Abstract
Selv om kreft er ansett å være opprettholdt av stamceller, har eksistensen av stamceller i nyrecellekreft (RCC) sjelden blitt rapportert, delvis på grunn av mangel av unike overflatemarkører. Vi her identifisert kreftstamcelleliknende celler med side befolkningen (SP) fenotype i fem menneskelige RCC cellelinjer. Strømningscytometri-analyse viste at 769P, en human celle klar RCC-cellelinje, inneholdt den største mengde av SP-celler sammenlignet med andre fire cellelinjer. Disse 769P SP celler besatt kjennetegn ved spredning, selvfornyelse og differensiering, samt sterk motstand mot kjemoterapi og strålebehandling som ble muligens relatert til ABCB1 transporter.
In vivo
eksperimenter med serie tumor transplantasjon i mus viste også at 769P SP celler dannes svulster i NOD /SCID-mus. Samlet utgjør disse resultatene indikerer at 769P SP celler har egenskapene til kreft stamceller, som kan spille en viktig rolle i tumordannelse og terapi-motstand av RCC
Citation. Huang B, Huang YJ, Yao ZJ, Chen X, Guo SJ, Mao XP, et al. (2013) Cancer Stem Cell-Like Side Befolknings Celler i Clear nyrecellekarsinom cellelinje 769P. PLoS ONE 8 (7): e68293. doi: 10,1371 /journal.pone.0068293
Redaktør: Neil A. Bhowmick, Cedars Sinai Medical Center, USA
mottatt: 1 mars 2013, Godkjent: 28 mai 2013; Publisert: 11.07.2013
Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Natural Science Foundation (No. 81272809, nr 80202011, nr 81202013, nr 30872584); Guangdong Natural Science Foundation (No. 8251008901000018, nr S2012040007557); Sun Yat-sen Innovative Talenter Dyrking Program for Excellent Lærere (nr 80000-3126205); Vitenskap og teknologi Planning Project i Guangdong-provinsen, Kina (No. 2011B050400021, nr 2012B090600021, nr 445323198311050317); og Guangdong Key Laboratory of Urology, den første tilknyttet Hospital i Guangzhou Medical University (nr 2010A060801016). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nedsatt kreft er et viktig helseproblem, forårsaker over 15.000 dødsfall i Nord-Amerika årlig. Renal cancer med metastase eller i det avansert stadium hos voksne er resistente til konvensjonelle kjemoterapeutiske medikamenter [1]. Belyse dannelsen av denne kreft vil hjelpe tidlig diagnose og behandling, og dermed bedre prognosen.
Solide svulster er sammensatt av ulike typer celler med ulik kapasitet på spredning. Bare en liten populasjon av disse cellene kan danne tumorer i mus med immunsvikt [2]. Denne observasjonen har ført til konseptet med kreft stamceller (cscs), såkalt tumor initiere celler eller stilk lignende cancerceller [3], [4], [5], [6], som er tenkt stand prolifererende, selvfornyende, og differensiere til flere linjene, og dermed spille en viktig rolle i både utvikling og behandling av svulster [2], [3]. Selv om cscs har blitt isolert fra flere typer humane tumorer, inkludert hematologiske cancere [7], eggstokk-kreft [8], prostatakreft [9], brystkreft [10], og hjernetumorer [11], mangel på CSC-spesifikk celleoverflateantigen markører er avgrenset videre undersøkelser på dette emnet [12]. Side befolkningen (SP) er en flowcytometri (FCM) begrep å definere cellegrupper med sterk evne til å utstrømming DNA fargestoff Hoechst 33342 via ABC transportører. Side populasjonsceller forsvinner etter behandling med enten kalsiumkanalblokkere eller hemmere av ABC-transportører, slik som verapamil og rapamycin [13] .Dette aktivitet fører til «side» (lav fluorescens) fenotype av befolkningen og antas å være en grunnleggende egen- -beskyttende funksjon og således en universell kjennetegn på stamceller [14], [15]. Siden den først ble introdusert av Goodell et al. i 1996 [16], er SP-celler blitt mye rapportert å være anriket i forskjellige cancervev som brystkreft [17], gastrointestinale system tumor [18], og små-celle lungekreft [19] og fra cellelinjer som nasofaryngealt karsinom [20], hepatocellulært karsinom [21], og blærecancercellelinjer [22]. SP celler, med stemness potensialer, kan danne xenografttumorer i dyr og er motstandsdyktig mot kjemoterapi og strålebehandling, og bidrar til svulst tilbakefall [23].
