Abstract
Økt CCL5 nivåer er markører for et ugunstig utfall hos pasienter med føflekkreft, brystkreft, livmorhals, prostata, mage eller bukspyttkjertelen kreft. Her har vi vurdert den rollen CCL5 /CCR5 interaksjoner i utvikling av tykktarmskreft. For å gjøre dette, har vi undersøkt en rekke menneskelige tykktarmskreft kliniske prøver og fant CCL5 og dets reseptorer over-uttrykt innenfor primær samt lever- og lungemetastaser hos pasienter i forhold til friskt vev. In vitro, økt CCL5 vekst og trekkende responser av tykktarm kreft celler fra både mennesker og mus opprinnelse. I tillegg systemisk behandling av mus med CCL5 styrt antistoffer redusert omfanget av utviklingen av subkutane kolon svulster, levermetastaser og av peritoneal carcinosis. Konsekvent, fant vi økt antall CD45-immunoreactive celler i stroma av de gjenværende lesjoner samt ved grensesnitt med det friske vevet. I kontrast, selektiv målretting av CCR5 gjennom administrasjon av TAK-779, en CCR5-antagonist, bare delvis svekket tykktarmskreft progresjon. Videre CCL5 nøytralisering gjengis svulstene mer følsomme for en PDGFRp rettet strategi i mus, denne kombinasjonsregime som tilbyr størst beskyttelse mot levermetastaser og undertrykke makroskopisk peritoneal carcinosis. Samlet våre data viser involvering av CCL5 i patogenesen av tykktarmskreft og peker på sin potensielle verdi som et terapeutisk mål
Citation. Cambien B, Richard-Fiardo P, Karimdjee BF, Martini V, Ferrua B , Pitard B, et al. (2011) CCL5 Nøytralisatorer Begrenser kreft vekst og Potenserer målretting av PDGFRp i kolorektal karsinom. PLoS ONE 6 (12): e28842. doi: 10,1371 /journal.pone.0028842
Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA
mottatt: 07.06.2011; Godkjent: 16 november 2011; Publisert: 20.12.2011
Copyright: © 2011 Cambien et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE og av Association pour la Recherche sur le Cancer (Grant 3707). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Bruno Pitard eier aksjer i I-Cell-Art Co, som utvikler 704 for vaksineprogrammer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tumor-stroma interaksjoner er anerkjent som kritiske komponenter av tumorinvasjon og metastatisk potensial for tykktarms karsinom [1]. Stromal, inflammatoriske celler og kreftceller kommunisere seg imellom direkte gjennom celle-kontakt, men også indirekte via parakrine signaler [2], [3]. Slike signaler favorisere svulst utvikling på flere måter: de fungerer som vekstfaktorer, stimulere angiogenese, modulere den ekstracellulære matrise, indusere rekruttering av flere stromale celler og ta del i immun evasion mekanismer for kreft. Som en konsekvens, har identifikasjon av tumorfremmende faktorer for kreftbehandling blitt av stor interesse å utvikle anti-tumor strategier som skal anvendes enten som enkelt-middel behandling eller som kombinasjonsbehandling i tilfelle hvor tumorer unnlater å svare på monoterapi. Ulike faktorer har blitt identifisert så langt som promotorer av tykktarmskreft progresjon, den vanligste av disse er den VEGF (vaskulær endotelial vekstfaktor) familien, FGF (fibroblast growth factor) familien og PDGF (blodplate-avledet vekstfaktor) familie, sin produksjon innenfor svulst korrelere med svulst klasse og kortere pasientoverlevelse [4] – [8]. Mer nylig har det vært økende bevis fra ulike studier inkludert vår at kjemokiner produseres i svulsten mikromiljøet kan også spille en avgjørende rolle i patogenesen av CRC (kolorektal kreft) [9] -. [12]
