Abstract
Phloridzin (florizin eller phloretin 2 «-
O
-glucoside) er kjent for blokkere tarm glukose absorpsjon. Vi har undersøkt anticarcinogenic effekten av phloridzin og dets nye derivater med humane kreftcellelinjer. Vi har syntetisert nye acylerte derivater av phloridzin med seks forskjellige langkjedede fettsyrer ved enzymatisk regioselektiv acylering ved hjelp av
Candida Antarktis
lipase B. Antiproliferative virkninger av de nye forbindelser ble undersøkt i sammenligning med moderforbindelsene, phloridzin, aglykon phloretin, de seks frie fettsyrer og kjemoterapeutiske legemidler (sorafenib, doksorubicin og daunorubicin) ved anvendelse av humane leverkreft HepG2-celler, human bryst adenokarsinom MDA-MB-231-celler og akutt monocyttisk leukemi THP-1-celler sammen med normale humane og rotte-hepatocytter. Fettsyreestere av phloridzin inhiberte signifikant vekst av de to karsinom og leukemiceller mens tilsvarende behandlingsdoser ikke var toksiske for normale humane eller leverceller fra rotte. Den antiproliferative potens av fettsyreestere av phloridzin var sammenlignbar med styrken av cellegiftene. Fettsyreestere av phloridzin inhibert DNA topoisomeraser IIα aktivitet som kan indusere G
0 /G
en faserest, indusert apoptose via aktivering av kaspase-3, og redusert ATP-nivå og mitokondriemembranpotensialet i HepG2-celler. Basert på høy selektivitet på kreftceller, decosahexaenoic syre (DHA) ester av phloridzin ble valgt for analyse av genuttrykk bruker RT
2PCR menneskelig kreft narkotika mål array. Antiproliferative effekt av DHA ester av phloridzin kan være relatert til nedregulering av anti-apoptotiske genet (BCL2), vekstfaktorreseptorer (EBFR familie, IGF1R /IGF2, PDGFR) og dets nedstrøms signaliseringspartnere (PI3K /AKT /mTOR, Ras /Raf /MAPK), cellesyklus maskiner (CDK, tERT, TOP2A, TOP2B) samt epigenetikk regulatorer (HDACs). Disse resultatene tyder på at fettestere av phloridzin ha potensielle kjemoterapeutiske effekt mediert gjennom svekket ekspresjon av flere viktige proteiner involvert i cellesyklusregulering, DNA-topoisomeraser IIα aktivitet og epigenetiske mekanismer etterfulgt av cellesyklus og apoptose
Citation.: Nair SVG, Ziaullah, Rupasinghe HPV (2014) fettsyreestere av Phloridzin indusere apoptose av humane lever kreftceller gjennom Altered Gene Expression. PLoS ONE ni (9): e107149. doi: 10,1371 /journal.pone.0107149
Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA
mottatt: 21 mars 2014; Godkjent: 12 august 2014; Publisert: 17.09.2014
Copyright: © 2014 Nair et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering: HPVR. Discovery Grant programmet for naturvitenskap og Engineering Council (NSERC; Grant Antall 327 056, https://www.nserc-crsng.gc.ca) av Canada og Atlanterhavet Innovation Funds (AIF) program av Atlantic Canada Opportunities Agency (ACOA; Grant Antall 192 020, https://www.acoa-apeca.gc.ca). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC), den vanligste formen for leverkreft, representerer den femte verdensbasis malignitet og tredje årsaken til dødelighet blant kreftrelaterte dødsfall [1]. I Canada, har forekomsten av HCC vært økende de siste tiårene [2]. HCC står for 71,9% av leverkreft hos menn og kvinner i Canada. Ifølge kanadiske Cancer statistikk i 2013, har forekomsten av leverkreft i Canada økte med 3,6% per år, og dødeligheten har økt med 2,2% per år. De medvirkende faktorer av HCC inkluderer kontakt med hepatocarcinogens spesielt aflatoksin [3], lever virusinfeksjon og skrumplever [4]. De potensielle helbredende behandling alternativer er kirurgisk fjerning, levertransplantasjon, og ablasjon eller transarterial embolisering [1]. Kjemoterapi, oral multikinasehemmer inhibitor sorafenib (Nexavar) er den mest brukte stoffet for HCC behandling, men gevinsten i overlevelse er beskjeden [5]. Utilgjengelighet av effektive behandlinger og høy prevalens har ført til leting etter nye tilnærminger egnet for forebygging og behandling av leverkreft. Som et resultat har mange fytokjemikalier blitt utforsket som potensielle chemopreventive agenter som kan reversere eller undertrykke leverkarsinogent progresjon.