RCC, den tredje vanligste kreft i urinveiene, står for omtrent 3% av alle menneskelige kreftformer. RCC er klassifisert som klart celle, papillær, chromophobe, samlekanal, og Uklassifisert RCC, med klarcellet RCC (CCRCC) som den mest utbredte typen. Som står for 82% av RCC. Behandling av metastatisk CCRCC gjenstår å være en stor utfordring for klinikere og forårsaker omtrent 35% av RCC relatert dødelighet [24]. RCC saker har vært jevnt økende i flere tiår [25]. Videre er de fleste pasienter som allerede har enten metastatisk sykdom ved første diagnose eller fjernmetastaser etter primær tumorreseksjon [26]. Prognosen for RCC er dårlig delvis på grunn av motstand fra metastatisk RCC til de fleste aktuelle behandlinger, for eksempel cellegift og strålebehandling. Målrettet terapi mot cscs kan bringe nytt håp for å bedre prognosen for pasienter med RCC.
Selv om betydelige fremskritt har blitt gjort i SP forskning, forblir rolle SP celler i RCC å være fullt bestemt [27], [28 ], [29], [30]. Addla et al. [29] har rapportert at både normale og ondartede renale epitelceller inneholdt en del av SP-celler som var berike med noen stamcelle-lignende egenskaper. I den senere tid Nishizawa et al. [30] har funnet at SP-celler avledet fra RCC celler viste høyere tumor-initiering evne enn NSP celler. Derfor hypotese vi at SP-celler er en beriket brøkdel av kreftstamceller.
Denne studien ble gjennomført for å identifisere SP celler fra etablerte menneske RCC cellelinjer og for å fastslå deres egenskaper og roller i tumorigenesis og behandling av RCC. Her, isolerte vi SP-celler fra 769P-celler, en human cellelinje CCRCC, ved Hoechst farging og flowcytometri. Våre in vitro og in vivo eksperimenter vist at SP celler besatt de velkjente CSC kjennetegn ved spredning, selvfornyelse og differensiering, samt sterk motstand mot kjemoterapi og strålebehandling som ble muligens relatert til ABCB1 transporter. Disse funnene kan gi ny innsikt for fremtiden CSC forskning og klinisk anti-kreft terapi.
Materialer og Metoder
Cell Kultur
Fem menneske RCC cellelinjer 769P, 786-O , OS-RC-2, SN12C, og SKRC39 ble anvendt i denne studien. Cellelinjer 769P og 786-O ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA); OS-RC-2, SN12C, og SKRC39 var velvillig Gitt av Dr. Zhuowei Liu (Department of Urology, Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center), som fikk disse cellelinjer fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) [31], [32], [33]. 769P, 786-O, OS-RC-2, og SKRC39 celler ble dyrket i RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, California, USA), mens SN12C-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco) ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Begge media inneholdt 10% føtalt kalveserum (FCS, Gibco), 1% (v /v) penicillin, og 100 mikrogram /ml streptomycin.
Side Befolkning Analyse og Cell Sorting
Side befolkningen analyse og cellesortering ble utført som tidligere beskrevet av Goodell et al. [16] med modifikasjoner. I korthet ble cellene trypsinert, suspendert i 1 x 10
6 celler /ml i forvarmet RPMI-1640 inneholdende 2% FBS og 10 mmol /l HEPES (Gibco) og deretter inkubert med 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma , St. Louis, MO, USA), enten alene eller i kombinasjon med 50 umol /L verapamil (Sigma), en ABC-transportør-inhibitor, i mørket i 90 min i 37 ° C vannbad med leilighetsvis blanding. Ved slutten av fargingen ble cellene spunnet ned og resuspendert i kald HBSS (Gibco) inneholdende 2% FBS og 10 mmol /l HEPES. FCM analyse og cellesortering ble deretter utført direkte på EPICS ALTRA Flow Cytosorter (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Hoechst 33342 var spent med 100 mW UV laser og ble påvist med 450 BP filter for blå fluorescens og 675 BP filter for rød fluorescens. En 610-
nm dichroic speil kort Anmeldelser –
passere plakater (DMSP) filter ble brukt for å skille emisjonsbølgelengder. En mangekantet levende gate i FS-HO blå tomten ble opprettet for å utelukke rusk og døde celler. SP celler og ikke-SP (NSP) celler ble sortert for følgende analyser.