blant de kjemokiner antas å sterkt fremme carcinogenese og stromagenesis er CCL5 /RANTES (CC-kjemokin-ligand 5 /regulert ved aktivering, normal T-celle-uttrykt og utskilt) som opprinnelig ble beskrevet for sin sentral rolle i inflammatoriske sykdommer. Faktisk har kliniske bevis avdekket at forhøyede nivåer av vev eller plasma CCL5 er markører for et ugunstig utfall hos pasienter med enten melanoma, bryst, livmorhalsen, prostata, mage eller bukspyttkjertelkreft [13] – [20]. I brystkreft,
in vivo
CCL5 nøytralisering eller CCR5 antagonisme ble vist til oppheve MSC-indusert metastasering av kreft celler og dermed implicating CCL5 /CCR5 som en sentral akse i denne malignitet [21]. Selektiv målretting av CCR5 /CCL5 signale også ført til redusert tumorvekst i eksperimentell bukspyttkjertelen adenokarsinom gjennom forstyrrelse av CCR5-avhengige rekruttering av regulatoriske T-celler i svulstene [22]. Anibamine, en ny CCR5-antagonist også undertrykt invasiv og metastatiske egenskaper prostatakreftceller i mus [23]. Endelig CCL5 blokade betydelig svekket magekreft progresjon [20]. Interessant nok CCL5 er nylig blitt rapportert å bli uttrykt i kolorektalt karsinom, hovedsakelig på invasiv forsiden av primære tumorer [24]. På bakgrunn av de forannevnte kliniske observasjoner i flere kreftformer, er det fristende å spekulere at CCL5 og dets reseptorer kan ha en betydelig rolle i progresjon CRC og kan således representere en interessant mål for behandling av ondartet sykdom. Til dags dato, men ingen av disse aspektene er ivare
in vivo
.
Studiet beskrevet her rettet nettopp mot å få ny innsikt i rollen CCL5 /CCR5 interaksjoner i utviklingen av kolorektal kreft. For å gjøre dette, har vi undersøkt en rekke humane tarmkreft kliniske prøver og fant CCL5 og dets reseptorer over-uttrykt innenfor primær samt lever- og lungemetastaser av CRC pasienter sammenliknet med friske vev. For å vurdere relevansen av CCL5 /CCR5 nøytralisering i colon carcinoma, har vi brukt syngene eksperimentelle modeller av orthotopic (leveren) og ektopisk (subcutis) tykktarmskreft i immunkompetente mus. Vi har undersøkt effekten av CCL5- eller CCR5-blokkere administrert som enkle midler eller i kombinasjon med en murin PDGFRp rettet behandling, denne strategien er for tiden under klinisk evaluering for behandling av CRC kreftformer. Denne rapporten gir den første prekliniske bevis for en rolle CCL5 i colon carcinoma og viser at CCL5 blokade har potensial til å redusere tykktarmskreft progresjon og for å forbedre den terapeutiske responsen i flermedisinregime.
Materialer og metoder
reagens
følgende reagens (TAK-779) ble oppnådd gjennom NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, NIH.
tumor~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og forsøksdyr
human HT29 og mus CT26 kolon karsinom-celler ble anskaffet fra ATCC og opprettholdt i DMEM-medium supplert med 10% varme-inaktivert FBS, som tidligere beskrevet [11]. Kvinne SCID og BALB /c mus, 6 til 8 uker gammel, ble kjøpt fra Harlan (Gannat, Frankrike).
Etikk
Ti sett med primærtykktarmskreftsvulster og metastatisk vev fra samme pasienter samt paret «sunn» colonic biopsier ble samlet fra pasienter med invasive adenokarsinomer, som gjennomgikk kirurgiske biopsier eller innledende kirurgi ved Institut Paoli-Calmettes (IPC, Marseille, Frankrike) mellom 1987 og 2007. Hver pasient ga skriftlig informert samtykke og studien ble godkjent av IPC «Comité d’Orientering strategique». Alle de prosedyrer som involverer forsøksdyr og deres omsorg ble godkjent av Institutional Review Board (Permit nummer # A06-088-14).