Flavonoider, en av de store klassene av polyfenoler, har vist noen chemopreventive egenskaper mot HCC i et stort antall i vitro [6], [7] og in vivo studier [1], [8]. Phloridzin (phlorizin eller phloretin 2 «-
O
-glucoside), en dihydrocalkon, er en av de store fenoliske flavonoid glukosider som finnes i eple [9]. Den store farmakologiske virkningen av phloridzin er hemming av natrium-avhengige glukose knyttet transportører (SGLT1 og SGLT2) som blokkerer tarm glukose absorpsjon og produsere nyre glycosuria [9]. I tillegg til sin antidiabetiske eiendom, har phloridzin andre biologiske aktiviteter som for eksempel inhibering av lipidperoxidasjon [10], forhindring av bentap hos rotter [11] og forbedring av hukommelse i mus [12]. Phloridzin stimulere melanogenesis ved å øke tyrosinase genuttrykk gjennom cAMP signalveien [13]. Phloretin, aglykon av phloridzin, er blitt rapportert å ha sterk antioksidantaktivitet i peroxynitrite fangende og inhibering av lipidperoxidasjon [14]. Glykosylering i 2-OH redusert antioksidantaktivitet av phloridzin med 18 ganger i forhold til phloretin [14]. Phloretin på konsentrasjonene av 100 mikrometer utvidet TNFa-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) indusert apoptose og cytotoksisitet i LNCaP prostatakreftceller [15]. Imidlertid er det ingen rapport om kreft kjemopreventive virkninger av phloridzin. I en antitumor aktivitet studie av eple polyfenoler, gjorde phloridzin ikke påvirke spredning av enten transplanterte B16 musemelanomceller eller BALB-MC.E12 mus brystsvulstceller [16].
I vårt laboratorium, phloridzin ble regioselektivt acylerte med en serie av langkjedet, mettet, mono- og poly-umettede fettsyrer, ved å bruke immobilisert lipase B, fra
Candida antarctica plakater (Novozyme 435) [17]. Lipase-katalysert forestring og omestring av flavonoid glykosider har blitt rapportert å øke lipofilisiteten og forbedret anticancer virkning av moderforbindelsen [18]. Derfor, i denne studien undersøkte vi den cytotoksiske potensialet av fettsyreestere av phloridzin på celleformering av faste tumorer så som leverkreft HepG2-celler og bryst adenokarsinom MDA-MB-231-celler, så vel som akutt monocytter leukemi THP-1-celler. Normale humane hepatocytter HP-F og leverceller fra rotte RTCP10 ble også anvendt for å bestemme spesifisiteten av de estere på kreftceller. Dette er første gang disse nye fettsyreestere av phloridzin er blitt testet for antiproliferativ effekt av kreftceller. I tillegg til å belyse de cellulære og molekylære mekanismer for fettsyreestere av phloridzin på HepG2-celler, DNA-topoisomeraser IIα aktivitet, cellesyklus-stans, mitokondriemembranen permeabilitet, kaspase 3 aktivitet og tilhørende apoptotiske prosesser ble også undersøkt. Videre analyserte vi effekten av decosahexaenoic syre (DHA) ester av phloridzin på uttrykk av 84 gener som mål for kreftbehandling og narkotika utvikling. Våre resultater gitt eksperimentelle bevis for å støtte videre undersøkelser av fettsyreestere av phloridzin spesielt DHA ester av phloridzin som en effektiv og sikker kjemoterapeutisk kandidat.
Materialer og metoder
Test forbindelser og kjemikalier
fettsyreestere av phloridzin (Pz) nemlig. stearinsyreester av Pz (Pz-stearinsyre), oljesyreester av Pz (Pz-oljesyre), linolsyre ester av Pz (Pz-linolsyre), α-linolensyre ester av Pz (Pz-α-linolensyre ), ble DHA ester av Pz (Pz-DHA) og eikosapentaensyre ester (EPA) av Pz (Pz-EPA) syntetisert i vårt laboratorium som tidligere rapportert [17].
