Abstract
Bakgrunn
Vi har tidligere vist at uttrykket av CBX7 er drastisk redusert i flere humane karsinomer og at dens uttrykk progressivt avtar med utseendet av et meget ondartet fenotype. Målet med vår studie har vært å undersøke mekanismen som tap av CBX7 uttrykk kan bidra til fremveksten av en mer ondartet fenotype.
Metoder
Vi har analysert genuttrykk profilen til en thyroid karsinom-cellelinjen etter gjenopprettelse av CBX7 og, deretter, analyseres den transkripsjonelle regulering av identifiserte gener. Til slutt, vurderte vi uttrykk for CBX7 og regulerte gener i et panel av skjoldbruskkjertelen og lungekarsinom.
Resultater
Vi fant at CBX7 negativt eller positivt regulerer uttrykket av flere gener (som SPP1 , SPINK1, STEAP1, og FOS, FOSB, EGR1, henholdsvis) knyttet til kreft progresjon, ved å samhandle med sine promoter regioner og moduler deres transkripsjonen aktivitet. Kvantitativ RT-PCR-analyser i menneskelige skjoldbruskkjertelen og lungekarsinom vev viste en negativ sammenheng mellom CBX7 og dets nedregulert gener, mens en positiv korrelasjon ble observert med oppregulert gener.
Konklusjon
i konklusjonen, kan tap av CBX7 uttrykk spille en avgjørende rolle i avanserte stadier av kreftutvikling av dereguleringen uttrykket av spesifikke effektor gener
Citation. Pallante P, Sepe R, Federico A, Forzati F, Bianco M, Fusco A (2014) CBX7 modulerer uttrykket av gener Kritisk for kreft progresjon. PLoS ONE 9 (5): e98295. doi: 10,1371 /journal.pone.0098295
Redaktør: Tanya V. Kalin, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 03.10.2013; Godkjent: 30 april 2014; Publisert: May 27, 2014
Copyright: © 2014 Pallante et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-AIRC (IG 5346), Minis dell’Università e della Ricerca SCIENTIFICA e Tecnologica-MIUR (PRIN 2008), «Progetto di Interesse strategico Invecchiamento (PNR-CNR Aging Program) PNR-CNR 2012-2014 «og Progetto PON01-02782:» Nuove strategie nanotecnologiche per la messa en punto di farmaci e presidi diagnostici diretti verso cellule cancerose circolanti «. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekrefter at Pierlorenzo Pallante og Alfredo Fusco er Akademiske redaktørene i PLoS ONE. Pierlorenzo Pallante og Alfredo Fusco sier at dette ikke endrer sin tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
CBX7 er et Polycomb protein medlem av polycomb undertrykkende kompleks 1 (PRC1), en multiprotein kompleks som sammen med polycomb undertrykkende komplekset 2 (PRC2), opprettholder viktige utviklings gener i en transcriptionally trykt tilstand [1] – [3]. Vi har tidligere vist at CBX7 genet er drastisk nedregulert i skjoldbruskkjertelen karsinomer og dets ekspresjon progressivt avtar med ondartet karakter og neoplastiske trinn [4]. Dessuten har flere studier vist at korrelasjonen av tapet av CBX7 med et høyt malign fenotype og en derav følgende dårlig prognose er et generelt arrangement i onkologi. Faktisk har tap av CBX7 uttrykk er nylig blitt vist å være assosiert med økende malignitet karakter i tykktarmen [5], blære [6], bukspyttkjertel [7], bryst [8], gastrisk [9] og lungekarsinom [10] , mens retensjonen av CBX7 uttrykk korrelerer med en lengre overlevelse av tykktarmen og bukspyttkjertelen kreftpasienter [5], [7]. Restaurering av CBX7 ekspresjon i skjoldbruskkjertelen, mage og tykktarm carcinoma-cellelinjer inhiberer cellevekst med en opphopning av cellepopulasjonen i G1 fasen av cellesyklusen, noe som tyder på en negativ rolle CBX7 i kontrollen av G1 /S overgang av cellesyklusen.
