Abstract
Formål
For å undersøke bruken av liposomal irinotecan (Irinophore C ™) pluss eller minus 5-fluorouracil (5-FU) for behandling av tykktarmskreft.
Experimental design
effekten av irinotecan (IRI) og /eller 5-FU eksponeringstider på cytotoksisitet ble vurdert
in vitro
mot HT-29 eller LS174T menneskelige kolon carcinoma celler. Farmakokinetikk og biodistribusjon av Irinophore C ™ (IRC ™) og 5-FU, administrert alene eller i kombinasjon, ble sammenlignet
in vivo
. En subkutan modell av HT-29 human kolorektal kreft i Rag2-M mus ble benyttet for å vurdere effekten av IRC ™ alene, og i kombinasjon med 5-FU.
Resultater
cytotoksisitet av IRI og 5-FU var sterkt avhengig av eksponeringstiden. Synergis interaksjoner ble observert etter langvarig eksponering for IRI /5-FU kombinasjoner. Farmakokinetikk /biofordelingsstudier vist at 5-FU eliminasjonshastigheten ble redusert betraktelig når 5-FU ble administrert intravenøst med IRC ™, versus alene. Betydelig nedgang i 5-FU eliminering ble også observert i plasma, med en tilhørende økning av 5-FU i noen vev når 5-FU ble gitt ved intraperitoneal injeksjon og IRC ™ ble gitt intravenøst. Elimineringen av IRC ™ var ikke signifikant forskjellig når de administreres alene eller i kombinasjon med 5-FU. Terapeutiske studier viste at monoterapi IRC ™ var betydelig mer effektiv enn kombinasjonen av IRI /5-FU; overraskende, IRC ™ /5-FU kombinasjoner var ikke mer effektiv enn IRC ™ alene. Administrering av kombinasjoner av 5-FU (16 mg /kg) og IRC ™ (60 mg IRI /kg) viste økt toksisitet når sammenlignet med irc ™ alene. Behandling med irc ™ alene (60 mg IRI /kg) forsinkes den tid som er nødvendig for en 5-gangers økning i innledende tumorvolum til dag 49, sammenlignet med dag 23 for kontroller. Når irc ™ (40 mg IRI /kg) ble anvendt i kombinasjon med 5-FU (16 mg /kg) tid til å øke tumorvolum fem ganger var 43 dager, noe som var sammenlignbart med det som oppnås ved bruk av IRC ™ alene ( 40 mg IRI /kg).
Konklusjoner
Enkelt agenten IRC ™ ble godt tolerert, og har betydelig terapeutisk potensiale. IRC ™ kan være en passende erstatning for IRI behandling, men bruken med gratis 5-FU kompliseres av IRC ™ -engendered endringer i 5-FU farmakokinetikk /biodistribusjon som er forbundet med økt toksisitet ved bruk av kombinasjonen.
Citation: Hare JI, Neijzen RW, Anantha M, Dos Santos N, Harasym N, Webb MS, et al. (2013) Behandling av tykktarmskreft ved hjelp av en kombinasjon av Liposomalt Irinotecan (Irinophore C ™) og 5-Fluorouracil. PLoS ONE 8 (4): e62349. doi: 10,1371 /journal.pone.0062349
Redaktør: Dimitris Fatouros, Aristoteles-universitetet i Thessaloniki, Hellas
mottatt: 23. mars 2012; Godkjent: 22 mars 2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Hare et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (Funding Referansenummer 82583) og matchende midler fra Terry Fox Research Institute (Prosjekt ID 2008-010). Midler til denne forskningen ble også levert av Pfizer /Centre for Drug Research and Development Innovation Fund. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1], [2], [3]; i USA, er CRC den tredje vanligste årsaken til kreftdød og den tredje vanligste diagnosen kreft, med nesten 150 000 nye tilfeller anslått å bli diagnostisert i 2013 [4], [5]. De kjemoterapeutiske stoffet irinotecan (IRI) er brukt i flere førstelinjetjenesten CRC behandlingsregimer. Selv IRI i seg selv er aktive, ikke-spesifikk plasma, lever, gastrointestinale (GI), og tumor karboksylesteraser [6], [7], [8] kan forbrenne IRI til SN-38 som er 100- til 1000-ganger mer potent når de ble testet ved hjelp av
in vitro assays
[9], [10]. Gut karboksylesterase (CE) genererer høye lokale konsentrasjoner av SN-38 [11], [12]. Denne omdannelse kan være assosiert med terapeutisk aktivitet, men det har også vært knyttet til intestinal skade som er ansvarlig for mye av IRI ugunstig gastrointestinal toksisitet [13], [14], [15]. En sekundær ulempe ved anvendelsen av IRI og SN-38 er pH-avhengig hydrolytisk omdannelse fra en aktiv lakton form, ved sur pH, til en inaktiv karboksylat form ved fysiologisk pH, noe som begrenser dosen av aktivt medikament som når målet [16], [17], [18], [19]. Noen av de uønskede bivirkningene og CE-mediert omdannelse av IRI kan bedres ved anvendelse av medikamentleveringssystemer [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Irinophore C ™ (IRC ™) er en formulering av IRI innkapslet i unilamellær, 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfatidylcholin (DSPC) /kolesterol liposomer (100 nm i diameter) inneholdende et surt vandig indre av ubufret CuSO
4. IRI er innesluttet i den vandige syre indre av liposomene ved en pH-gradient er generert i nærvær av det toverdige metall A23187, som er nødvendig for stabiliteten og vedlikehold av pH-gradienten [21], [26]. Kombinasjonen av ionoforen genererte pH-gradient, sammen med tilstedeværelsen av innkapslet Cu
2+, resulterer i utmerkede medikament retensjonsegenskaper for formuleringen
in vivo product: [26], [27], [28 ].