TaqMan real-time PCR eksperimenter
Total RNA fra human kolorektal kreft og sunn kolon, fra mus sunn og tumorvev samt tykktarm carcinoma-cellelinjer ble ekstrahert ved bruk av RNeasy-sett (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrike) og transkribert til cDNA ved anvendelse av Superscript III enzym (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike) som beskrevet tidligere [11]. Real-time PCR ble utført i en ABI PRISM 7900HT og utføres ved hjelp TaqMan® genekspresjon analyser for humane prøver (hCCR1: Hs 00174298m1, hCCR3: Hs 00356601m1, hCCR5 Hs 00152917m1, hCCL5: Hs 00174575m1) (Applied Biosystems, Courtaboeuf, Frankrike ), eller SYBR® genuttrykk analyser i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems). Primersekvensene Muse CCL5 var: fremover, 5’TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3 «; og omvendt, 5’AACCCACTTCTTCTCTGGGTTG-3 «, for mus CCR1: fremover, 5’AGGCCCAGTGGGAGTTCAC-3»; og omvendt, 5’TCTTCCACTGCTTCAGGCTCTT-3 «, for mus CCR3: fremover, 5’AAGCTTTGAGACCACACCCTATG-3′; og omvendt, 5»- GACCCCAGCTCTTTGATTCTGA-3 «; for mus CCR5, frem 5’TTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAAC-3 «og omvendt, 5’TTCTCCTGTGGATCGGGTATAGA-3». Relative nivåer i mRNA-ekspresjon ble bestemt ved bruk av A C
T-verdier som oppnås ved å subtrahere C
T kontroll (human eller mus aktin) fra C
T målgenet målt på samme RNA-fremstilling. Sammen nivået av mRNA uttrykk mellom sunn (
X
) og metastatisk vev (
Y
) ble beregnet ved hjelp av formelen Δ
C
T
Y
–
A C
T
X Hotell og uttrykt som brett over sunn (2ΔΔ
C
T). Murine sunn kolon vev ble brukt til å analysere mus svulster og menneskelige sunn kolon prøvene ble brukt til å analysere menneskelige svulster og HT-29 prøver.
In vitro
spredning analysen
Kort , tykktarmskreftceller forbehandlet eller ikke med TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer (ved de angitte konsentrasjoner) ble sådd ut i en tetthet på 10
4 celler /cm
2 og inkubert enten i serum anriket medium eller i basemedium (inneholdende 0,1% bovint serumalbumin) supplementert eller ikke med forskjellige konsentrasjoner av rekombinant CCL5 (Peprotech, Neuilly sur Seine, Frankrike) i 5 dager før de blir trypsin-frittliggende, samles og telles som tidligere beskrevet [11].
In vitro
chemotaxis analysen
Kjemotaktiske svarene av tykktarm kreft celler ble undersøkt ved hjelp av 24-brønns kjemotakse kamre og polyetylentereftalat innsatser med 8 mikrometer porer (Becton Dickinson, San Jose, CA ) belagt med 6,5 pg /ml fibronektin (Sigma, Lyon, Frankrike) eller med 50 ug /ml kollagen (Becton Dickinson) for de CT26 celler eller på HT29-celler, henholdsvis [11]. Tykktarmskreftceller, forhåndsbehandlet eller ikke med TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer (ved de angitte konsentrasjoner), ble plassert i den øvre brønnen (5 x 10
4 celler) og forskjellige konsentrasjoner av rekombinant CCL5 (Peprotech) ble tilsatt til de nedre brønnene. Etter inkubering av platene i 18 timer (CT26 celler) eller 40 timer (HT29-celler) ved 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære, ikke-migrerte celler ble fjernet fra den øvre brønnen og de migrerte cellene oppsamlet på den nedre side av innlegget ble farget med krystallfiolett fargestoff og nummerert. Migreringsindeks ble beregnet som forholdet mellom antallet migrerte celler i kjemotiltrekkende-inneholdende brønnene dividert med antall celler som migrerte å basere medium alene.
PDGFRp gene expression vector
DNA som koder for mPDGFRβ ble klonet og innsatt i pTOPO-cDNA3 eukaryot ekspresjonsvektor (Invitrogen). Identiteten til fornuft (pcDNA3-PDGFRp) og antisense (kontroll vektor) produkter ble bekreftet ved sekvensering.