det har nylig blitt demonstrert at CBX7 er i stand til positivt å regulere ekspresjonen av genet som koder for E-cadherin [11] som er kjent for å spille en avgjørende rolle i å opprettholde normal epitelial cellemorfologi, og som tap av uttrykk representerer en generell funksjon i epiteliale-mesenchymale overgang [12], [13]. Faktisk har det vist seg at CBX7 er i stand til å bevare ekspresjon av E-cadherin ved å samhandle med histon deacetylase 2 og inhibere dets aktivitet på CDH1 promotoren [11]. Konsekvent, har en direkte sammenheng mellom nivået av E-cadherin og CBX7 uttrykk blitt rapportert i skjoldbruskkjertelen og bukspyttkjertelen karsinom [7], [11]. Derfor vil disse resultatene tyder på at tapet av CBX7 genuttrykk kan spille en avgjørende rolle i de sene stadier av menneskelig carcinoma progresjon.
tumor suppressor rolle CBX7 har blitt ganske nylig bekreftet av fenotype av cbx7 knockout mus. Faktisk disse musene utvikler lever og lunge adenomer og karsinomer, og følgelig mus embryonale fibroblaster (MEFs) avledet fra cbx7 knockout mus har en høyere veksttakt og en redusert følsomhet for alderdom enn sine villtype kolleger [10]. Cyclin E overekspresjon, på grunn av mangel på cbx7 som negativt regulerer dets ekspresjon, sannsynligvis står for fenotypen av cbx7 knockout-mus. En lignende mekanisme er sannsynligvis involvert i human lunge karsinogenese siden Cyclin E oppregulering, assosiert med tap av CBX7 uttrykk, er blitt observert i de fleste av de humane lungekarsinomer analysert [10].
Formålet med fore~~POS=TRUNC liggende~~POS=HEADCOMP studie har vært å undersøke andre mekanismer som tap av CBX7 uttrykk kan bidra til utseendet av et meget ondartet fenotype. Vi først generert seks skjoldbruskkjertelen carcinoma cellekloner som uttrykk for CBX7 har blitt restaurert, og deretter, ved hjelp av kraftige oligonukleotid microarray hybridisering teknikk, analyserte vi genuttrykket profilen til FRO cellelinje der uttrykket av CBX7 ble gjenopprettet, sammenlignet til den samme cellelinje ikke uttrykker CBX7.
Vi fant at CBX7 kunne positivt regulere 120 gener og negativt regulere 196 gener. Blant dem, identifiserte vi flere konkrete effektor gener som SPP1 (som koder for osteopontin protein), hvis funksjon er kjent for å være avgjørende for kjøp av et fullt ondartet fenotype. Kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter vist at CBX7 protein binder direkte til arrangører av disse regulerte gener og funksjonelle studier bekreftet at CBX7 uttrykk var i stand til å modulere arrangører av de CBX7 regulerte gener. Til slutt, analyser kvantitativ RT-PCR viste en invers korrelasjon mellom CBX7 og dets nedregulert gener og en positiv korrelasjon med sine oppregulert de i menneskelige skjoldbrusk og lungekarsinom prøver på forskjellig grad av malignitet.
Til sammen de dataene som presenteres her indikerer at CBX7 negativt eller positivt styrer uttrykket av flere gener som koder for proteiner med en kritisk rolle i menneskelig kreft progresjon.
Materialer og metoder
Microarray analyse
Genechip Menneskelig Gene 1,0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), som består av 764,885 probe sett dekker over 28 869 gener, ble brukt til å evaluere gener forskjellig uttrykt. Hele hybridisering Prosedyren ble utført ved å følge instruksjonene Affymetrix. Forsterker og merking prosesser ble bekreftet ved hjelp av en Genechip Eukaryote Poly-A RNA Kontroll Kit (Affymetrix) med eksogene positive kontroller. 15 mikrogram av hver biotinylert cRNA forberedelse var fragmentert og plassert i hybridisering blanding som inneholder biotinylert hybridisering kontroller (Genechip Expression Hybridisering Controls, Affymetrix). Prøvene ble så hybridisert på en Genechip Humant Gene 1,0 ST Array ved 45 ° C i 16 timer ved konstant rotasjon (60 rpm) i en Hybridisering ovn (Affymetrix). Microarray skannede bilder ble oppnådd med en Genechip Scanner (Affymetrix) med standardinnstillingene. Bilder ble analysert med Affymetrix Gene Expression Analysis Software (Affymetrix). Sammenligninger ble gjort mellom FRO-EV-1 og FRO-CBX7-1 prøver, vurderer FRO-EV-1 som baseline. De ganger endring verdier, indikerer den relative endringen i uttrykket nivåer mellom FRO-EV-1 og FRO-CBX7-1, ble brukt til å identifisere gener uttrykt forskjellig.