i prekliniske studier irc ™ viste at aktiviteten av IRI kan økes betydelig i et bredt spekter av tumormodeller [21], [26], [29], [30], med en forbedret sikkerhetsprofil i forhold til det frie legemiddel [21]. Økningen i terapeutiske indeks for IRC ™, mot IRI, er antatt å skyldes flere faktorer: i) opprettholdelse av IRI i sin aktive laktonform i lengre tidsperioder [21], [27], [30]; ii) økt levering av IRI til områder av tumorvekst [21]; iii) forlenget systemisk eksponering av den aktive laktonformen av SN-38 [21]; og iv) eksistensen av en anti-vaskulær aktivitet som ikke er observert etter bolus administrasjon av fri IRI [29], [31]. Vi antok at den terapeutiske virkningen av IRC ™ vil være av størst betydning når det brukes som en del av en legemiddelkombinasjon – for eksempel i kjemoterapiregime FOLFIRI (leukovorin, 5-fluorouracil (5-FU), og IRI), hvor irc ™ ville bli byttet ut med fri IRI. Denne hypotesen ble testet i en pre-klinisk setting her, der kombinasjoner av IRC ™ /5-FU og IRI /5-FU ble evaluert i en murine modell av CRC. Så vidt vi vet, er dette den første forskningen undersøke bruken av liposomale IRI formuleringer, inkludert IRC ™, i kombinasjon med 5-FU for behandling av CRC. De terapeutiske resultatene overraskende, vist at effekten av denne kombinasjonen var ikke noe bedre enn den som oppnås med IRC ™ monoterapi. I tillegg, i den modellen som er brukt her, var det en uventet økning i toksisitet av medikamentkombinasjonen, som kreves for å redusere dosen av IRC ™ til et nivå som var langt mindre aktiv enn en høyere dose av IRC ™, men kan bli administrert sikkert når det brukes som monoterapi.
Materialer og metoder
Material
DSPC og kolesterol ble oppnådd fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA). [
3H] Cholesteryl hexadecylether (CHE) ble kjøpt fra PerkinElmer (Waltham, Massachusetts, USA). [
14C] 5-FU ble kjøpt fra Moravek Biochemicals (Brea, California, USA). A23187 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, CA). Saltvann, 5% dekstrose i vann (D5W), irinotecan (Camptosar, Sandoz), og 5-FU (Alfa Aesar) ble innhentet fra BC Cancer Agency (Vancouver, British Columbia, CA). Den alamarBlue reagens, føtalt bovint serum (FBS), L-glutamin, og natriumbikarbonat ble innkjøpt fra Invitrogen (Burlington, Ontario, CA). Eagles minimum essensielt medium (MEM) med Earle balansert saltoppløsning (BSS), McCoys 5A medium, Hanks BSS (HBSS), ikke-essensielle aminosyrer, natrium pyruvat, og penicillin /streptomycin ble kjøpt fra StemCell Technologies (Vancouver, British Columbia, CA). Alle andre kjemikalier var av analytisk kvalitet.