Plasmid forberedelse og utforming
DNA-vaksine plasmid (pcDNA3-PDGFRp) og tilsvarende kontroll vektor ble anvendt som antigener. Alle plasmider ble renset ved hjelp EndoFree plasmid rensing kolonner (Qiagen) og ble bekreftet å være fri for endotoksin forurensning (endotoksin 0,1 EU /ug plasmid DNA) ved Limulus amoebocytelysat analysen (Lonza, Le Perray en Yvelines, Frankrike). Den tetrafunctionalized amfifile blokk-kopolymer 704 (MW 5500) ble levert av I-Cell-Art (Nantes, Frankrike). Stamløsninger ble fremstilt ved 20% (w /v) i vann, og lagret ved 4 ° C. Preparater av DNA med 704 (sluttkonsentrasjon 0,3%) ble fremstilt umiddelbart før intramuskulær injeksjon av equivolumetric blanding av kopolymerer i vann med plasmid-DNA-oppløsning som tidligere beskrevet [25], [26]. DNA-doser administrert, er angitt gjennom hele studien.
Transfeksjon med PDGFRp gen ekspresjonsvektor
Riktig ekspresjon av mPDGFRβ ble bekreftet ved forbigående transfeksjon av CHO-celler med styre vektoren og DNA-vaksine plasmid ( pcDNA3-PDGFRp) med Amaxa Biosystems (Lonza). Tjuefire timer etter transfeksjon, cellelysater fra CHO-celler ble fremstilt som tidligere beskrevet [27] før den ble underkastet SDS-PAGE. Western blotting ble utført enten med geit-anti-mus PDGFRp antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, France) eller med fortynnet serum oppnådd fra PDGFRp-vaccinated- mus. Påvisning ble gjort enten ved kanin anti-geit Abs- eller geit-anti mus Abs- konjugert til pepperrotperoksidase (Dako, Trappes, Frankrike). Bånd ble visualisert ved chemiluminescence forbedret reaksjon (Amersham, Les Ulis, Frankrike).
musemodeller
subkutan, lever- og lungemetastasemodeller.
For induksjons av underhudsfett og leversvulster, CT26 celler (5 x 10
4) eller HT29-celler (3 x 10
6) ble injisert i flanken eller under leveren kapsel av BALB /c eller SCID-mus, respektivt. For induksjon av lungemetastaser, CT26 celler (3 x 10
4) eller HT29-celler (2 x 10
6) ble levert ved intravenøs injeksjon i hale BALB /c eller SCID-mus, respektivt. På offer, ble fullstendig obduksjonsundersøkelser utført. Subkutan og leversvulster ble skåret ut, veid og målt med kalipere i de to vinkelrette akser (
en
og
b
). Tumor volum ble beregnet i henhold til formelen
ab
2π /6.
Muskulær DNA-vaksinering.
Etter en profylaktisk innstilling, ble bedøvet mus vaksinert 3 ganger på 3-ukers intervall (dager 0, 21 og 42) ved intramuskulære injeksjoner av DNA-polymer formuleringer inn i både
tibialis anterior
muskler som tidligere beskrevet [25], [26]. Tre uker etter den siste boost (dag 66), ble mus utfordret ved injeksjon av 5 x 10
4 CT26 murine colon carcinoma celler under leverkapselen.
Mus behandlinger.
Anti -CCL5 eller kontroll isotype IgG-antistoffer (32 ug per mus, Peprotech) ble injisert i peritoneum av BALB /c mus 72 timer etter tumor-implantasjon og to ganger ukentlig for varigheten av forsøkene (fra dag 69 til 87). TAK-779, små-molekyl CC kjemokinreseptor 5 (CCR5) inhibitor [28], [29] ble injisert i mus (150 ug /mus) 72 timer etter tumorceller inokulering og deretter daglig inntil avlivning (fra dag 69-87 ).
På offer (dag 87), leversvulster ble skåret ut og veid. Forekomst av peritoneal carcinosis i mus ble uttrykt som prosent av carcinosis bærende dyr i hver gruppe.
Bestemmelse av serumnivåer av mPDGFRβ spesifikke Abs by ELISA
Serum ble samlet ved retro-orbital blødninger ved forskjellige tidspunkter etter vaksinasjon fra immuniserte mus. ELISA-plater ble belagt med 2 ug /ml anti-mus PDGFRp-antistoffer (Santa Cruz) i 100 ul PBS over natten ved 4 ° C. Den neste morgen ble platene vasket to ganger med PBS /Tween 20 (PBST), mettet i 30 minutter med fosfatbuffer inneholdende 1% skummet melk og 0,12% Triton X-100 (assaybuffer), vasket igjen to ganger før de ble inkubert i 18 timer ved romtemperatur med rekombinante muse PDGFRp. Etter gjentatte vaskinger, ble seriefortynninger av serumprøver fra immuniserte mus ble tilsatt til brønnen i duplikater. Platene ble videre inkubert i 2 timer, vasket fire ganger med PBST, og bundet-enzymaktiviteten ble avdekket med en kromogen OPD substratoppløsning og målt ved 490 nm.