Phloridzin, phloretin, caspase 3 kolo analysesett, propidiumjodid, fettsyrer nemlig oljesyre, stearinsyre, linolsyre, α-linolensyre, EPA og DHA ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich Canada. Cell Titer 96 Vannholdig En løsning celleproliferasjon (MTS) assay, CytoTox 96 ikke-radioaktive cytotoksisitet (LDH) analyse og CellTiter-Glo lysende analysesett ble kjøpt fra Promega, Madison, WI, USA. Steril dimetylsulfoksid (DMSO) (ATCC), GFP-sertifisert apoptose /nekrose deteksjon kit for mikroskopi fra Enzo Life Sciences, Brockville, ON, Canada; ApoTarget Hurtig apoptotisk DNA Ladder Detection kit fra Invitrogen, Burlington, ON, Canada; DCFDA-Cellular reaktive oksygenforbindelser deteksjon analysen byggesett Abcam, Toronto, ON, Canada; og 5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodid (JC-1) fra Cayman Chemicals, Burlington, ON, Canada ble også brukt i studien.
cellelinjer og dyrkningsforhold
Menneskelige leverkreft celler (HepG2) og THP-1 akutte monocyttiske leukemiceller ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA (Dalhousie-universitetet biosikkerhet sertifikat nummer for bruken av cellelinjer er av 2013-10). HepG2-celler ble dyrket i Eagle modifiserte minimale essensielle medium (EMEM) supplert med 10% FBS (ATCC) og 1% penicillin-streptomycin (ATCC). THP-1-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplementert 0,05 mM 2-merkaptoetanol og 10% føtalt bovint serum til en sluttkonsentrasjon på 10%. MDA-MB-231 brystkreftceller (ATCC HTB-26) ble oppnådd fra Cedarlane, Berlington, ON, Canada) og ble opprettholdt i DMEM-medium (Sigma-Aldrich Canada) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin , 2 mM L-glutamin, 5 mM HEPES (pH 7,4) og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Invitrogen, Burlington, ON, Canada). Kryopreserveres normale humane hepatocytter (HP-F), ble hepatocytter plating medium og hepatocytter vedlikehold medium kjøpt fra Zen-Bio, Forsknings Tiangle Park, NC, USA. Normale humane leverceller sådd ut på 96 brønners kollagen 1 belagte cellekulturplater (Life Technologies) og opprettholdt i hepatocytter vedlikehold medium i 24 timer for at cellene skulle utvinning og vedlegg. Rotte hepatocytter (RTCP10), tining medier og ruge media ble kjøpt fra Life Technologies. Rotte hepatocytter ble belagt i kollagen 1 belagte 96-brønners plater (Life Technologies, Burlington, ON, Canada) med tining media og vedlikeholdes i inkubasjon medium. Alle celletyper ble holdt ved 37 ° C i en inkubator under 5% CO
2/95% luftatmosfære ved konstant fuktighet.
