200 ul serumfritt RPMI 1640 medium. Deretter ble cellene sådd ut i de øverste kamre med den ikke-belagte eller forbelagt med 20 mg av Matrigel (for migrering og invasjon assay, henholdsvis). Kulturmedium inneholdende 10% FBS i bunnkammeret ble brukt som kjemotiltrekkende. Etter 24 timer inkubasjon ble ikke-overførte eller ikke-invaderende celler tørkes av med bomullspinner fra toppen kammeret. Celler på undersiden av kammeret ble fiksert med 4% paraformaldehyd, deretter beiset med 0,5% krystallfiolett oppløsning i 1 time og tellet under et mikroskop i fem forhåndsbestemte felt.
Statistisk analyse
Data ble vist som gjennomsnitt ± SD. Én-veis analyse av varians (ANOVA) ble utført. P-verdi 0,05 ble definert som statistisk signifikant.
Diskusjon
Syntese og karakterisering av materialene
bifunctional Maleimide polyetylenglykol succinimidyl ester (Mal-PEG-NHS) ble vedtatt til
Resultater og koble aminogruppen av PAMAM og 5′-tiolert S6 aptamer. Dialyse ble benyttet for å rense produktet. Omsetningen av PAMAM og Mal-PEG-NHS ble overvåket ved 1H-NMR (300 MHz), med spesifikke topper for PAMAM (2,3, 2,4, 2,7, 3.1ppm) (figur 1A), PEG (3,6 ppm), MAL (5,8 , 6,3 ppm) (figur 1B). De
1 H-NMR data bekreftet dannelsen av PAMAM-PEG-MAL. Vi brukte den integrerte områder av H-NMR topper å kvantifisere forholdet mellom PEG kjeder og PAMAM. Med forutsetning om 164 metylenprotoner per PEG og 2032 per PAMAM identifiserte vi at PAMAM-PEG-MAL hadde en PAMAM /PEG proton-forhold på 0,32, noe som indikerer at hver PAMAM hadde et gjennomsnitt på 3,9 PEG kjeder tilkobling.
Karakterisering av PAM-AP /pDNA nanopartikler
nylagde PAM-Ap konjugater ble oppløst i vandige betingelser og blandet med pDNA å danne nanoskalerte partikler. De gjennomsnittlige størrelser av PAM-AP /pDNA NPS spenner 100-200 nm når N /P-forholdet overskrider 5 (figur 2A). Som N /P-forholdet økes, vil størrelsen av PAM-Ap /pDNA NPS falt under 200 nm (figur 2A), og ingen endring i størrelse etter at. Disse resultatene indikerte dannelse av tette nanopartikler mellom PAM-Ap og pDNA. Som vist i figur 2B og 2C, ble størrelsen og zeta-potensialet noe endret etter konjugering av PEG og aptamer. Størrelsen på PAM-Ap /pDNA ytterligere til rundt 150 nm, mens zeta potensialet falt til omkring 31mV, noe som indikerer at PEG og aptamer omgitt nanopartikkeloverflaten. Videre PAM-AP /pDNA NPs hadde smalere størrelsesfordeling i forhold til PAM /pDNA NPs. Den pDNA kondensasjon evnen til syntetisert PAM-Ap ble målt ved hjelp av agarose-gel retardasjon. Gelelektroforese Forsøkene viste en økt N /P-forholdet av PAM-Ap /pDNA NPs (Fig 2D). Og ved N /P-forhold på 4, fullstendig retardering av PAM-Ap /pDNA ble identifisert.
(A) størrelse og Zeta-potensialet i de PAM-Ap NPS ble målt ved DLS. (B) Størrelsen fordeling av PAM /pDNA og PAM-Ap NPs på N /P = 40. (C) Den Zeta potensial distribusjon av PAM /pDNA og PAM-Ap NPs på N /P = 40. (D) Gel retardasjon elektroforese av PAM-AP /pDNA NPs. Band 1: Naken pDNA, bånd 2-7: PAM-Ap /pDNA NPS ble fremstilt i N /P-forhold på 0,5, 1, 2, 4, 8 og 16, respektivt. (E) Serum stabilitetsprøve pDNA, PAM /pDNA og PAM-Ap /pDNA-komplekser i 50% FBS betingelser ved 37 ° C. Data ble vist asmean ± SD (n = 3).