Cell Culture
Den menneskelige kolorektal cellelinjer LS174T og HT-29 ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia, USA). Fotocellelinjer ble opprettholdt i fravær av penicillin og streptomycin, og ble screenet for
Mycoplasma
før fremstilling av et lager av celler som ble frosset for bruk i eksperimenter. Cellene ble resuspendert i iskaldt media (10% (vol /vol, v /v) dimetylsulfoksid i FBS) og sakte frosset i Nalgene 1 ° C frysecontainere (Rochester, New York, USA) som inneholder 100% isopropanol ved -80 ° C i 24 timer før lagring i flytende nitrogen. Frosne celler ble raskt tint ved 37 ° C, sentrifugert for å fjerne frysing media, belegg og passert to ganger før anvendelse i forsøkene. LS174T celler ble dyrket i Eagles MEM med Earle s BSS supplert med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1,5 g /l natriumbikarbonat, 1% (volum /volum) penicillin /streptomycin, og 10% (v /v) FBS, ved 37 ° C i en 5% CO
2 miljø. HT-29 celler ble dyrket i modifisert McCoys 5A medium supplert med 1,5 mM L-glutamin, 2,2 g /l natriumbikarbonat, 1% (volum /volum) penicillin /streptomycin og 10% (v /v) FBS, ved 37 ° C i en 5% CO
2 miljø.
cytotoksisitetsanalyser
Levedyktigheten av humane CRC cellelinjer etter eksponering for forskjellige konsentrasjoner av IRI og /eller 5-FU ble bestemt ved å bruke alamarBlue analyse [32], [33]. Celler (LS174T, 10.000 celler /brønn, HT-29, 5000 celler /brønn) ble sådd ut i flatbunnede 96-brønners plater. Etter at cellene skulle vedhefte hadde funnet sted, ble økende konsentrasjoner av IRI eller 5-FU tilsatt til cellene i 1-72 timer, med medikament utvasking som kreves ved den angitte tidspunkt. Ved eksperimenter for å bestemme tidsavhengigheten av eksponering av cellene til medikamentkombinasjoner, HT-29-celler ble utsatt for IRI /5-FU ved et 1:01 molforhold i 1-48 timer, med medikament utvasking som kreves ved den indikerte tid punkt (er). For alle eksperimentene ble cellelevedyktigheten vurdert til 72 timer etter initiering av medikamenteksponering. Den alamarBlue reagens ble tilsatt til hver brønn ved en 1:10 fortynning, og cellene ble inkubert i ytterligere 4-8 timer før fluorescensen ble målt. For levedyktighet data, fraksjonen påvirket (FA) var et mål på den alamarBlue fluorescens normalisert til fluorescensen av kontroller: a ingen celler tak som avgrenser den 100% påvirke nivå og et stoff-fri kontroll som definerer 0% påvirke nivå. Interaksjoner mellom IRI /5-FU når de brukes i kombinasjon
in vitro
ble bestemt på basis av en enkelt assay endepunkt (alamarBlue levedyktighet assay, ovenfor), og resultatene ble analysert med en median-effekt Prinsipp [34 ], som estimeres med CompuSyn programvare (ComboSyn, Inc .; Paramus, New Jersey, USA) [35]. For hver eksponeringstid, ble dose-responskurver generert for agenter, alene og i kombinasjon, og senere, ble kombinert indeks (CI) -verdier beregnet til forskjellige påvirke nivåer (definert som fraksjonen affisert). En CI verdi på 0,8-1,2 representerer en additiv interaksjon, mindre enn 0,8 representerer en synergistisk interaksjon, og større enn 1,2 representerer en antagonistisk interaksjon.
Utarbeidelse av Irinophore C ™
IRC ™ ble forberedt som beskrevet av Ramsay
et al
. [26]. DSPC: kolesterol (55:45 mol%) liposomer ble preparert som tidligere beskrevet [36], [37], ved bruk av spormengder av det ikke-metaboliserbare, ikke veksles lipid tracer [
3H] CHE [38]. Den tynne lipidfilmen ble hydrert med en 300 mM CuSO
4-løsning ved 65 ° C, ble de resulterende lipidvesiklene utsatt for 5 sykluser med fryse-og-tine, og liposomene ble ekstrudert til en diameter på ca. 100 nm. Uinnkapslet CuSO
4 ble fjernet ved kromatografi ved anvendelse av en Sephadex G-50 kolonne, ekvilibrert med SHE buffer (300 mM sukrose, 20 mM HEPES, 15 mM EDTA; pH = 7,5). Liposomer ble inkubert med 0,5 ug A23187 /mg totalt lipid i 30 minutter ved 60 ° C. IRI ble tilsatt til liposomene ved en molar medikament til lipidforhold av 0.2:1, og blandingen ble inkubert ved 50 ° C i 1 time. Ikke-innkapslet medikament ble fjernet ved kromatografi på en Sephadex G-50 kolonne, ekvilibrert med PBS (pH = 7,4), og medikament-last effektivitet ble bestemt etter måling IRI absorbans ved 370 nm. Når det er nødvendig, ble IRC ™ konsentrert på 3000 ×
g
bruker sentrifugal filterrørene (molekylvekt cutoff 100 kDa).