Cellene ble telt ved bruk av et hemocytometer (Bright-formet hemocytometer, Sigma-Aldrich Canada) og ble platet i henhold til antall celler for hvert eksperiment i 6, 24 eller 96 brønns i 24 timer før tilsetning av testprøver. Alle testprøvene ble oppløst i sterilt filtrert DMSO ( 0,5% i dyrkningsmediet) før tilsetning til kulturmediet. Kontrollceller ble også kjørt i parallell og utsatt for de samme forandringer i media med 0,5% DMSO
celleproliferasjonsanalyse
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved bruk av MTS-måling.. I korte, HepG2 celler (5 × 10
3 celler /100 ul /brønn), MDA-MB-231 (5 × 10
3 celler /100 ul /brønn), THP-1 (25 × 10
3/100 pl /brønn), normale humane og rotteleverceller (1 x 10
4 celler /100 ul /brønn) ble sådd ut i triplikat, i en 96-brønners flatbunnede sterile vevskulturplater. Etter 24 timers inkubering, phloridzin fettestere, phloridzin, floretin, ble frie fettsyrer av de respektive estere eller sorafenib fremstilt i media og 100 ul av hver behandling ble tilsatt til hver brønn, hver behandling i tre paralleller. Derved ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner (0,1, 1, 10, 25, 50, 75, 100 uM) for hver behandling. Kontrollene består av celler med media inneholdende DMSO ( 0,5%), test blanke brønner inneholdt testforbindelsen i media med ingen celler og blanke brønner inneholdt media uten celler. Etter ytterligere 3, 6, 12, 18 eller 24 timer, 20 ul av MTS-reagens i kombinasjon med elektronkoblingsmiddel, ble fenazin metosulfat tilsatt til brønnene og cellene ble inkubert i en fuktet inkubator i 3 timer. Absorbans ved 490 nm (OD490) ble målt ved hjelp av en Flurostar Optima mikroplateleser (BMG Labtech, Cary, NC, USA) for å oppnå antallet levedyktige celler i forhold til kontrollpopulasjon. Prosentandel av levedyktigheten av testforbindelsen behandlede celler er uttrykt som prosent i forhold til kontroll ( 0,5% DMSO). EC
50-verdier (konsentrasjon som er nødvendig for å redusere celler levedyktighet med 50% sammenlignet med kontrollceller) for hver testforbindelse ble analysert ved anvendelse av Graphpad Prism programvare, La Jolla, CA, USA. Den selektive indeks (SI) av fettsyreestere av phloridzin er definert som forholdet mellom cytotoksisitet (EF
50-verdier) på normale HP-F-celler for å faststoff kreft HepG2, MDA-MB-231-celler (SI = EF
50 på HP-F celler /EF
50 på solide kreftceller). Prøver med SI verdier større enn tre ble vurdert å ha høy selektivitet mot kreftceller.
Cvtotoksisitetsmålinq
Laktat dehydrogenase (LDH) er en stabil cytosolic enzym som frigjøres ved membranskade i apoptotiske /nekrotiske celler. LDH-aktiviteten ble målt ved anvendelse av CytoTox 96 Ikke-radioaktive Cytotoksisitet Assay (Promega, Madison, WI, USA), i hvilken LDH utgitt i kultursupernatantene måles med en kombinert enzymatisk analyse, noe som resulterer i omdanning av et tetrazoliumsalt til et rødt formazanprodukt. HepG2-celler (5000/100 ul /brønn) ble sådd ut og behandlet med 100 uM av phloridzin fettsyreestere, phloridzin, floretin, frie fettsyrer av de respektive estere eller sorafenib fremstilt i serumfritt medium og inkubert (37 ° C, 5% CO
2) i 6 timer. Etter sentrifugering ble supernatanten fjernet til et analyseplate, og LDH frigjøres fra cellene i kulturmediet ble målt. Maksimal frigivelse ble oppnådd etter behandling av kontrollceller med 1% Triton X-100 i 30 minutter ved romtemperatur. Den apoptotiske /nekrotiske prosent ble uttrykt ved hjelp av formelen: (sample verdi /maksimal release) × 100%. Tidligere studier av leverandøren hadde klart uttalt at i HepG2 celler, er LDH aktivitet maksimal konsentrasjon på 1 til 6 h inkubasjon fordi LDH aktivitet frigjøres fra celler har en halveringstid på ca 9 timer [19]. MTS analyseresultatene viste at alle fettsyreestere av phloridzin hemmet 70-80% celleproliferasjon i 6 h, derfor, analyserte vi LDH-aktivitet etter 6 timers inkubering.
Morfologisk observasjon av apoptose i HepG2 celler
2.5.1. Morfologisk observasjon under invertert fasekontrastmikroskop.
HepG2-celler ble sådd ut likt i 24-brønns flatbunnet vevskultur behandlede plater (BD Biosciences), og deretter behandlet med 100 uM av fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, phloretin , sorafenib og DMSO ( 0,5%) kontroll. Etter 24 timer med behandling, ble det observert morfologi HepG2 celler under en omvendt fase kontrast mikroskop (Nikon Eclipse E 100, Nikon, Mississauga, ON, Canada) og ble tatt til fange ved 400x forstørrelse ved hjelp av Infinity digital mikroskopi kamera (Lumenera aksjeselskap, Ottawa, ON, Canada).