Microarray data er tilgjengelige i ArrayExpress database (www .ebi.ac.uk /arrayexpress) under deponeringsnummer E-mtab-2420.
menneskelige vevsprøver
Den menneskelige skjoldbrusk kreft vev, tilstøtende normalt vev eller normale kontralaterale lapper, innhentet fra kirurgisk prøver, var samlet på service d’Anatomo-Pathologie, Centre Hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Frankrike, i henhold til retningslinjene fra etikkutvalg av dette instituttet, og ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen til senere utføre utvinning av RNA.
«TissueScan real-Time Lung Cancer Disease Panel III» av cDNA ble kjøpt fra Origene (Origene Technologies Inc., Rockville, MD). Dette lungekreft cDNA panel (HLRT103) inneholder 8 normale lungeprøver og 40 lungekreft eksemplarer av forskjellig histotype, hvis klinisk patologiske funksjoner er fritt tilgjengelig på følgende adresse: https://www.origene.com/qPCR/Tissue-qPCR- Arrays.aspx.
RNA ekstraksjon, kvantitative real Time PCR (QRT-PCR) og microarray analyse
Total RNA ble ekstrahert fra cellelinjer og vev ved hjelp av RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Integriteten av RNA ble bedømt ved denaturerende agarosegel-elektroforese. For å generere cDNA, ble QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) som brukes til å reversere-transkribere 1 pg av total RNA fra hver prøve. En optimalisert blanding av oligo-dT og tilfeldige primere ble anvendt.
Real-Time Kvantitativ PCR ble utført med CFX 96 thermocycler (Bio-Rad, Hercules, CA) i 96-brønners plater ved hjelp av et sluttvolum på 20 ul. For PCR brukte vi 10 pl av 2 x SYBR grønn (Applied Biosystems, Foster City, CA), 200 nM av hver primer, og cDNA ble generert fra 20 ng av total RNA. Primere som brukes er rapportert i Dataset S1. Termisk protokoll var som følger: 2 min 95 ° C; deretter 45 sykluser 20 sekunder 95 ° C og 1 min 60 ° C. Hver reaksjon ble utført i duplikat, og 2
-ΔΔCT metode ble anvendt for å beregne relative ekspresjonsnivå [14]. G6PD ble brukt som referanse genet.
Cellekulturer og transfections
thyroideakarsinom celler FRO [15] som er tilgjengelige i vårt laboratorium og HEK 293 celler (American Type Culture Collection, LGC Standards Srl, Sesto San Giovanni, Italia) ble dyrket i DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY) supplert med 10% føtalt kalveserum (Life Technologies), 1% glutamin, 1% penicillin /streptomycin (Life Technologies) i en 5% CO
2 atmosfære. FRO og HEK 293 celler ble transfektert med enten Lipofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) og Neon Electroporation System (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. For å generere CBX7 stabilt uttrykker celler ble transfektert celler valgt i et medium som inneholder geneticin (Life Technologies), flere kloner ble plukket og utvidet for videre analyser. Rotte normale thyroid PC-Cl3-celler [16] ble dyrket i modifisert F12-medium supplementert med 5% kalveserum (Life Technologies) og seks vekstfaktorer (tyreotrope hormon, hydrokortison, insulin, transferrin, somatostatin og glycyl-histidyl-lysin; Sigma, St . Louis, MO). PC CL3-celler ble transfektert med kontroll siRNA og siRNA mot rotte cbx7 som tidligere rapportert [11]. Muse embryonale fibroblaster (MEFs) fra cbx7 knockout mus ble etablert, dyrket og transfektert (passasje P3 og P4) som beskrevet andre steder [10].