Dyr og etikk erklæringen
Alle
i vivo
eksperimenter ble utført utnytte 129S6 /SvEvTac-
Rag2
tm1Fwa plakater (Rag2-M) mus hentet fra BC Cancer Agency Animal Resource Centre på Vancouver Research Centre (Vancouver, British Columbia, CA). Studiene ble utført i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care retningslinjer med tilsyn fra University of British Columbia Animal Care komité (protokoller A10-0171 og A10-0206). Mus ble plassert under standardbetingelser med berikelse, med tilgang til mat og vann
ad libitum
.
farmakokinetikk og Biofordeling
Forsøk ble gjennomført for å avgjøre om samtidig administrasjon av IRC ™ /5-FU, via intravenøs (iv) eller intraperitoneal (ip) injeksjon, forandret PK /BD egenskaper av begge substansene. Mann Rag2-M mus (8-10 uker gamle, 4 mus per tidspunkt) fikk intravenøst injeksjoner, via den laterale halevenen, for [
3H] CHE-merket IRC ™ (40 mg IRI /kg), [
14C] 5-FU (40 mg /kg), eller co-administrert [
3H] CHE-merket irc ™ og [
14C] 5-FU (40 mg IRI /kg og 40 mg /kg henholdsvis,), i et totalt injeksjonsvolum på 0,2 ml. Dosen av 5-FU valgt for disse studiene var basert på tidligere eksperimenter som viser at denne dosen ble godt tolerert når gitt på en gang per uke (Q7D) doseringsplan, kan sammenlignes med den som brukes for IRC ™ (resultater ikke vist). Ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon, ble musene avlivet via CO
2 kvelning. Blod ble umiddelbart samlet opp via hjertepunktering, og sentrifugert for å separere plasma. Organer ble høstet og delt inn i 2 deler; halvparten av plasma eller organ ble fremstilt for væske-scintillasjonstelling (LSC) for å bestemme nivået av radioaktivitet assosiert (lipid og 5-FU), mens den andre halvparten ble behandlet for HPLC-analyse for å bestemme IRI og SN-38 nivåer. For å begrense konvertering mellom lakton og karboksylat formene, plasmaprøver og organer ble holdt på is og overført til -70 ° C i løpet av en time av samlingen.
En separat studie ble utført for å bestemme hvorvidt de PK /BD egenskaper av 5-FU, administrert QD × 2 via ip injeksjon, ble påvirket av samtidig administrasjon med IRC ™ i en dose på 60 mg IRI /kg. Denne dosering var sammenlignbar med den som brukes i effektstudiene beskrevet nedenfor. Eksperimentet ble gjennomført ved hjelp av mannlige Rag2-M mus (7-10 uker gammel, tre mus per tidspunkt). Mus ble injisert i.p. med 16 mg /kg 5-FU på dag 1 og 2, med eller uten samtidig bruk av IRC ™ (60 mg IRI /kg) via intravenøst injeksjon på dag 1 til 2 timer etter injeksjon av 5-FU. Når gjentatte doser av 5-FU ble administrert, siste dose inneholdt [
14C] 5-FU som en etikett for å spore 5-FU nivåer. Ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon, ble musene avlivet via CO
2 kvelning. Blod ble umiddelbart samlet opp via hjertepunktering, og sentrifugert for å separere plasma. Organer ble høstet og lagret på is, og overført til -70 ° C i løpet av 1 time etter innsamling. Prøver ble fremstilt for LSC for måling av radioaktivitet assosiert
i forberedelse for LSC, vevshomogenater (10% vekt /volum) ble fremstilt i saltløsning ved anvendelse av en Polytron homogenisator (Brinkmann Instruments, Rexdale, Ontario, CA). og 0,5 ml av hvert homogenat ble deretter spaltet i 0,5 ml løsbar (DuPont Canada, Mississauga, Ontario, CA) i 1 time ved 50 ° C. Etter avkjøling til romtemperatur ble prøvene avfarvet ved tilsetning av 0,2 ml 30% H
2o
2. Disse prøver ble deretter inkubert over natten ved 4 ° C for å hindre overdreven skumdannelse. Scintillasjonscocktail ble tilsatt til prøver, og følgende mørk-ekvilibrering ble radioaktiviteten ([
3H] CHE og [
14C] 5-FU) er forbundet med plasma og organer ble kvantifisert via LSC.