Clone Dannelse og langsiktig Differensierings Analyser
Under autoclone sorteringsmodus hver 500. 769P celler av SP eller NSP fenotype ble sortert direkte inn i en 6 cm kulturskål og dyrket med RPMI-1640 fullstendig dyrkningsmedium i 10 dager. Etter at de fleste cellekloner hadde utvidet til mer enn 50 celler, ble de vasket to ganger med PBS, fiksert i 75% metanol i 15 min, og farget med krystallfiolett i 15 min ved romtemperatur. Etter inkubering ble retter skylt og antallet kloner som inneholdt mer enn 50 celler ble tellet under et fasekontrastmikroskop. Klonen formasjonen effektivitet var forholdet mellom antall kloner til antall seeded celler. Klon formasjons analysene ble gjentatt i triplikat.
Den langsiktige differensiering Analysen ble utført 10 dager etter cellesortering, i henhold til protokollen til sidepopulasjonsanalyse, for å bestemme evnen til differensiering og SP NSP celler.
Oppdager mRNA uttrykk av ABC familiemedlemmer i Ordnet 769P SP celler ved RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert fra SP og NSP celler separat ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, San Diego, California). Uttrykket av ABCB1, ABCC1, og ABCG2 ble påvist ved hjelp av PrimeScript
TMRT-PCR Kit (Takara, Otsu, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne (tabell 1) ble designet og syntetisert ved Invitrogen. GAPDH ble anvendt som en intern referanse. PCR-betingelsene var denaturering ved 94 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 40 sykluser annealing ved 94 ° C i 45 s, 58 ° C i 30 s, og 72 ° C i 45 s, med forlengelse ved 72 ° C i 8 min . PCR-produktene ble analysert ved elektroforese på 1,5% agarose for mRNA uttrykk av ABC familiemedlemmer.
Oppdager Protein Expression of ABC familiemedlemmer i Ordnet 769P SP celler ved Western blotting
totale proteiner ble ekstrahert fra SP og NSP cellene hver for seg og denaturerte i natriumdodecylsulfat (SDS)-prøvebuffer, og deretter like applisert på 8% polyakrylamidgel. Etter elektroforese ble proteinene overført til en polyvinylidendifluorid-membran. Blottene ble inkubert med angitte primære antistoffer over natten ved 4 ° C, og deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff, og til slutt ble påvist ved å bruke forbedrede Chemiluminescence Western blotting påvisningsreagenser (GE Healthcare, UK). Musen ABCG2 (ved 1:1,000 fortynning), ABCB1 (1:1,000), og ABCC1 (1:5,000) monoklonale antistoffer fra Abcam Inc. (Cambridge, UK) samt anti-GAPDH (1:2,000) fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA) ble benyttet for å bestemme relative protein nivåer.
stråling og medikamentsensitivitet Analyser
for å bestemme sensitiviteten av celler til stråling, fersk sortert SP og NSP cellene sådd i 6-brønns plater (500 celler /brønn), og ble utsatt for 5 Gy av røntgen (500 cGy /min, ved anvendelse av en 12 cm x 6 cm bestrålingsfelt) med eller uten 30 minutter pre-inkubasjon med verapamil (50 mikromol /L) dagen etter sortering. Når de fleste cellekloner hadde mer enn 50 celler, ble de farget med krystallfiolett å bestemme antall overlevende celler.