Protein utvinning og western blot analyse
Protein utvinning og western blot-prosedyren ble utført som tidligere rapportert [11]. Etter elektroforese og blotting prosedyrer, ble nitrocellulosemembraner inkubert over natten med det primære antistoff i et kaldt rom (4 ° C). Membranene ble deretter inkubert med det sekundære antistoff (pepperrotperoksidase-konjugert, 1:3000) i 60 min (ved romtemperatur) og reaksjonsblandingen ble påvist med et western blot deteksjonssystem (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Antistoffene som ble brukt var anti-HA (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland), anti-CBX7 (sc-70232, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-CBX7 (ab21873, Abcam, Cambridge, UK) , anti-His-probe (sc-804, Santa Cruz Biotechnology), anti-Egr1 (sc-189, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-c-Fos (sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-Fos B (sc-48, Santa Cruz Bioteknologi, Inc.), anti-Tubulin γ (sc-17787, Santa Cruz Bioteknologi, Inc.) og anti-β-Actin (Clone AC-15 A5441, Sigma-Aldrich Co ., St. Louis, MO).
Luciferase aktivitetsanalyse
Luciferase trans analysen ble utført som rapportert andre steder [11]. En region som strekker seg over 1000 bp oppstrøms for tanscriptional startsetet (TSS) av CBX7-regulerte gener (primere sekvenser er tilgjengelige i datasettet S1) ble PCR-amplifisert, og satt inn oppstrøms for den åpne leseramme av luciferase-genet som inneholdes i pGL3 vektor (Promega, Fitchburg, WI). Alle rapportør konstruksjonene som genereres ble sjekket for mutasjoner ved direkte sekvensering. CMV-β-galaktosidase-ekspresjonsvektor ble brukt til å normalisere transfeksjon aktivitet i henhold til galaktosidaseaktivitet. Protein lysater ble oppnådd 36 timer etter transfeksjon av HEK 293-celler og luciferaseaktivitet ble målt for hvert punkt ved hjelp av et Lumat LB9507 luminometer (Berthold Teknologier, Bad Wildbad, Tyskland) og Dual Light System kit (Life Technologies). Alle analyser ble utført i duplikat, og resultatene er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
Chromatin immunoutfelling assay (chip)
Chromatin prøver oppnådd fra celler og vev ble behandlet for kromatin immunpresipitering som rapportert andre steder [ ,,,0],10], [11]. Prøvene ble utsatt for immunoutfelling med anti-CBX7 antistoffer (ab21873, Abcam). Ikke-relatert IgG ble anvendt som negativ kontroll av immunpresipitering. For qPCR 3 pl av 150 pl IP-DNA ble anvendt og inngangs DNA-verdier ble anvendt for å normalisere verdiene fra kvantitative chip prøver. Prosent-inngang ble beregnet i henhold til formelen 2
ΔCt x 3, hvor ΔCt er forskjellen mellom Ct
inngang og Ct
IP [10]. Alle kvantitative data ble utledet fra tre uavhengige eksperimenter og for hvert forsøk qPCR ble utført in triplo. Sekvensene til de benyttede primere er rapportert i Datasett S1. Arrangøren av menneskelig og mus GAPDH-genet ble brukt som negativ kontroll over CBX7 kromatin samspillet [4].
Etikk
etikkutvalg av det medisinske fakultet og staten medisinske utvalget av senteret hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Frankrike, enige om å disse undersøkelsene, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene i denne studien.
Statistiske analyser
Statistisk evaluering ble utført ved hjelp Graph Pad Prism. Students t test ble benyttet for sammenligning mellom to grupper av eksperimenter. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD og forskjeller ble ansett som vesentlig dersom p 0,05. Fordeling av QRT-PCR Fold Endre verdier i forhold til hvert gen i papillær skjoldbrusk karsinomer og lungekarsinom ble innhentet og avbildet ved å bruke boksen og kinnskjegg (min til max) og persentil metoden. For korrelasjonsanalyse, ble Fold Endre verdier brukes til å konstruere scatter diagrammer, for å få en trendlinje og å beregne Pearson r verdi.