2.5.2. Bestemmelse av Apoptose /nekrose av Fluorescensmikroskopi.
HepG2-celler ble sådd inn i Nunc Lab-Tek to kammer sleiden (Sigma-Aldrich Canada) ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /kammer. De vedlagte Cellene ble deretter behandlet med enten 100 uM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib eller DMSO kjøretøy (som kontroll) i 24 timer. Objektglassene ble vasket med fortynnet fosfatbufret saltvann. Etter fjerning av kammeret, ble hvert objektglass tilsatt 50 ul av Dual deteksjonsreagensen som inneholder apoptose deteksjonsreagensen (Annexin V-EnzoGold) og nekrose deteksjonsreagensen (7-AAD) i 1 x bindingsbuffer. Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter i mørket. Etter farging ble cellene vasket med bindingsbuffer, og dekket med et dekkglass. De fargede celler ble observert under et fluorescens Zeiss Axiovert 200 m invertert mikroskop (Carl Zeiss, Toronto, ON, Canada) ved forstørrelse × 40 med et filter satt for Annexin V-EnzoGold (Ex /Em: 550/570 nm) og 7 -AAD (Ex /Em: 546/647 nm).
Analyse av apoptose ved DNA-fragmentering
HepG2 (1 × 10
5) celler ble sådd i 24-brønners kulturplater og fikk lov til å følge over natten. Etter dette ble cellene behandlet med enten 100 uM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib eller DMSO kjøretøy (som kontroll). Platene ble re-inkubert i ytterligere 24 timer. DNA-fragmentering ble oppdaget ved hjelp ApoTarget Hurtig apoptotiske DNA Ladder Detection Kit (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) i henhold til produsentens protokoll. Prinsippet innebærer å detektere internucleosomal DNA-fragmentene som dannes under apoptose. I korthet, flytende døde celler og trypsinisert adherente celler ble samlet opp og sentrifugert ved 1000 rpm i 10 min. Etter vasking med fortynnet fosfatbufret saltvann, ble cellene lysert med 35 pl TE lysis buffer (en komponent kit). Til lysat, ble 5 ul av enzym A (et kit komponent) tilsatt og inkubert ved 37 ° C i 10 min. Deretter ble 5 ul av enzym B (en kit komponent) tilsatt, forsiktig blandet og inkubert ved 50 ° C i 30 minutter. DNA ble utfelt med ammoniumacetat og absolutt etanol ved -20 ° C. Etter sentrifugering (10 min ved 12000 rpm) og lufttørking, ble DNA-pelleten ble oppløst i 30 ul av DNA-suspensjon buffer. For detektering av DNA-stige, ble de ekstraherte DNA-prøvene kjørt på en 1,2% agarosegel inneholdende 0,5 mikrogram /ml gel rød i Tris-borat-EDTA (TBE) buffer. Etter elektroforese ble gelen bilde tatt med Gel Doc 100-systemet (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada).
Analyse av caspase-3 aktivitet
Aktiviteten av caspase 3 enzym var målt ved anvendelse av caspase 3 kolorimetrisk analysesett innkjøpt fra Sigma-Aldrich. HepG2-celler (2 x 10
6 celler /brønn) dyrket i 6-brønners plater, ble behandlet med enten 100 uM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib eller DMSO kjøretøy (som kontroll). Celler ble lysert og proteininnholdet i cellelysat ble kvantifisert ved BCA proteinanalyse (Thermo Fisher Scientific Inc., Ottawa, ON, Canada). Caspase-3 aktivitet ble målt i 200 ug av cellelysatet ved hjelp av caspase-spesifikke peptid-substrat, DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), konjugert til reporter p-nitroanaline (ρ-NA) molekyler. Spalting av dette peptid ved caspase frigjør kromofor som måles kolorimetrisk ved en bølgelengde på 405 nm slik det er beskrevet i leverandørens protokoll.