For å bestemme følsomheten av celler til narkotika, SP og NSP celler ble sådd i 96-brønners plater (500 celler /brønn) og dyrket med mitoksantron (MTX, en topoisomerase II-inhibitor anti-neoplastisk middel, Sigma), 5-fluorouracil (5-FU, Sigma), eller sunitinib (en tyrosin-kinase-inhibitor, Sutent, Pfizer, New York, USA ) følgende dag i en konsentrasjonsgradient, med eller uten 30 minutters preinkubering med 50 umol /ml verapamil som en chemosensitizer til mitoxantron. Ubehandlede celler ble anvendt som kontroll. ble satt fire parallelle brønner for hver gruppe. Etter 3 dager absorbansen til hver brønn ved en bølgelengde på 570 nm (
A
570) ble målt. Cell overlevelse ble beregnet ved hjelp av formelen: overlevelse = (gjennomsnittlig
En
570 av testbrønner /bety
En
570 av kontrollbrønnene) × 100% . Hemming ble beregnet ved hjelp av formelen:. Hemming hastighet = 100% – overlevelse
Xenotransplantat svulstdannelse analysen
Dyreforsøk ble utført i henhold til Guide for omsorg og bruk av laboratorie dyr av Sun Yat-sen-universitetet. Protokollen ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk i First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen-universitetet. Totalt 54 5- til 7 uker gamle nonobese diabetiker (NOD) /alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) hunnmus ble oppnådd fra Experimental Animal Center of Sun Yat-sen-universitetet. Musene ble delt i 6 grupper, med 9 mus i hver gruppe. Angitte mengde av ferskt sortert SP og NSP Cellene ble suspendert i 200 ul PBS, hver for seg, og inokulert subkutant i aksillære fossa av NOD /SCID-mus umiddelbart etter sortering. Musene ble overvåket to ganger per uke for dannelsen av palpable tumorer. Ved 6 uker etter inokulering, ble musene avlivet for å vurdere tumordannelse. Tumorer ble målt ved anvendelse av en Vernier skyvelære, veiet, og fotografert. En porsjon av hver subkutan tumor ble oppsamlet, fiksert i 10% formaldehyd, og innstøpt i parafin for patologisk vurdering etter H 0,5 mm fragmenter og alle synlige klumper ble fjernet, deretter spaltet med 1 mg /ml kollagenase type II (Sigma) og 1,2 mg /ml Dispase (Sigma) i 45 til 90 min ved 37 ° C. Av og til, ble 0,2 mikrogram /ml trypsin (Invitrogen) som brukes i 10 minutter for å sikre dissosiasjon inn i enkeltceller. Celler ble filtrert gjennom på hverandre følgende 70-um celle siler for å fjerne gjenværende klumper. Oppsamlede celler ble suspendert i PBS supplert med 1% FCS. Minst 100.000 høstede celler ble farget for SP-analyse. Tyve 5- til 6-uker gamle SDIC hunnmus ble likt fordelt i 4 grupper for serietransplantasjon assay. Hver 5.000 celler dissosiert fra en xenograft tumor, som ble dannet med 2000 SP celler, 20.000 SP celler, 20.000 NSP celler, eller 200.000 NSP celler, ble re-inokulert i en NOD /SCID mus. Svulstdannelse vurdering og patologisk undersøkelse ble utført 6 uker senere.
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (SD) fra minst tre uavhengige eksperimenter. Microsoft Office Excel 2007 og SPSS13.0 programvare ble brukt for databehandling. Statistisk signifikans ble bestemt med Student
t
test. En
P
verdi 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Eksistens av SP Celler i RCC cellelinjer
Fem RCC cellelinjer ble analysert for. sine SP fenotyper. R2 gate viser at prosentandelen av SP-celler, med dim Hoechst 33342 fluorescens, falt fra 4,82% blant 769P celler uten verapamil behandling til 0,02% blant 769P celler med verapamil pre-inkubering (Fig. 1A). Retesting av sorterte cellene viste en renhet på 96,61% for SP celler og 99,89% for NSP celler (Fig. 1B). For de fire andre RCC-cellelinjer, forholdene mellom SP-celler i 786-O og OS-RC-2-celler var henholdsvis 0,1% og 0,2%, noe som var for lave for de følgende forsøk; Det er ingen SP-celler ble detektert blant SN12C og SKRC39-celler (fig. S1). Derfor ble SP og NSP celler sortert fra 769P celler for senere eksperimenter.
A, SP sortering ved hjelp av Hoechst 33342. En kantet levende gate ble opprettet for å utelukke rusk og døde celler. Minst 50.000 celler ble anskaffet for å analysere SP fenotypen til hver prøve. Prosentandelen av SP-celler utelatt når 769P cellene ble pre-inkubert med verapamil å blokkere ATP transportør. B, renheten av fersk sortert 769P SP og ikke-SP (NSP) celler var 96,61% og 99,89% (1 til 0,11%).
Clone Dannelse og Differensiering av Ordnet 769P SP og NSP Cells
Etter 7 dager i kultur, de fleste kloner inneholdt mer enn 50 celler. Vi telles antall kloner og funnet at den midlere klon dannelsen effektiviteten av SP-celler som var signifikant høyere enn den til NSP-celler [(56,4 ± 1,3)% vs. (22,7 ± 1,5)%,
P
0,001; Fig. 2A).