Resultater
Gene uttrykk profilen til skjoldbruskkjertelen carcinoma celler følgende re- uttrykk for CBX7
for å undersøke mekanismen som tap av CBX7 uttrykk kan bidra til anskaffelse av en ondartet fenotype, vi analysert genuttrykk profilen til en thyroideakarsinom cellelinje (FRO) som uttrykk for CBX7 ble restaurert (FRO-CBX7, figur 1A). RNA ekstrahert fra FRO-EV-1 (en klone stabilt transfektert med tom vektor) og FRO-CBX7-1 klone, ble hybridisert til Affymetrix oligonukleotid array som inneholder flere tusen transkripsjoner. Uttrykket profil av FRO-CBX7-1-celler ble så sammenlignet med den for FRO-EV-1. Flere transkripsjoner resulterte endret i sin uttrykksnivået mellom FRO-CBX7-1 og FRO-EV-1 (tabell 1 og 2, Tabell S1 og S2). 53 transkripter (17 oppregulert og 36 nedregulert) hadde en absolutt ganger endring verdi mer enn 2,0 (tabell 1 og 2), mens 263 transkripter (103 oppregulert og 160 nedregulert) viser en absolutt ganger endring verdi omfattet 1,5 til 2,0 (tabell S1 og S2). Som en kontroll av mikromatriseanalyse, observerte vi at CBX7 var sterkt uttrykt i FRO-CBX7-1 (tabell 1).
A) CBX7 ekspresjon ble evaluert ved QRT-PCR-analyse i FRO (wt), og flere FRO-EV (tom vektor) og FRO-CBX7 celle kloner. Verdier er uttrykt som relative uttrykk med hensyn til den FRO prøven som ble satt lik 1. B, C) De valgte CBX7 regulerende gener ble analysert ved QRT-PCR-analyse i FRO (wt), og flere fro-EV og frossen CBX7 celle kloner. FOS, FOSB og EGR1 genekspresjon var mer tallrike i FRO-CBX7 celle kloner enn i FRO-EV celler omvendt, SPP1, SPINK1 og STEAP1 uttrykk var mindre uttalt i FRO-CBX7 celler sammenlignet med FRO-EV og FRO (wt ) -celler. Verdier er uttrykt som relative uttrykk med hensyn til den FRO prøven som ble satt lik 1. D) Ekspresjon av FOS, FOSB og EGR1 ble evaluert i en FRO-CBX7 celleklon (FRO-CBX7-1), en FRO-EV (FRO-EV-1) og FRO villtype-celler. P-Actin ble evaluert som lasting kontroll. Pilene viser bandene som tilsvarer FOS og EGR1.
Blant de genene som reguleres av CBX7 i menneskelige skjoldbruskkjertelen carcinoma celler vi har konsentrert oss om FOS, FOSB og EGR1 (tabell 1) som ble positivt regulert, og SPP1, SPINK1 og STEAP1 (tabell 2) som ble omvendt, negativt regulert av CBX7, siden disse genene er kjent for å spille en relevant rolle i oppkjøpet av et fullt ondartet fenotype. Faktisk, FOS, FOSB og EGR1 er proteiner som har blitt rapportert å være nedregulert i flere humane karsinomer tyder på en kritisk rolle av disse proteinene i kreft progresjon [17] – [19]. På den annen side, SPP1, SPINK1 og STEAP1 er proteiner som er oppregulert i flere humane karsinomer og deres overekspresjon er også assosiert med kreft progresjon [20] – [22]. Vi evaluerte uttrykket av disse transkripsjoner av QRT-PCR i flere CBX7-uttrykker FRO kloner (figur 1B og C) sammenlignet med FRO-EV kloner og med FRO (vekt) celler. For alle av dem, bekreftet QRT-PCR-analyse differanse uttrykket forbundet med ekspresjon av CBX7 protein (figur 1 B og C). I tillegg Western blot eksperimenter bekreftet en økt ekspresjon av FOS, FOSB og EGR1-proteiner i en celle FRO klon som stabilt uttrykker CBX7 (FRO-CBX7-1) i forhold til FRO-EV (FRO-EV-1) og FRO wt-celler ( Figur 1D).