Som forberedelse til HPLC-analyse, ble den andre halvdel av hvert organ homogenisert i is-kaldt vann. Drug og metabolitter ble ekstrahert fra homogenatet ved hjelp av iskald acetonitril /metanol (01:01 v /v) løsning, og sentrifugering ved 14.000 x
g
i 15 minutter for å utfelle proteiner. Supernatanten ble oppsamlet, og konsentrasjonen av IRI (lakton og karboksylat-former) og SN-38 (lakton og karboksylat-former) i organ supernatanten og plasmaprøver ble bestemt ved HPLC. HPLC-separasjon av IRI og SN-38 lakton og karboksylat-formene ble utført ved anvendelse av en 250 x 4,6 mm C18-kolonne Symmetryshield og C18 Symmetryshield guard-kolonne (Waters, Mississauga, Ontario, CA). Gradienteluering ble anvendt sammen med mobil fase A, som består av 75 mM ammoniumacetat og 7,5 mM tetrabutylammoniumbromid, justert til pH 6,4 med iseddik (Fisher Scientific, Nepean, Ontario, CA), og mobil fase B, som består av acetonitril. Gradient profil var som følger: Tid = 0 min: 78% A: 22% B, tid = 10 min: 64% A: 36% B, tid = 12 min: 78% A: 22% B, tid = 20 min: 78% A: 22% B. en 0,01 ml prøve ble injisert på (temperatur kolonne på 35 ° C) kolonne og eluert ved en strømningshastighet på 1 ml /min. De lakton og karboksylat formene for både IRI og SN-38 ble oppdaget ved hjelp av en Waters 2475 multi-bølgelengde fluorescens detektor (Waters, Mississauga, Ontario, CA), sett med tidsprogramhendelser av λex = 370 nm, λem = 425 nm mellom 0 og 12,5 min for IRI lakton og IRI karboksylat, og λex = 370 nm, λem = 535 nm mellom 12,5 og 20 min for SN-38 og SN-lakton 38 karboksylat. Før injeksjon ble alle prøver opprettholdes ved 4 ° C for å redusere omdannelsen mellom lakton og karboksylat-former av IRI eller SN-38. Standardkurver av IRI lakton og SN-38-lakton ble fremstilt ved seriefortynninger i en 02:01: 1 natriumacetat (100 mM): metanol: acetonitril (pH 4,0) buffer. For IRI karboksylat og SN-38 karboksylat, ble seriefortynninger fremstilt i en 02:01: 1 natriumborat (100 mM): metanol: acetonitril (pH 9,0) buffer. Grensen for kvantifisering for IRI og SN-38 lakton og karboksylat-formene var 10 ng /ml. Plasma og vev AUC-verdiene ble beregnet ut fra konsentrasjonstidskurver (gjennomsnittlig +/- standardavvik) ved hjelp GraphPad Prism 5.00 programvare (GraphPad programvare, La Jolla, California, USA). Statistisk signifikans for PK /BD studien ble beregnet via toveis variansanalyse med Bonferroni post-test med GraphPad Prism 5,00 programvare.