A, klone formasjons analyser indikerer at klonen dannelsen effektiviteten av ferskt sortert SP-celler var høyere enn for NSP celler. **
P
0,01. B, på 10 dager etter sortering, andelen av SP-celler (angitt med R2 gate) blant sortert SP-celler og sortert NSP-celler ble målt. Andelen SP celler blant sorterte SP celler er kun 19,51%, noe som tyder på at de fleste sorterte SP celler blir differensiert i NSP celler. Andelen SP celler blant sorterte NSP celler er bare 2,39%, noe som tyder på at sorterte NSP celler ikke kan differensiere til SP celler.
Etter 10 dager med kultur, mest sortert 769P SP celler differensiert i NSP celler, mens bare en liten andel av SP celler ble oppdaget blant sortert 769P NSP celler (fig. 2B), noe som tyder evne SP celler til å fornye seg selv og skille ut NSP celler.
uttrykk av ABC familiemedlemmer i Ordnet 769P SP og NSP Cells
uttrykk for ABCB1 ble ABCG2, og ABCC1 oppdaget av RT-PCR og Western blotting. Begge forsøk viste at ABCB1 ble uttrykt ved høyt nivå i sorterte SP-celler, men på et ganske lavt nivå i sorterte NSP celler, mens ABCC1 og ABCG2 var upåviselig i enten sortert SP eller NSP-celler (Fig. 3).
A, revers transkripsjon-polymerase chain reaction. B, Western blotting. Lane 1, sortert NSP celler; lane 2, sortert SP celler. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Begge forsøkene viser at ABCB1 uttrykket er sterkere i SP enn i NSP celler og at ABCG2 og ABCC1 er ikke uttrykt i SP og NSP celler.
Følsomhet for Ordnet 769P SP og NSP celler til Radiation and Drugs
Vi målte følsomheten sortert 769P SP og NSP celler for stråling ved klone-analysen. Klonen dannelsen effektivitet av SP-celler som var signifikant høyere enn den til NSP celler enten før eller etter bestråling (
P
0,05, Fig. 4A). I detalj, gjorde klone dannelsen effektiviteten av SP celler ikke endre bemerkelsesverdig etter stråling (
P
0,05), mens det av NSP celler sunket dramatisk (
P
0,05), noe som tyder at SP-celler var mer resistente overfor røntgen skade enn NSP-celler.
A, klone dannelsen effektiviteten av sortert 769P SP-celler er signifikant høyere enn den til NSP celler enten før eller etter 5 Gy av røntgen bestråling. Klonen dannelsen effektivitet av SP-celler er signifikant høyere enn den til NSP-celler etter bestråling (
P
0,01); klonen dannelsen effektiviteten av ubestrålte NSP cellene er betydelig høyere enn for bestrålte NSP-celler (
P
0,05). B, nylig sortert 769P SP cellene er mer motstandsdyktig mot mitoxantrone enn NSP celler (
P
0,01), mens denne motstanden er reversert med verapamil forbehandling. C, SP celler er også mer motstandsdyktig mot 5-fluorouracil enn NSP celler (
P
0,05). Motstanden kan også bli reversert med verapamil forbehandling. D, følsomheten av SP celler til sunitinib er lik som NSP celler (
P
0,05)
Vi målte også følsomheten av sortert 769P SP og NSP celler. til MTX, 5-FU og sunitinib. SP celler viste sterk motstand mot metotreksat, mens NSP cellene følsomme for MTX (
P
0,001). Verapamil, en ABC-transportør-inhibitoren, forbedret inhiberende effekt av MIX på SP-celler, med en spredning inhibering hastighet lik den i NSP celler under de samme betingelser (
P
0,05); Men verapamil ikke klarte å forsterke effekten av MIX på NSP celler (
P
0,05) (figur 4B.). Vi fant også at SP celler var mye mer motstandsdyktig mot 5-FU enn NSP celler (
P
0,05, Fig. 4C), men deres overfølsomhet for sunitinib var lik (
P
. fig. 4D)
Tumor Dannelse av Ordnet 769P SP og NSP celler i NOD /SCID-mus
Ordnet 769P SP og NSP celler ble inokulert i NOD /SCID mus for å observere deres evnen til å danne svulster. En mus som ble inokulert med 20.000 NSP celler og en med 200.000 NSP cellene døde etter vaksinasjonen. Ved 6 uker etter inokulering celle, 2 musene utviklet tumorer med kun 200 SP-celler, mens den laveste mengden av NSP celler til å danne svulster var på 20.000 celler (figur 5A;. Tabell 2). Patologisk undersøkelse bekreftet at svulstene dannet med SP og NSP celler viste de samme egenskapene som typiske RCC celler akkurat som usorterte 769P celler (fig. 5B).