Analyse av CBX7 regulerte gener i rotteskjoldbrusk celler og MEF uttrykker eller ikke cbx7 genet
neste verifisert om genene forskjellig uttrykt i FRO-CBX7 celler viste en differensial uttrykk også i MEFs isolert fra cbx7 knockout mus [10]. Som vist i figur 2, bekreftet QRT-PCR-analyse modulering av de utvalgte CBX7-regulerte gener også i dette cellesystemet, faktisk ble gener positivt regulert av cbx7 funnet nedregulert i cbx7
– /- MEFs (figur 2A), mens gener negativt reguleres av cbx7, ble funnet oppregulert i cbx7
– /- MEFs, i forhold til cbx7
+ /+ MEFs (figur 2B). Western blot eksperimenter viste at uttrykket av fos og egr1 proteiner avtar i cbx7
– /-. MEFs, hvis forhold til cbx7
+ /+ MEFs (figur 2D)
Kvantitativ RT-PCR-analyse ble utført for å analysere uttrykket nivåer av cBX7-regulerte gener i cbx7
+ /+ og cbx7
– /- MEFs. Verdier er uttrykt som relative uttrykk med hensyn til den cbx7
+ /+, som ble satt lik 1. A) Fos, fosb og egr1 var mindre uttrykt i cbx7
– /- MEFs forhold til cbx7
+ /+ MEFs. B) Tvert imot, spp1, spink1 og steap1 gener ble mer uttrykt i MEFs cbx7
– /- sammenlignet med MEFs cbx7
+ /+. C) Cbx7
– /- MEFs ble transient transfektert med et pattedyr vektor uttrykker mus cbx7 (myc-His-merket) mRNA (cbx7
– /- R). Restaurering av cbx7 uttrykk er i stand til å hente den fenotype av cbx7
– /- MEFs (A, B). Verdier er uttrykt som relative uttrykk med hensyn til den cbx7
+ /+, som ble satt lik 1. D) Ekspresjon av fos og egr1 proteiner ble undersøkt ved western blot i MEFs erholdt fra cbx7
– /- mus i forhold til cbx7
+ /+ MEFs. β-Actin uttrykk ble evaluert for å normalisere protein lasting
Restaureringen av cbx7 genuttrykk i cbx7
-. /- MEFs (figur 2C) førte til en økt uttrykk av fos, fosb og egr1 (figur 2A) og en redusert uttrykk for spink1, spp1 og steap1 (figur 2B) som bekrefter reguleringen av disse genene av CBX7 uttrykk.
Hvis du vil kontrollere ytterligere rolle CBX7 i modulering av disse genene, vi evaluerte sitt uttrykk i den normale rotte skjoldbruskcellelinje PC-CI3 hvor syntesen av cbx7 ble undertrykket ved RNA-interferens. Ved å stanse all den cbx7-genet bekreftet ved flere timer etter siRNA behandling (figur 3A), resulterte i reduksjon av den CBX7 positivt regulerte gener (figur 3B) og i en økt ekspresjon av CBX7 negativt regulerte gener (figur 3C), i sammenligning med de ubehandlede celler eller de som ble behandlet med den ikke-lyddemping kontroll siRNA (kryptert).
A) PC CI3 celler ble transient transfektert med liten interfererende RNA (siRNA) mot rotte cbx7 mRNA. Etter transfeksjon kan vi observere en effektiv knockdown av cbx7 mRNA nivåer, som vurderes av QRT-PCR-analyse. B, C) CBX7-regulert ekspresjon gener ble evaluert ved QRT-PCR i rotte PC-Cl3-celler etter transfeksjon med rotte cbx7 siRNA. Ekspresjon ble evaluert 48 timer etter transfeksjon. Verdier er uttrykt som relativ uttrykk med hensyn til PC CL3 celler transfektert med et ikke lyddemping kontroll siRNA (kryptert), som ble satt lik 1.
CBX7 binder seg til arrangører av regulerte gener og modulerer sine aktivitet
for å vurdere om CBX7 var direkte involvert i differensial uttrykket av disse genene
in vivo
, utførte vi en kromatin immunoprecipitation (chip) analyse. Deretter FRO-EV-1 og FRO-CBX7-1 celler ble kryssbundet og immunopresipitert med anti-CBX7 eller IgG antistoffer. Immunoutfelling av kromatin ble deretter analysert ved qPCR ved anvendelse av primere som spenner over området for disse gener promoter (Datasett S1). Resultatene er vist i Figur 4A viser at CBX7 var i stand til å binde til disse aktivatorer. Faktisk, anti-CBX7 antistoffer utfelt region fra promotoren av disse genene i FRO-CBX7-1-celler, sammenlignet med FRO-EV-1-celler (figur 4A). Dessuten ble ingen anrikning observert i prøvene immunopresipitert med normal kanin IgG og når primere for den humane GAPDH promoter kontroll ble anvendt, som indikerer at bindingen er spesifikk for disse promotorer (Figur 4A). Det samme resultat ble oppnådd ved anvendelse av kromatin oppnådd fra HEK 293-celler transient transfektert med CBX7 ekspresjonsvektor (figur S1).