Cell Cycle Analysis
HepG2-celler ble sådd ut ved 5 x 10
5 celler per ml i en seks-brønns plate. Etter 24 timers inkubasjon (37 ° C, 5% CO
2), ble cellene behandlet med 100 uM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib eller DMSO ( 0,5%) kontroll fremstilt i media og inkubert i ytterligere 24 timer. Etter trypsinering ble cellene vasket og sentrifugert ved 2000 x g i 10 min, og pelleten resuspendert i 0,5 ml PBS. Fiksering ble gjennomført ved tilsetning av 1,2 ml av 70% kald etanol i 2 timer. De fikserte cellene ble vasket med PBS og sentrifugert ved 2000 x g i 10 min. Etter suspende celler i 0,3 ml PBS, 8 ul av DNAase fri RNase (10 mg /ml) ble tilsatt og inkubert i 1 time. Etter tilsetning og 15 ul av propidiumjodid (0,5 mg /ml), cellene ble inkubert i 4 ° C i 30 minutter. Cellene ble analysert for cellesyklus ved hjelp av strømningscytometer FACS calibur (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) med en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm og emisjon ved 670 nm. DNA ble bestemt ved ModFit programvare (Verity Software House, Topsham, ME, USA), som ga histogrammer å vurdere cellesyklus distribusjon.
Mitokondrie Energy Metabolism Analyser
ATP-nivå analyse.
Cellular ATP-nivåene ble målt med CellTiter-Glo lysende analysesett hentet fra Promega i henhold til produsentens instruksjoner. HepG2 celler sådd ut på en svart vegger klar bunn 96-brønners plate ble inkubert med 100 pM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib, frie fettsyrer eller DMSO ( 0,5%) kontroll i media. Etter 24 timer, for å CellTiter-Glo reagens lik volumet av cellekulturmedium er tilstede i hver brønn og blandet innhold i 2 minutter på en orbital-rystemaskin indusere cellelyse. Luminescence ble tatt opp på Flurostar Optima mikroplateleser (BMG Labtech) etter inkubering ved romtemperatur i 10 min for å stabilisere luminiserende signal. Nivået av ATP i en prøve ble presentert som prosent sammenlignet med ubehandlet kontroll.
mitokondriemembranen potensial (MMP).
HepG2 celler ble sådd i en svart vegger klar bunn 96-vel sterile flat bunn vevskulturplater (BD Biosciences, USA) ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn (100 ul) og inkubert i en CO
2 inkubator i 24 timer ved 37 ° C. Celler ble behandlet med 100 uM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib, frie fettsyrer eller DMSO ( 0,5%) kontroll fremstilt i media og inkubert i 24 timer. Den fargeløsning JC-1 ble fremstilt med PBS og 5 mM ble tilsatt til hver brønn. Cellene ble så inkubert i en CO
2 inkubator ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking av platen med PBS to ganger, ble fluorescens målt ved hjelp av en Fluostar Optima mikroplateleser (BMG Labtech) ved 535 nm for JC-1 monomere og ved 590 nm for JC-1 aggregater.
Menneske Topoisomerase IIα ( topo IIα) katalytisk aktivitet
topo IIα katalytiske aktivitet ble overvåket via elektroforese ved hjelp av topoisomerase II narkotika screening kit (TopoGEN, Inc., Columbus, OH, USA). I korthet ble 20 ul reaksjonsblandinger inneholdt 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl, 100 mM MgCl
2, 20 mM ATP, 300 mikrogram BSA /ml og 5 mM dithiothreitol. Supercoil DNA (pHOT1 DNA), supercoil i settet var fast bestemt på å være ideelt for denne analysen fordi den er liten og lett å håndtere og har et stort antall topo IIα anerkjennelse elementer. Etter 2 pl (0,25 pg) av pHOT1 DNA ble tilsatt, etterfulgt av tilsetning av 100 uM fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, floretin, sorafenib eller DMSO ( 0,5%) kontroll i løsningsmidlet, ble reaksjonen startet ved tilsetning av 4 heter (2 ul) av humant DNA topo IIα og utført ved 37 ° C i 30 min. Reaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 2 pl av 10% natriumdodecylsulfat (SDS), etterfulgt av spaltning med 2 pl proteinase K (50 pg /ml) ved 37 ° C i 15 minutter for å nedbryte enzym. Etter tilsetning av 2 ul av lastebuffer (0,25% bromfenolblått og 50% glycerol) tilsatt til blandingen, ble prøvene applisert på 1% agarosegel. Elektroforese ble utført ved 66 V (2 V /cm) i 5 timer i TBE-buffer ved bruk av Biorad Elektrofore Gel System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Supercoil DNA (pHOT1 DNA) og avslappet DNA ble inkludert i elektroforese drives som markører for DNA-topologi. Gelene ble deretter farget i 0,5 mikrogram /ml gel rød i TBE i 30 min og avfarget i 15 minutter i destillert vann før digital bildeinnsamling ved bruk Gel Doc 100 system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
en enhet av topoisomerase II-aktivitet ble definert som den minimale mengde enzym som kreves for å oppnå fullstendig relaksasjon av 0,5 mg superhelical pHOT1 DNA i 30 minutter ved 37 ° C. Inhibering av topoisomerase II avslapping aktivitet ble undersøkt ved hjelp av den samme prosedyren ved hjelp av fire enheter enzym og 100 pM testforbindelser. Den prosentvise inhibering ble beregnet ved følgende formel: hvor S
kontroll er den prosent av supercoil DNA i kontrollfilen (uten enzym og testforbindelser), S
0 er den prosent av supercoil DNA i kjørefelt uten test~~POS=TRUNC og S er den prosent av supercoil DNA i kjørefelt med testforbindelsene og enzym.