Stabiliteten pDNA i komplekser er viktig for effektiv genet levering. En agarose-gel-analyse ble introdusert for å bestemme pDNA stabilitet i 50% serum for å etterligne
in vivo
forhold. Beskyttelsen Effekten av komplekser mot DNA degradering av serum som ble vist i figur 2E. Den nakne pDNA ble fullstendig nedbrutt med 50% FBS etter 8 timer, mens PAM /pDNA og PAM-Ap /pDNA utstilt beskyttende effekt mot serum for 48 timer (figur 2E). Disse resultatene antydet at PAM-Ap ikke bare kunne binde pDNA, men også å beskytte den mot nedbrytning i serum, noe som kan bidra til den potensielle anvendelsen av genet leveringssystemet.
cellulært opptak av nanopartikler
ytelsen av ikke-virale vektorer genavleveringspartikler er nært relatert til nivåer av cellulært opptak [25]. Den grønne fluorescens slippes ut fra pDNA /YOYO-1 ble analysert for å vurdere cellulært opptak av PAM-AP /pDNA NPs. A549 celler ble inkubert med nakne pDNA, PAM /pDNA eller PAM-Ap /pDNA NPS, henholdsvis, og deretter YOYO-1-positive celler ble kvantifisert ved strømningscytometri som representerer graden av cellulært opptak [26]. Andelen jojo-1-positive celler økte med N /P-forholdet, noe som indikerer cellulært opptak av NPS ble underkastet N /P-forholdet i stor grad (figur 3A og 3B). PAM-Ap /pDNA NPs utstilt høyere cellulært opptak enn nontargeted PAM /pDNA NPs. Når behandlet med PAM-AP /pDNA NPs på N /P-forholdet 40, A549 celler utstilt bemerkelsesverdig høyere fluorescens-signaler (94,2% Yoyo-1-positive celler) sammenlignet med PAM /pDNA NPs behandlede celler (48,5% Yoyo-1-positive celler). Disse resultater antyder at PAM-AP /pDNA NPS binder preferensielt til A549-celler. For ytterligere å bevise at S6 reseptor-mediert opptak av PAM-AP /pDNA NPS i cellene, har vi utført konkurranseeksperiment ved forbehandling av A549-celler med overskuddsmengde av S6 aptamer og viste en signifikant lavere opptak som angir den frie aptamer blokkerte bindingssetene av S6 på cytolemma overflaten av A549 celler, som undertrykte den måls evnen til PAM-AP /pDNA NPs.
de ubehandlede celler ble brukt som kontroll. Dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskjell mellom disse gruppene.
CLSM Forsøkene ble neste gjennomført for å ytterligere bekrefte den cellulære internalisering av reseptor-mediert målrettet levering av PAM-AP /pDNA NPs og distribusjon av pDNA i A549 celler fordi CLSM spor YOYO-en merket pDNA (grønn fluorescens) formulert i nanocomplexes. Sammenlignet med ikke-målrettede PAM /pDNA NPs, A549 celler behandlet med PAM-AP /pDNA NPs utstilt sterkere grønn fluorescens signaler etter 4h inkubasjon, noe som indikerer høyere cellulært opptak av målrettede NPs (fig 4). Notebaly, fluorescens signalet ble betydelig redusert i aptamer forbehandlet A549 celler under lignende forhold, noe som tyder på at S6 reseptor endocytose var en viktig vei for PAM-Ap /pDNA NPs intern. Videre var de fleste YOYO-1 signaler observert i cytoplasma, noe som tyder på at proton svamp virkningene av PAMAM spilte en viktig rolle i prosessen med endosomale /lysosomale flukt [27]. I konklusjonen, våre data tyder på at PAM-AP /pDNA NPs vise både gode celle målretting og endosomal /lysosomal flukt egenskaper.
A549 celler behandlet med yoyo-1 merket pDNA kompleks med PAM og PAM-Ap (N /P-forhold: 40) med eller uten S6 aptamer forbehandlet. Cellene ble inkubert ved 37 ° C. Alle skala barer er 20 mikrometer.