Terapeutisk effektivitet
HT-29 tumormodell ble brukt for å bestemme terapeutisk effektivitet. HT-29 celler (5 x 10
6-celler i 0,05 ml medium) ble injisert subkutant (s.c.) inn i den sentrale nedre ryggen av hunn Rag2-M-mus (6-9 uker gamle). Svulster først innen 2 uker etter inokulering celle, og på denne tiden, ble musene tilfeldig delt inn i behandlingsgrupper på 6 mus per gruppe, med mindre annet er angitt. Behandlinger ble igangsatt da svulster hadde nådd et gjennomsnittlig volum på ~150 mm
3 (0,5-0,7 cm i diameter), som skjedde rundt dag 14 etter celle inokulasjon. Behandlinger ble administrert til mus på følgende måte: saltoppløsning + D5W, 5-FU (16 mg /kg), IRI (60 mg /kg), IRC ™ (40 eller 60 mg IRI /kg), IRI + 5-FU (60 mg /kg 16 mg /kg), eller IRC ™ + 5-FU (40 eller 60 mg IRI /kg 16 mg /kg). D5W og 5-FU ble administrert daglig i 5 dager (QD × 5) hver uke i 3 uker via i.p. injeksjon; alle andre behandlinger ble gitt en gang per uke i 3 uker (Q7D × 3) via intravenøs injeksjon i den laterale halevenen. Når mus fikk to forskjellige agenter, enten IRI og 5-FU eller irc ™ og 5-FU, på samme dag, ble 5-FU injisert på to timer før IRI eller IRC ™ administrasjon. For å øke den totale 5-FU eksponeringstid, ble daglig dosering av 5-FU som anvendes [39], basert på diett beskrevet av Saltz
et al
. [40], [41], og /dose 16 mg kg ble valgt etter en doseøkning studie fastslått at det var MTD i Rag2-M mus (upubliserte resultater). Den høyeste irc ™ dose (60 mg IRI /kg) som ble brukt i denne studien er godt tolerert, og er tilnærmet 66% av MTD bestemt ved vår gruppe for Rag2-M mus. Kryssende tumor dimensjoner ble målt 3 ganger per uke; tumorvolum ble beregnet ved anvendelse av (ab
2) /2 (a, større dimensjon, b, mindre dimensjon). Musene ble avlivet hvis kroppen vekttap (BWL) oversteg 20%, hvis tumor volum overskrides 1000 mm
3, hvis tumor sårdannelse ble observert, eller hvis betydelige forverringer ble observert i mus helse (klinisk poengsum som definert av en godkjent standard drifts prosedyre). Ved vurdering fold tumorvolumøkning, tumorstørrelsen på dag 0 (dagen for behandlingsstart) ble definert som 1.
Resultater
5-FU og IRI Vis Exposure Time Dependency som enkle midler og i kombinasjon
Drug kombinasjonseffekter er avhengig av en rekke faktorer, inkludert legemiddel forholdstall, ordrene og tids sekvenser av administrasjonen, og eksponeringstider. Tidligere studier har vist en narkotikaforhold avhengighet for IRI /floksuridin kombinasjoner [42]; et lignende legemiddel-forhold avhengighet ble også vist i de nåværende studier med kombinasjoner av IRI /5-FU (data ikke vist). Men de er beskrevet her studiene i tillegg vurderes rollen stoffet eksponeringstider på narkotika kombinasjonseffekter. Dette kan oppnås, for eksempel ved bruk av legemiddelinfusjoner, en optimalisert legemiddeladministrering plan, eller gjennom bruk av nanopartikkel anticancermedikamentformuleringene er utformet for optimale medikamentfrigjøringshastigheter og forbedret medikament eksponeringstider. Virkningen av eksponeringstiden på cytotoksisitet /cytostase ble bestemt for kombinasjoner av IRI /5-FU, og disse dataene er oppsummert i fig. 1. De terapeutiske effektene av 5-FU og IRI, når de brukes alene, var sterkt avhengig av eksponeringstiden (Fig. 1A-D). For LS174T-cellelinjen, IC
50 for IRI (0,3 uM; Fig 1A.) Og 5-FU (3,0 uM; Fig. 1 B) var over 100 ganger lavere når medikamentet eksponeringstiden var 72 timer, relativ til en eksponeringstid på 1 time (44 uM og 330 uM, henholdsvis). For HT-29-celler, IC
50 for 5-FU var 9 pM for et medikament eksponeringstid på 72 timer, sammenlignet med 4000 uM for en eksponeringstid på 1 time (fig. 1D). Videre IC
50 for IRI var ikke målbar i HT-29-celler når eksponeringstiden var 1, 4 eller 8 h (fig. 1C). Det bør bemerkes (se Metoder) at i disse studiene, ble toksisitet vurderingene bestemt i 72 timer, og dermed bare medikamentet eksponeringstiden ble variert her.