real Time RT-PCR-analyse
genekspresjonsprofiler ble oppnådd fra HepG2-celler behandlet med DHA-estere av phloridzin eller sorafenib eller DMSO behandlet kontrollceller. Totalt RNA ekstraksjon ble utført ved anvendelse av Arum total RNA MINIKIT (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). RNA-konsentrasjon og renhet ble bestemt ved å måle absorbansen ved hjelp av et Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA). RNA integritet ble vurdert ved formaldehyd-agarosegel-elektroforese. RNA (400 ng) ble brukt til å syntetisere cDNA ved hjelp av RT
2 First Strand kit (SABiosciences, Frederick, MD, USA). RT
2 RNA QC PCR arrays (SABiosciences, Frederick, MD, USA) ble brukt for å vurdere kvaliteten på cDNA prøvene før karakterisering med menneskelig kreft narkotika mål RT
2 profiler PCR array (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Genuttrykk profiler av 84 gener ble undersøkt ved hjelp av menneskelig kreft narkotika mål RT
2 profiler PCR array (PAH-507ZD) på en Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved hjelp av RT
2 sanntid SYBR grønn PCR mester mix (SABiosciences, Frederick, MD, USA). Matrisen har også fem referansegener (beta-2-mikroglobulin (B2M), hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), ribosomalt protein L13a (RPL13A), glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH), og aktin beta (ACTB), tre revers transkripsjons kontroller (RTCs), tre positive PCR-kontroller (PPCs) og en genomisk DNA-kontroll (GDC) og lage opptil 96 analyser. etter normalisering med RPL13A referanse genet, genuttrykk nivåer ble individuelt vurdert ved hjelp terskelen syklus (Ct) verdier ved hjelp av RT
2 profiler PCR tabellens dataanalyse programvare (Microsoft Excel-basert program for SABiosciences, Mississauga, ON, Canada) Den beregner: 1) ΔCt av hvert gen = Ct av genet av interesse – gjennomsnittlig Ct av valgt referanse. gener 2) ΔΔCt for hvert gen på tvers av to grupper; ΔΔCt = ΔCt (Pz-DHA ester eller sorafenib) – ΔCt (kontroll) 3) fold-endring for hvert gen fra kontrollgruppen til Pz-DHA ester behandlede gruppen som 2
(- ΔΔCt). RT
2 RNA QC PCR data viste ingen genomisk DNA forurensning (Ct 35 vil indikere minst GDC) eller tilstedeværelse av urenheter i RNA prøver basert på Ct verdien av PPC (Ct skal være 20 ± 2 på hver array) og viste ingen hemming av revers transkripsjon basert på Ct-verdier på RTC og PPC. Reproduserbarhet ble opprettholdt ved hjelp av tre biologiske replikater fra tre individuelle eksperimenter.
Statistiske analyser
EF
50 verdier ble beregnet ved hjelp Graphpad Prism 6 programvare (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av statistisk Analysis System (SAS, versjon 9.2). Enveis ANOVA med Tukey innlegg hoc sammenligninger på P 0,001 ble brukt for statistiske sammenligninger. Alle data er presentert som en middelverdi med sin standardavvik angitt (Mean ± SD).