A) FRO-EV-1 og FRA-CBX7-1 celler ble underkastet en chip-analyse ved hjelp antistoffer mot CBX7. Som negative kontroller ble ubeslektede IgG-antistoffer anvendes. Den tilknyttede DNA ble amplifisert ved qPCR ved anvendelse av primere spesifikke for den tilsvarende gen-promotoren og, som en kontroll chip spesifisitet, primere som gjenkjenner det humane GAPDH-gen promotoren. B) MEFs oppnådd fra cbx7
+ /+ og cbx7
– /- ble analysert for binding av protein til cbx7 promoterene fra dets regulerte gener. Som negative kontroller, ubeslektede IgG-antistoffer ble anvendt, og, som en kontroll chip spesifisitet, ble primerne som gjenkjenner mus GAPDH-gen-promotoren anvendes. Data er rapportert som prosent innspill og ble beregnet ved hjelp av følgende formel: 2
ΔCt × 3, hvor ΔCt er forskjellen mellom Ct
innspill og Ct
IP
. for å bekrefte binding av endogene cBX7 protein til arrangører av disse genene, tok vi også nytte av MEFs og vev hentet fra cbx7 knockout mus [10]. Chip eksperimenter ble utført på MEFs, nyre og milt vev oppnådd fra cbx7
+ /+ og cbx7
– /- mus. Anti-CBX7 antistoffer var i stand til å gjenkjenne endogen cbx7 og for å felle kromatin fra cbx7
+ /+, men ikke fra cbx7
– /- MEFs (figur 4B) og vev (Figur S2) bekrefter binding av endogene cbx7 til disse promoter regioner. Disse eksperimentene Chip derfor indikert at CBX7 fysisk vekselvirker med promotorområdene for disse genene
in vivo
derfor direkte modulere deres ekspresjon.
Deretter ble det til evaluere effekten av CBX7 uttrykk på transkripsjon av disse regulerte gener, HEK 293-celler ble transient ko-transfektert med ekspresjonsvektoren som koder CBX7 og med en reporter vektor som bærer luciferase-genet under kontroll av en 1000 bp promoter region lokalisert oppstrøms av TSS på hver enkelt av disse gener. Som vist i figur 5, øket CBX7 den transkripsjonelle aktivitet av FOS, FOSB og EGR1 promotorene (figur 5A), mens den fortrengte den transkripsjonelle aktivitet av SPP1, SPINK1 og STEAP1 promotorene (figur 5B). Videre er effekten av CBX7 på disse promoterene var doseavhengig. Derfor Chip og luciferase-assay-eksperimenter tyder på at CBX7 er i stand til direkte å regulere transkripsjon av de utvalgte CBX7-regulerte gener ved binding til deres aktivatorer.
HEK-293-celler ble forbigående kotransfektert med økende mengder av CBX7 uttrykk vektor og en konstant mengde av vektor inneholdende luciferase-genet under kontroll av promoterne av CBX7-regulerte gener. Økende mengder av CBX7 tvungen ekspresjonen av reportergenet under kontroll av FOS FOSB og EGR1 promotorområdene (A), mens fortrengt aktiviteten av reportergenet under kontroll av den SPP1, SPINK1 og STEAP1 promotere (B). den relative aktivitet av ildflue luciferase-ekspresjon ble standardisert til en transfeksjon kontroll, ved hjelp av β-galaktosidase. De skala barer representerer gjennomsnitt ± SD (n = 3).