Histologi /Immunhistokjemi
Formalin -Fast, ble parafininnstøpte deler av tykktarm kreft metastatisk vev farget med hematoksylin /eosin for morfologisk evaluering. Farging av CD45 ble utført med anti-mus CD45 mAb (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, Frankrike) ved avidin-biotin kompleks immunoperoxidase metode følgende mikrobølgeovn antigen henting. Det primære antistoff ble erstattet med isotype-matchet antistoffer i tilgrensende vev seksjoner som negativ kontroll. Ekspresjon av CD45 i musemilt ble anvendt som positiv kontroll.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E.M. og analysert ved hjelp av uparet Student
t
test eller Kruskal-Wallis test for multiple sammenligninger.
Resultater
Uttrykk for CCL5 og dets beslektede reseptorer i resected kolorektal karsinom eksemplarer
Vi har analysert ved kvantitativ RT-PCR (real time-kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction) uttrykket nivåer av menneskelig CCL5 og dets reseptorer CCR1, CCR3 og CCR5 på kirurgisk reseksjon biter av humane primære colontumorer, av paret lever- og lunge kolorektal kreft metastaser og av tilsvarende friskt vev samlet inn fra de samme pasientene. Vi observerte økte nivåer av CCL5 uttrykk i tykktarmssvulster (6 fold, P 0,05), levermetastaser (8,5 fold, P 0,05) og lungemetastaser (4 ganger, P 0,05) sammenlignet med friske prøver (Figur 1A, Tabell S1 ). Fordi CCL5 virker gjennom spesifikke reseptorer, vi også sett på slike reseptorer som ble uttrykt i tumor og metastaserende prøver. Distinkte mønstre av CCRs ekspresjon ble målt i henhold til målorganet. Mens CCR1 og CCR5 ble begge funnet å være betydelig overuttrykt i maligne og lunge vev sammenlignet med tilsvarende kontroll biopsier (P 0,01 i leveren, P 0,05 i lungene), CCR3 ble bare funnet betydelig overexpressed innen primær kolorektal tumorer sammenlignet med friske organer (P 0,05) (figur 1A, Tabell S1)
Analyse av nivåer av ekspresjon av human (h) eller mus (m) mål ble utført ved kvantitativ RT-PCR i kirurgisk reseksjon stykker av human kolorektal karsinom. (n = 10) (A), i eksperimentelle subkutane tumorer (n = 6), lever (n = 6) og lungemetastaser (n = 6) avledet fra mus CT26 celler (B), eller avledet fra humane HT29-celler (C) sammenlignet med tilsvarende friskt vev (normal human, n = 10, og normal mus tykktarm, n = 6, henholdsvis). De relative nivåer av ekspresjon ble beregnet ved bruk av standardkurver og uttrykkes som 1 /ΔCt. ΔCt verdier ble beregnet ved å subtrahere Ct å normalisere genet fra Ct av målgen, målt i den samme RNA-fremstilling. Sammen nivået av mRNA uttrykk mellom sunn (
X
) og metastatisk vev (
Y
) ble beregnet ved hjelp av formelen Δ
C
T
Y
– Δ
C
T
X Hotell og uttrykt som brett over sunn (2ΔΔ
C
T). Svarte striper: primær eller subkutane colontumorer; skraverte søyler: levermetastaser; stiplede barer: lungemetastaser. * P 0,05, ** p. 0,01
For å vurdere rollen til CCL5 ytterligere /reseptorer aksen i tykktarmskreft, har vi sett på en relevant mus tykktarmskreft modell. For å gjøre dette, har vi analysert ved kvantitativ RT-PCR uttrykket nivået av CCL5 /CCRs i menneske HT29 og i muse CT26 tykktarmskreftceller dyrket i kultur. Vi har observert CCL5 og CCR5 ekspresjon av begge cellelinjer in vitro (tabell S1). Ingen av de to andre CCL5 reseptorer (CCR1 og CCR3) ble påvist i HT29-celler, mens CCR1-ekspresjon ble funnet i CT26 celler. For å analysere hvorvidt uttrykk mønstre av CCL5 /reseptorer i ondartet vev var i samsvar med det som ble observert i menneskelige biopsier, vi neste utviklet eksperimentelle modeller av orthotopic (lever og lungemetastaser) og ektopisk (subcutis) tykktarmskreft hos immunkompetente og immunsvikt mus. Colon kreft celler av mus (CT26) eller menneske (HT29) opprinnelse ble