Resultater
antiproliferativ effekt av fettsyreestere av phloridzin i ulike kreft og normale celler
i denne studien ble potensielle cytotoksiske effekten av fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, frie fettsyrer og phloretin samt standard kommersielle kreftmedisiner undersøkt på menneskelig hepatokarsinom (HepG2), bryst adenokarsinom (MDA-MB-231) og akutt monocytisk leukemi (THP-1) cellelinjer, primære normale humane hepatocytter og leverceller fra rotte ved hjelp av MTS-analyse. Analysen viste at fettsyreestere av phloridzin dreper HepG2, MDA-MB-231 og THP-1-celler i en tilsvarende grad og i en dose (figur 1) og tidsavhengig måte (tabell 1). Etter 24 timers inkubering i HepG2 celler, antiproliferation EC
50 for stearinsyre, oljesyre, linolsyre, α-linolensyre, DHA og EPA estere av phloridzin var 37,8, 31,5, 29,2, 53,1, 51,9 og 26,8 uM hhv . EF
50 var 35,2, 37,9, 32,3, 63,8, 55,5 og 26,5 mikrometer i MDA-MB-231 celler. EC
50 verdiene for disse estere på THP-1-celler var 40,7, 2,1, 6,2, 35,7, 27,3, og 14,8 uM. Selv om fettsyreestere av phloridzin viste høy styrke som antiproliferativt middel, var ingen av modermolekylet, phloridzin og individuelle fettsyrer viste noen effekt på cellelevedyktighet (EF
50 100 uM) av HepG2, MDA-MB-231 eller THP -1 celler. Interessant nok viste aglykon phloretin en signifikant antiproliferativ virkning (EF
50 39,6 uM) i THP-1-celler (tabell 1).
Lever karsinom (HepG2-celler) og normale humane hepatocytter (HP-F) og leverceller fra rotte (RTCP10) celler ble eksponert for testforbindelser på 1, 10, 50, 100 uM i 24 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved bruk av MTS-analyse. Dataene er presentert som prosent levedyktigheten i forhold til kjøretøyet bare behandlet kontrollgruppe. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3) er representative for minst tre separate uavhengige eksperimenter. * P 0,05 signifikant forskjellig fra bilen bare styre gruppen (Tukey HSD, P 0,01).
For å vurdere spesifisiteten av fettsyreestere av phloridzin til kreftceller, narkotika effekt på celleviabilitet i normale hepatocytter ble kvantifisert ved cytotoksisitet analysen i både normal menneskelig (HP-F) og rotte (RTCP10) hepatocytter. HP-F-celler ble behandlet med 100 uM og lavere konsentrasjoner av alle fettsyreestere av phloridzin, phloridzin, fettsyre, sorafenib og floretin i 24 timer (tabell 1). Fettsyreestere av phloridzin påvirket ikke levedyktigheten av normale humane hepatocytter med EC
50 100 uM, og er mer spesifikk for kreftcellelinjer (tabell 1, figur 1). I 100 uM behandling av fettsyreestere av phloridzin i 24 timer, fettsyreestere av phloridzin viste minst giftighet (mer enn 90% levedyktighet) i rotteleverceller også (figur 1). De mest lovende og mest selektive cytotoksiske aktiviteter ble oppdaget i Pz-DHA og Pz-EPA estere. Fettsyreestere av phloridzin bortsett Pz-stearinsyre (ca. 50% levedyktighet) viste mye mindre aktivitet ved inhibering av celle-levedyktighet (mer enn 80% levedyktighet) av leverceller fra rotte enn for kreftcellelinjer. Disse resultatene tyder på at fettsyreestere av phloridzin kan ha moderat til minimale bivirkninger. De mest lovende og mest selektive cytotoksiske aktiviteter ble oppdaget med Pz-DHA ester. EF
50 (uM) og SI-verdier av Pz-DHA i HepG2, MDA-MB-231, THP-1 var 51,9 (SI = 11,2), 55,5 (SI = 10,5), og 27,3 (SI = 21,38) henholdsvis (tabell 1). DHA er en vanlig kosttilskudd omega-3 fettsyrer og det også besitter antiproliferative egenskaper [20]. Derfor Pz-DHA ester ble valgt for genekspresjon studie ved hjelp av humant medikamentmål RT
2-PCR matrise som viste den sterkeste cytotoksisk virkning på kreftceller og var den minst toksiske på normale celler sammenlignet med andre fettsyreestere av phloridzin