uttrykk for CBX7 regulerte gener korrelerer med CBX7 uttrykk også i humane karsinomer
Siden tidligere funn viste at CBX7 ekspresjon ble redusert i skjoldbruskkjertelen, tykktarm og lunge karsinom [4], [5], [10], med ekspresjonsnivåer nesten helt umulig å oppdage i de fleste industri thyroid kreft, hypotese vi at tapet av CBX7 genet kan være involvert i fremskredne stadier av thyroid carcinogenesis av den derav følgende modulering av disse genene. Derfor analyserte vi CBX7 og de utvalgte CBX7 regulerte gener i menneskeskjoldbrusk og lungekarsinom ved QRT-PCR. Såvidt papillær skjoldbrusk karsinomer er bekymret, FOS, FOSB og EGR1 genene ble nedregulert, som CBX7, mens SPP1, SPINK1 og STEAP1 var oppregulert (Figur 6A). Like uttrykket analyse av disse genene i lungekarsinom viste samme oppførsel (figur 6B). Den korrelasjonsanalyse i PTC og lungekarsinom (Pearson r) viste sammenhengen mellom CBX7 og dens regulerte gener (PTC: FOS, p = 0,0438; lungekarsinom: FOS, p 0,0001, FOSB, p 0,0001, EGR1, p 0,0021 Figur S3 og S4).
Vi analyserte uttrykk for CBX7, FOS, FOSB, EGR1, SPP1, SPINK1 og STEAP1 ved QRT-PCR i papillær skjoldbrusk karsinom (PTC) (A) og menneske lungekarsinom prøver (B). Ekspresjonen av FOS, FOSB og EGR1 er nedregulert, som det forekommer for CBX7, i de neoplastiske vev i forhold til de normale motstykker. Omvendt, ekspresjonen av SPP1, SPINK1 og STEAP1 ble oppregulert i de neoplastiske prøvene i forhold til de normale vev, og viser en motsatt tendens hvis sammenlignet med den til CBX7. Resultatene er uttrykt som ganger endring (for PTC) eller relative uttrykk (for lungekarsinomer) i forhold til en pool av normal prøver som ble satt lik 1. Området for variasjon av CBX7 og CBX7-regulert genekspresjon i normal skjoldbruskkjertelen og lunge vev var mindre enn 10%.
Derfor er disse data antyder sterkt at tapet av CBX7 genekspresjon kan bidra til utseendet av en ondartet fenotype ved modulering av et sett av gener kritisk for utviklingen trinnet kreftutvikling.
diskusjon
det er tidligere blitt observert at den reduserte CBX7 uttrykket er forbundet med flere humane karsinomer, og fullstendig tap av dets ekspresjon korrelerer med de mest avanserte stadier av maligniteter [5] – [10]. Derfor er det rimelig å hypoteser om at tapet av uttrykk for CBX7 kan spille en nøkkelrolle i kreft progresjon. Konsekvent, er CBX7 i stand til å motvirke den reduserte ekspresjon av E-cadherin gen hvis tap av ekspresjon representerer en funksjon av den epiteliale-mesenkymale overgang [11], som spiller en avgjørende rolle i å opprettholde normal epitelial cellemorfologi [12], [13] .
for å bedre forstå rollen av tapet av CBX7 genuttrykk i kreft progresjon vårt arbeid forsøkte å identifisere gener som reguleres av CBX7. Deretter, ved hjelp av en Affymetrix cDNA microarray, analyserte vi genet ekspresjonsprofilen av thyroid karsinom celler i hvilke CBX7 ekspresjon ble gjenopprettet, og identifisert flere gener opp- og ned-regulert. Blant de genene oppregulert ved CBX7 vi har konsentrert oss om FOS, FOSB og EGR1.
FOS og FOSB er medlemmer av AP-1 (Aktivering Protein 1) kompleks og er i stand til å samhandle med medlemmer av juni familie [23]. FOS har vært innblandet i hovedsak i signaloverføring, celledifferensiering og proliferasjon [24]. Mange studier har rapportert at FOS modulert flere viktige gener for tumorgenesen, forårsaker nedregulering av tumor-suppressor-gener [25] og fører til invasiv veksten av kreftceller [26]. Men noen nyere studier antydet at FOS kan også ha tumor-suppressor-aktivitet og kan ha en funksjon i apoptose [17], [27].
I tillegg til FOS, FOSB har også vist seg å ha en funksjon i utviklingen av ulike krefttyper blir nedregulert i dårlig differensierte brystcarcinomer [18]. Omvendt, FOSL-1 og FOSL-2, som har overekspresjon fører til økt tumorcelle motilitet og invasjon i brystkreft, tykktarmskreft og mesothelioma [28], ble ikke regulert av CBX7 (data ikke vist).