inokulert i mus enten subkutant, under leveren kapsel eller gjennom halevenen injeksjon for å generere lungemetastaser. Ved ofring ble nivåer av kjemokiner /reseptorer i de forskjellige målorganer evaluert ved sanntids-kvantitativ PCR ved anvendelse av muse-primere for CT-26-avledede tmors og menneskelige primere for HT-29 xenotransplantater (figur 1B og C). Forhøyede nivåer av CCL5 uttrykk ble påvist i alle tumormodeller (subkutan, lever- og lunge) utviklet med muse CT26 celler og menneske HT29 celler unntatt i lungelesjoner avledet fra CT26 celler. I motsetning til dette mønstre av ekspresjon av CCL5 reseptorer var komplekse og endres når cellene ble dyrket in vivo sammenlignet med dyrkningsforhold. Ingen av de to tumormodeller (CT26 og HT29) nøyaktig reflekterte mønsteret av kjemokinreseptorer ekspresjon observert i humane biopsier. Derfor, basert på det faktum at alle tre CT26 tumortyper (subkutan, lever og lunge) uttrykt både CCL5 og CCR5 in vivo, mens det HT29-xenotransplantater viste nivåer av CCR5 under grensen for påvisning av PCR-teknikken, har vi funnet mer hensiktsmessig å arbeide med CT26 modeller for å vurdere hvilken rolle CCL5 /CCR5 samhandling i kolorektal kreft. I tillegg CT26 syngene modell som er utviklet til immunkompetente mus også dukket det mest hensiktsmessig å ta hensyn CCL5 /CCR5-avhengige immunmekanismer spesielt med tanke på at vårt endelige mål var å kombinere CCL5 blokaden med en vaksine strategi.
CCL5 forbedrer CRC celleproliferasjon og migrasjon
in vitro
uttrykk for CCL5 reseptorer av menneskelige og murine kolon carcinoma celler har ført oss til å bestemme evnen til deres felles ligand CCL5 å stimulere deres spredning og migrasjon
in vitro
. For å oppnå dette har vi undersøkt og kvantifisert cellevekst etter plating CT26 og HT29-celler i 5 dager ved lav tetthet i basismedium alene eller supplert med forskjellige konsentrasjoner av CCL5. Innen 5 dager serum sult, observerte vi at CRC-celler fra begge opprinnelse proliferere i respons til CCL5 behandling på en doseavhengig måte (figur 2A og C). Den maksimale vekst ble observert i respons til 50 ng /ml CCL5. Vi neste vurdert muligheten av CRC-celler til å migrere i respons til CCL5. CT26 og HT29-celler ble høstet, plassert i modifiserte Boyden kammere og tillatt å migrere mot forskjellige konsentrasjoner av CCL5. Figur 2B og D viser at CRC-celler migrert til kjemokinet, sammenlignet med basismedium alene. Gitt nøkkelrolle spilt av CCR5 i formidling CCL5 handlinger i ulike kreftceller, ved siden forsøkte vi å forstyrre CCL5 /CCR5 handling ved hjelp TAK-779, en ikke-peptid CCR5-antagonist tidligere beskrevet til å svekke svulst utvikling i bukspyttkjertelkreft [22]. Økende doser av TAK-779 (som strekker seg fra 10 til 500 nM) ble testet på CT26 celler i henhold til IC50-verdier er beskrevet i lav nM området [28], [29]. Vi har observert en doseavhengig effekt av TAK-779 på både vekst og trekk responsene til CRC-cellene, som vist på figur 2E og F. Den sterkeste inhibering ble oppnådd ved 200 nM TAK-779, høyere doser fører til cytotoksiske virkninger på cellene. Det ble imidlertid bare 28% av CRC svar opphevet ved CCR5 blokade, og dermed tyder involvering av CCR5-uavhengig mekanismer i både cellulære prosesser. Forskjellige konsentrasjoner av anti-CCL5 antistoffer, som strekker seg fra 3 til 30 ug /ml, ble deretter brukt for å CT26 celler. Som vist på figur 2G og H, CCL5 nøytralisering oppnådd med 10 pg /ml dose av antistoffer helt nedsatt CRC-celler trekkende og vekst respons på kjemokin. Til sammen tyder disse data på at CCL5 /reseptorer aktivering vises som et felles trekk ved de CRC-celler fra forskjellige opprinnelse, og at det kan mediere den ondartede sykdom relatert til egenskapene til kolon kreftceller.