Transfeksjon effektiviteten av nanopartikler
Etter å demonstrere effektiv cellulært opptak av PAM-AP /pDNA NPs, vi neste målt transfeksjon effektiviteten av PAM-Ap /pMiR-34a NPs på A549 celler med en EGFP reporter. Fordi pMiR-34a-ekspresjonsvektoren inneholder forbedret grønn fluorescerende (EGFP) genet hvis ekspresjon er drevet av den samme promotor, kan den EGFP uttrykket direkte reflekterer nivåene av pMiR-34a ekspresjon, og kan brukes til å vurdere transfeksjonseffektivitet. Som vist i figur 5A og 5B, genet transfeksjonseffektiviteten av PAM-Ap /pMiR-34a NPS var mye høyere enn for PAM /pMiR-34a NPS ved forskjellige I /P-forhold. Den eksogene EGFP genuttrykket økt med N /P-forholdet for begge nanopartikler. Transfeksjonseffektiviteten var lav i N /P-forhold på 10, men øket med N /P-forhold på 20 og 40. EGFP ekspresjon av PAM-Ap /pMiR-34a NPS på A549-celler ble klart observert i N /P-forhold på 40 , noe som indikerte at nanopartikler oppnås effektivt genekspresjon effektivitet. Tilsvarende kvantitative målinger av EGFP positive celler bekreftet at 37,9% av cellene ble vellykket transfektert med PAM-AP /pMiR-34a NPs når N /P-forholdet var 40, mens det bare var 9,5% for de PAM /pMiR-34a NPs gruppe. Videre var det signifikante forskjeller i prosentandelen av transfekterte celler mellom de to grupper på alle I /P-forhold. Disse resultatene tyder på at konjugeringen aptamer betydelig forbedre transfeksjonseffektivitet av PAM-AP /pDNA NPS. Da toksisiteten økes også med mengden av kationiske polymerer [28, 29], valgte vi nanopartikler på N /P-forholdet 40 for de følgende eksperimenter.
Data ble vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3). Alle skala barer er 200 mikrometer. * P 0,05, signifikant forskjell mellom disse gruppene.
Påvirkning av genuttrykk
Over-uttrykk for anti-apoptotiske gener i kreftceller er ansett som en av de mekanismer for tumorprogresjon. Som et potent regulator av apoptose, har BCL-2 blitt identifisert i flere typer kreft [30]. BCL-2 har blitt funnet å være overuttrykt i hyppig lungekreft og dens anti-apoptotiske rolle er tett forbundet med sine ekspresjonsnivåer [31, 32]. Den over-ekspresjon av BCL-2 resultat i kreftcellene resistens mot kjemoterapi medikament-indusert apoptose [33]. BCL-2 har tidligere blitt identifisert som et lovende mål nedstrøms av MIR-34a [34]. Som et tumor suppressor, p53-inaktivering som respons på enkelte kreft tilhørende spenningssignalene er en vanlig genetisk endring i et flertall av krefttyper [35]. Aktivert p53 utløser en rekke biologiske resultater, for eksempel reparasjon av mindre skader, regulering av cellesyklus, induksjon av replicative alderdom og apoptose. Samspillet mellom p53 og MIR-34a er avklart i mange typer kreft, inkludert NSCLC [36]. For å evaluere BCL-2 genet undertrykkelse og p53-genet aktivering aktivitet pMiR-34a overført A549 celler, behandlet vi A549 celler med PAM-Ap /pMiR-34a, PAM /pMiR-34a eller PAM-AP /pMiR-NC NPs og målt nivåer av BCL-2 og p53-mRNA. Resultatene fra qPCR viste at nivået av BCL-2-mRNA var signifikant nedregulert og p53 mRNA signifikant oppregulert i A549-celler (figur 6A). Etter 48 timers inkubasjon, observerte vi 60,8% reduksjon av BCL-2 mRNA uttrykk for PAM-Ap /pMiR-34a, men bare 26,5% nedgang for PAM /pMiR-34a. I mellomtiden har PAM-Ap /pMiR-34a transfektert A549-celler resulterte i en 7,93 gangers økning av p53 mRNA, betydelig høyere enn for PAM /pMiR-34a (2,1 ganger). På samme måte ble det ekspresjonsnivået av p53 og BCL-2-proteiner på A549-celler som målt ved Western blotting (figur 6B). Som forventet, proteinene viste samme tendens som mRNA-ekspresjonsnivået siden p53-protein ekspresjon var uregulert og BCL-2 protein ble redusert i de PAM-Ap /pMiR-34a transfekterte A549-celler. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at PAM-Ap /pMiR-34a NPs er i stand til å påvirke beslektede gener og proteiner uttrykk i A549 celler.
Cellene ble dyrket i 48 timer etter transfektert med PAM-Ap /pMiR-NC NPs, PAM /pMiR-34a NPs og PAM-AP /pMiR-34a NPs for 4 timer. Kvantitativ real-time PCR-analyse ble tatt i bruk for å kvantifisere mRNA-ekspresjon, og western blotting ble brukt til å bestemme proteinekspresjon. De ubehandlede celler ble anvendt som kontroll. Dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskjell sammenlignet med PAM /pMiR-34a.