A-D) som monoterapi eksponeringstidsavhengighet. LS174T (A og B) og HT-29 (C og D) celler ble utsatt for IRI (A og C) eller 5-FU (B og D) for en (•, stiplet linje), 4 (□, heltrukket linje) , 8 (▾, stiplet linje) 24 (⋄, heltrukket linje), 48 (X, stiplet linje), eller 72 h (○, heltrukket linje). E) Kombinasjon eksponeringstid avhengighet. HT-29 celler ble utsatt for IRI /5-FU (01:01 molforhold) i 1 time (•) og 8 timer (▾) eller 48 timer (X). F) Beregnet KI verdier ved FA = 0,9 til HT-29-celler utsatt for IRI /5-FU (01:01 molforhold) i 1-72 timer. A-D) Hvert punkt representerer den midlere +/- standardavvik (n = 3-9) fra 2-3 eksperimenter, hvert utført i tre eksemplarer. E, F) Hvert punkt eller stolpe representerer en kombinasjon indeksverdi beregnet fra cytotoksisitetstester data samlet fra 2-4 separate forsøk, hver fullført i tre eksemplarer. CI fra 0,8 til 1,2 antyder additive interaksjoner; CI 0,8 antyder synergis interaksjoner; og CI 1,2 antyder antagonistiske interaksjoner
Den cytotoksiske effekten av kombinasjoner av IRI /5-FU ble bestemt for HT-29 celler for forskjellige eksponeringstider.. Korte eksponeringstider (1 h) produsert sterk antagonisme, med CI-verdier på mer enn 5 på FA-verdier på større enn 0,1 (fig. 1E). I motsetning til dette synergisme (CI-verdier mindre enn 0,8) ble observert over et bredt område av FA-verdier når eksponeringstiden ble øket til 48 timer. På en FA verdi på 0,9 (dvs. alamarBlue analysen indikerte en verdi som var 90% lavere enn det som registreres for de medikamentfrie kontroller), CI-verdier var 10, 0,8, 0,9 og 0,4 når eksponeringstidene var 1, 8, 48 og 72 timer, henholdsvis (fig. 1F). Disse resultatene tyder på at eksponeringstiden er en viktig variabel for å vurdere når du prøver å måle legemiddelinteraksjoner i cellebasert screening-analyser.
PK /BD studier etter administrasjon av 5-FU og irc ™ alene og i kombinasjon
for
in vivo
studier som vurderer kombinasjonseffekter av IRC ™ med 5-FU, er det viktig å først finne ut om en av rusmidler endrer farmakokinetikken eller biodistribusjon oppførselen til andre stoffet når de administreres samtidig (fig. 2-4). Plasma eliminering kurver for 5-FU administreres alene eller i kombinasjon med IRC ™ er sammenfattet i fig. 2A. Når de administreres alene, ble 5-FU fjernes raskt og plasmanivåene av 5-FU var mindre enn 3% av den injiserte dose i løpet av 15 minutter etter injeksjon. Plasma AUC
0-24 for 5-FU, gitt samtidig med IRC ™, var nesten 10 ganger høyere enn det som ble sett for 5-FU administrert alene, et resultat som er mest tydelig på tidspunkter utover 1 time ( fig. 3A). De høyere plasma 5-FU-nivåer ble også assosiert med høyere nivåer av 5-FU i lever, milt og lunger, men ikke nyrene (Fig. 3A). Resultatene tyder på at 5-FU eliminering ble redusert når stoffet ble administrert (i.v.) med IRC ™.
Mus ble injisert intravenøst med radiomerket 5-FU (40 mg /kg) eller IRC ™ (40 mg IRI /kg), eller begge legemidlene samtidig. Ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon, ble plasmakonsentrasjoner av 5-FU og IRI (lakton) bestemt. A) Gjennomsnittlig plasmakonsentrasjon av 5-FU +/- standardavvik (n = 4) etter administrasjon alene (solid grå linje) eller etter samtidig bruk av IRC ™ (solid svart linje). B) Gjennomsnittlig plasmakonsentrasjon av IRI lakton +/- standardavvik (n = 4) etter administrasjon av IRC ™ alene (stiplet grå linje) eller etter samtidig bruk av IRC ™ med 5-FU (solid svart linje).
Mus ble injisert iv med radiomerket 5-FU (40 mg /kg, skraverte søyler) eller IRC ™ (40 mg IRI /kg, svarte striper), eller begge legemidlene samtidig (hvite søyler). Ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon, ble plasma og organ konsentrasjoner av lipid og medikament art bestemmes, og AUC
0-24-verdiene ble beregnet fra de resulterende konsentrasjons-tidskurvene. Data er presentert som gjennomsnittlig plasma og organ areal under kurven (0-24 h) (n = 4) for 5-FU (A), total lipid (B), IRI lakton (C), IRI karboksylat (D), og SN-38 lakton (E).