A og B, injeksjons av NOD /SCID mus ved 6 uker etter vaksinasjon med fersk sortert SP eller NSP celler. Svulster er observert i alle mus inokulert med 2000 SP-celler, men ikke i mus inokulert med 2000 NSP-celler. C og D viser Patologisk undersøkelse typisk nyrecellekreft hos mus inokulert med enten 2000 SP celler eller 200.000 NSP celler.
For å bekrefte postulerte rolle SP celler i tumordannelse, en svulst dannet med 200 SP-celler og en svulst utformet med 20.000 NSP-celler ble dissosiert i cellesuspensjon henholdsvis, og ble merket med Hoechst 33342. FCM-analyse viste at andelen av SP-celler var høyere i SP-celle-formet tumor enn i NSP celle-formet tumor . (fig. 6), noe som tyder in vivo selvfornyelse og NSP-differensiering av SP celler
En ble cellene dissosiert fra svulsten dannet med 200 769P SP celler; B, ble cellene dissosiert fra tumor utformet med 20.000 769P NSP-celler. Andelen SP celler var høyere hos SP celle-formet svulst enn i NSP celle-formet tumor (1,5% vs. 0,2%).
For ytterligere å bestemme tumordannelse evne andregenerasjons SP -celler, ble inokulert vi 5000 SP-celler (fra 2 tumorer dannet med 20.000 og 2.000 SP-celler, henholdsvis) eller 5.000 NSP-celler (fra 2 tumorer dannet med 200.000 og 20.000 NSP-celler, henholdsvis) i NOD /SCID-mus. Alle musene utviklet tumorer 6 uker etter inokulering. Andre generasjon NSP svulster var betydelig mindre og lettere enn de andre generasjon SP tumorer (
P
0,01; Fig. 7A og B). Alle andre generasjons tumorer ble histologisk identisk med primær xenografttumorer (Fig. 7C). Disse resultatene indikerte at SP-cellene var i stand til å danne svulster i serie.
A, NOD /SCID-mus ble inokulert med 5000 andregenerasjons SP-celler fra en svulst utformet med 2000 SP-celler eller med 5000 andregenerasjons NSP cellene fra en svulst dannet med 200.000 NSP celler. Tumorene ble fjernet fra mus 6 uker etter inokulering. B, andre generasjon SP svulster er betydelig tyngre enn andre generasjons NSP svulster (**
P
0,01). C viser Patologisk undersøkelse at både andregenerasjons SP svulsten og andre generasjon NSP svulst er histologisk identisk med primær xenografttumorer.
Diskusjoner
I de senere årene, forsker på cscs i solide tumorer har vist bemerkelsesverdige funn. I denne studien ble det isolert SP-celler fra humane store celle RCC-cellelinjer for å bestemme biologiske egenskapene til denne cellepopulasjon.
Vi fant at 4,8% av RCC 769P celler ble SP-celler, som viste evne til selv- fornyelse og multi-avstamning differensiering. En klon dannelsen effektiviteten av SP-celler som er høyere enn den for NSP-celler ble observert. I tillegg SP-celler viste tumordannelse evne på minst 100 ganger høyere enn for NSP celler. Tumorer ble dannet i NOD /SCID-mus som var inokulert med bare 200 ferskt sortert SP-celler, mens i det minste 20.000 NSP-celler var nødvendig for å danne tumorer i mus. Disse resultatene gir direkte bevis for den høye tumorigenitet av SP celler.