Kreft celle veksthemming
Deretter vurderte vi
in vitro
antiproliferation effekten av PAM- Ap /pMiR-34a NPs på A549 celler ved hjelp av CCK-8-analysen. Etter 24 timer, 48 timer, 72 timer eller 96h transfeksjon ble inhiberingsgraden av cellevekst målt. Det ble funnet at PAM-Ap /pMiR-34a NPS oppviste den sterkeste antiproliferation effekter på A549-celler (figur 7A). Celleviabilitet av PAM-Ap /pMiR-34a NPS behandlede A549-celler viste 29,8%, 49,7%, 57,5% og 62,4% lavere enn den for kontrollgruppen etter 24 h, 48h, 72h og 96h av transfeksjon, respektivt. Som inkubasjonstid gikk, gapet av cellenes levedyktighet mellom PAM-Ap /pMiR-34a og andre grupper økes, og dette kan skyldes hysterese av eksogent gen uttrykt ved pMiR-34a. Det er verd å merke seg at PAM-Ap /pMiR-NC NPs litt hemmet A549 cellevekst. Dermed aptamer bidro også til antiproliferation effekten av PAM-Ap /pMiR-34a. Disse eksperimentelle resultatene indikerte at økningen av genet transfeksjon i A549-celler påvirket celleveksten. Således har PAM-Ap /pMiR-34a NPS et potensial til å være en målrettet gen avleveringssystem for behandling av lungekreft.
(A) In vitro cytotoksisitet av PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR- 34a og PAM-AP /pMiR-34a NPs i A549 cellene ved ulike tidspunkt etter transfeksjon. (B) Cellular apoptose av A549-celler etter behandling med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a og PAM-Ap /pMiR-34a NPS i 48 timer. CCK-8-analysen ble anvendt for å vurdere cellelevedyktighet og flow-cytometri ble benyttet for å bestemme celle apoptose med Annexin /PI farging. Dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskjell mellom disse gruppene.
apoptose har generelt vært ansett for å være en av de dominerende mekanismer for celledød [37, 38]. Som vist i figur 7B, er apoptotiske og nekrotiske celler i kontrollgruppen var ikke innlysende ( 10%). Behandlingen av PAM /pMiR-34a og PAM-AP /pMiR-34a NPs økt betydelig prosentandel av tidlige og sene apoptotiske celler. Videre ble celler behandlet med PAM-Ap /pMiR-34a NPS viste den høyeste prosentandel av det totale skadede celler, som var betydelig høyere enn for de andre gruppene (p 0,05). Resultatene viste at PAM-Ap /pMiR-34a NPS var mer effektive i indusering av apoptose av A549-celler enn ikke-målrettede PAM /pMiR-34a.
In vitro
migrering og invasjon
Det finnes ulike endringer i kreftceller og mikromiljøet av vev, og endringene føre cellene til å migrere eller invadere inn i sunt vev, noe som fører til metastase av kreft [39]. Derfor, migrering og
in vitro
invasjons analyser er nødvendig for å evaluere tendens til metastase prosess. Etter transfektert med PAM-AP /pMiR-34a NPs, ble den vandrende og invasiv evne til A549 celler undersøkt. Som vist i figur 8A og 8B, fant vi at PAM-AP /pMiR-34a NPs vesentlig hemmet migrasjon og invasjon av A549 celler. Bemerkelsesverdig, trekk og invasive priser av PAM-AP /pMiR-34a behandlede celler var 17,7% og 23,8% sammenlignet med ubehandlede celler, henholdsvis. Det var imidlertid en meget minimal innvirkning på migrering og invasjon av celler behandlet med PAM-Ap /pMiR-NC sammenlignet med de i kontrollgruppen, noe som kan utledes at MIR-34a ekspresjon hovedsakelig påvirket cellemigrering og invasjon i stedet for S6 aptamer.
Celler ble forbehandlet med PAM-Ap /pMiR-NC, PAM /pMiR-34a og PAM-Ap /pMiR-34a NPs. De ubehandlede celler ble anvendt som kontroll. (A) Representative mikroskopi bilder av migrasjon og kvantitativ analyse av trekkende celler. (B) Representative mikroskopi bilder av invasjonen og kvantitativ analyse av invasive celler. Dataene ble vist som gjennomsnitt ± SD (n = 3). * P 0,05, signifikant forskjell mellom disse gruppene.
Konklusjon
Selv om giftigheten av dendrimerer er en av faktorene som begrenset deres kliniske applikasjoner, dendrimerne har vært ansett som «smarte» bærere for deres evne som intracellulær genet levering kjøretøy.