Mus ble injisert ip med 5-FU (16 mg /kg) på dag 1 og 2 (grå linje /bar); 5-FU var tilsatt radiomerket 5-FU på dag 2. Halvparten av musene ble også injisert i.v. IRC ™ (60 mg IRI /kg) på dag 1 (sort linje /bar), 2 timer etter injeksjon av 5-FU. Ved forskjellige tidspunkter etter injeksjon, ble plasma- og vevskonsentrasjoner av 5-FU bestemt, og AUC
0-8h-verdiene ble beregnet fra de resulterende konsentrasjons-tidskurvene. Data er presentert som gjennomsnitt konsentrasjonen av 5-FU i leveren (A), milt (B), lunge (C), nyre (D), plasma (E) +/- standard avvik (n = 3), eller betyr plasma og organ arealet under kurven (0-8 h) (n = 3) for 5-FU (F).
plasma eliminasjons kurvene for IRI lakton etter administrering av IRC ™ alene, eller i kombinasjon med 5-FU, er vist i fig. 2B. På tidlig tidspunkt peker opp til fire timer etter injeksjon, var det en liten, men signifikant, reduksjon i plasmanivåene av IRI lakton for dyr injisert med IRC ™ i kombinasjon med 5-FU, versus IRC ™ alene; på 8 og 24 h tidspunkter, ble en mer markant nedgang i plasma IRI lakton nivåer observert for mus som var gitt samtidig IRC ™ /5-FU, sammenlignet med monoterapi irc ™. Men når man vurderer plasma AUC
0-24 data beregnet for liposomal lipid (Fig. 3B), IRI i lakton form (fig. 3C) eller karboksylat form (Fig. 3D), og SN-38 i lakton form (fig. 3E) verdiene var i hovedsak tilsvarer plasma AUC
0-24 fastsettes etter administrasjon av IRC ™ alene. Dette reflekteres også i vevet AUC
0-24 data (Fig. 3B-E), med unntak av milten, hvor forhøyede nivåer av IRI lakton og IRI karboksylat ble observert etter samtidig bruk (iv) i IRC ™ /5-FU, i forhold til irc ™ alene. HPLC-analyse av IRI og SN-38 i leveren kunne ikke bli utført på dyr som er gitt IRC ™ eller IRC ™ /5-FU, på grunn av spektral interferens fra en ukjent molekyl som var ko-ekstrahert med IRI og SN-38 fra leveren homogenat. Selv om analysen brukt i disse studiene var i stand til å oppdage SN-38 i karboksylat form, ble det ikke påvist i noen plasma eller vevsprøver over HPLC deteksjonsgrense på 10 ng /ml.
effektstudier beskrevet nedenfor vurderes aktiviteten av 5-FU (alene og i kombinasjon) ved anvendelse av en dose intens (daglig) plan, et plan som gjorde det nødvendig å administrere medikamentet intraperitonealt. Endringen i PK /BD bemerket ovenfor, når medikamentene ble begge gitt intravenøst, var også ventet å være mindre av et problem når IRC ™ ble gitt i.v. og 5-FU ble gitt i.p. Resultatene presentert i fig. 4 løse dette studiedesign. I samsvar med resultatene i fig. 3, tyder dataene på, i det minste ved de tidlige tidspunkter, at plasma og organkonsentrasjonen av 5-FU er høyere når IRC ™ administreres i kombinasjon med 5-FU. Denne effekten var mindre tydelig enn ved behandling av begge medikamenter i.v., som 5-FU-konsentrasjoner ikke var statistisk forskjellig ved de fleste tidspunkter utover 2 timer. Men på 0,5 timer etter injeksjon, 5-FU konsentrasjonene var høyere i leveren (P 0,001 Fig. 4A), lunge (P 0,05, Fig. 4C), nyre (P 0,001 Fig. 4D) og plasma (P 0,05, fig. 4E) av mus som ble gitt IRC ™ /5-FU, i forhold til de dyrene som fikk 5-FU alene. Sammenlignet med dyr injisert med 5-FU som et enkelt middel, når mus fikk kombinasjonen av IRC ™ /5-FU, 2-ganger høyere konsentrasjoner av 5-FU ble påvist i lever 0.5 h (P 0,001) og ett h (P 0,01) etter injeksjon, og en tilsvarende økning i leveren AUC
0-8h av 5-FU (fig. 4F) ble også observert. AUC
0-8h av 5-FU i plasma (fig. 4F) ble ~1.5 ganger høyere etter administrasjon av IRC ™ /5-FU, sammenlignet med dyr som er gitt 5-FU alene. Som illustrert i fig.