Selv fornyelse og multi-avstamning differensiering kapasitet er kjennetegnene på stamceller. Seriell transplantasjon av celler i dyremodeller, selv om ufullkommen, kan bidra til å vurdere stabiliteten av SP-celler i biologiske atferd. Vår SP re-sortering analyse etter serie transplantasjon av SP celler i mus viste at annengenerasjons SP celler avledet fra SP celle xenografttumorer beholdt evnen til selvfornyelse og multi-avstamning differensiering. Videre celler fra både SP og NSP xenografttumorer beholdt evnen til å danne svulster hos mus, men andre generasjons SP svulster var betydelig tyngre enn andre generasjons NSP svulster, noe som tyder på at 769P SP celler er mer tumorigent enn NSP celler.
Cancer stamcelle anses i stand til å gjennomgå en asymmetrisk selvfornyende celledeling, dele inn en stamcelle og en stamcelle, som kan generere en rekke mer differensierte funksjonelle celler som omfatter av hele tumoren samfunn [35]. I vår studie, renhet sortert 769P SP celler var 96,61%, og at av sortert NSP cellene var 99,89%. Det er mulig at noen SP celler kan ha festet til NSP celler og derfor er samlet sammen. Etter 10-dagers kultur, sortert SP cellene utviklet seg til et fellesskap som inneholder 19,51% SP celler og ca 80% NSP celler, mens de sorterte NSP cellene utviklet seg til et fellesskap som bare inneholder 2,39% SP celler som kan oppstå fra noen snik-in SP celler under sortering. NSP celler kan danne noen mindre kolonier og også regenererte svulster selv om svulstene var mindre. Tatt funnene fra langsiktig differensiering og serie transplantasjon eksperimenter sammen, det sterkt anbefalt at SP celler gjennomgå asymmetrisk divisjon og er i stand til å differensiere til NSP celler og danner hoveddelen av svulsten. Kapasiteten til NSP celler til å danne kolonier og svulster, som var mye svakere enn kapasiteten til SP celler, kan forklares med den lille andelen snike-i SP celler blant sorterte NSP celler.
SP fenotype er bestemmes av statusene ABC transportører ABCB1, ABCC1-5, og ABCG2 [36]. Dermed er SP celler sorteres ved å måle den raske utstrømning av lipofile fluorescerende fargestoffer ved ABC-tilhengere [16]. De fleste tidligere studier har fokusert på funksjonen av ABCG2, samtidig som nødvendigheten av pumpefunksjonen av ABCB1 i stamcelle-ekspansjon var under debatt [37]. I vår studie, uttrykket av ABCB1 var høy i SP celler, men lav i NSP celler som registreres av både RT-PCR og Western blotting. Interessant nok var hverken ABCC1 eller ABCG2 uttrykt i SP og NSP-celler, hvilket antyder at bare ABCB1 bidrar til den funksjon av SP fenotype i cellene 769P.
I henhold til den CSC teori, cscs i faste tumorer er resistente overfor kjemoterapi og strålebehandling, og bosatt cscs som overlevde behandlingen kan reformere svulster [38]. Vi har utført kjemosensitivitet og Radiosensitivity analyser for å sammenligne følsomheten av SP og NSP celler til konvensjonell terapi. Vi har funnet at SP-celler var mer resistente overfor stråling enn NSP-celler. I tillegg SP cellene mer motstandsdyktig mot MIX og 5-FU enn NSP celler, noe som indikerer at SP celler er allment resistente mot konvensjonelle cellegifter. Imidlertid kan dette stoffet motstand reverseres ved forbehandling med verapamil, en ABC transportør inhibitor, som tyder på at ABC transportører kan være ansvarlig for legemiddelresistens [36], [37], [39].
I konklusjonen, vår studien viste at SP celler isolert fra RCC 769P cellelinjen har stamcelleegenskaper gjennom både
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter. Disse SP cellene er preget av sterk spredning potensial, selvfornyelse, differensiering, motstand mot cellegift og stråling, og
in vivo
tumordannelse evne. ABCB1 er blitt funnet å bidra til funksjonen av SP-celler. Forhåpentligvis vil utvikle en behandling rettet mot denne cellen befolkningen bidra til å bedre prognosen for RCC.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
SP celle sortering resultater i humane nyrecellekreft cellelinjer 786-O, OS-RC-2, SN12C, og SKRC39 bruker Hoechst 33342. Bare noen få SP celler ble oppdaget blant 786-O og OS-RC-2 celler og prosentandelen av SP-celler droppet når cellene ble pre-inkubert med verapamil i ca. 30 minutter. ble oppdaget Ingen SP celler blant SN12C og SKRC39 celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0068293.s001 plakater (TIF)