(A, C, E, G) spredning av CT26 og HT29-celler ble bestemt i respons til en 5-dagers behandling med base medium alene (BSA, åpne søyler), med serum-anriket medium (FBS, skraverte søyler) eller med de indikerte konsentrasjoner av rekombinant CCL5 ( fylte søyler), i nærvær eller i fravær av TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer (ved de angitte konsentrasjoner). (B, D, F, H) CRC-celler ble analysert for chemotaxis som reaksjon på basismedium alene (BSA, åpne søyler), til serum-anriket medium (FBS, skraverte søyler) eller til de indikerte konsentrasjoner av rekombinant CCL5 (fylte søyler ), i nærvær eller i fravær av TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer. Resultatene representerer middelverdier ± S.E.M.. seks bestemmelser. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
CCL5-CCRs interaksjoner er involvert i tykktarm kreft utvikling
For å undersøke om malignitet-relatert. egenskapene CCL5 utøves mot tykktarmskreft celler
in vitro
har også en relevans
in vivo
, vi evaluert effekten av CCL5 nøytralisering på utvikling av CT26 colontumorer implantert subkutant i immunocompetent Balb /c mus. På dag 0, ble musene utfordret med en subkutan injeksjon av CT26 celler under huden. Dyrene ble deretter behandlet på dager +7, 10, +14 og +18 med intratumor administrasjoner av anti-CCL5 eller kontroll isotype IgG antistoffer. Ved ofring ble graden av tumorutvikling vurdert ved å måle tumorbelastninger. CT26-utfordret mus utviklet i løpet av 7 dager en følbar tumor i snitt 20 mm
3 som vokste til en størrelse på ~336 mm
3 ved dag 21 (figur 3A). I motsetning til anti-CCL5-behandlede mus utviklet svulster som vokste med en redusert rate sammenlignet med kontrolldyr svulster, denne reduksjonen er klart påvisbar etter den tredje anti-CCL5 behandling (40% reduksjon, P 0,01). På offer, deres volum nådde en gjennomsnittlig størrelse på 202 mm
3, tilsvarende en 40% reduksjon i forhold til å kontrollere byrder (P 0,05).
(A) Mus subkutant utfordret med CT26 celler mottatt fire intratumor injeksjoner av anti-CCL5 (åpne punkter) eller isotype-matchet antistoffer (fylte prikker) ved de angitte tider. Etter ofring ble graden av tumorutvikling vurdert ved å måle tumorbelastninger. (B) Forekomst og omfang av tumorutvikling innen lever av CT26-utfordret mus behandlet med anti-CCL5- eller isotype-matchet antistoffer. (C) Forekomst av peritoneal carcinosis uttrykt som prosent av mus med carcinosis. (N = 5 /gruppe). * P 0,05, ** p. 0,01
Gitt at leveren er et viktig mål organ i CRC malignitet og at de høyeste uttrykk nivåer av CCL5, ble CCR1 og CCR5 innenfor levermetastaser fra humane kolonkreftpasienter, ved forsøkte vi å vurdere den beskyttende potensial av anti-CCL5 behandling på utvikling av eksperimentell levermetastaser inn i immunkompetente mus. Dyrene ble så utfordret med en injeksjon av CT26 cellene under leverkapselen før behandling 72 timer etter inokulering og to ganger ukentlig i løpet av forsøket med intraperitoneale administrasjoner av anti-CCL5-antistoffer i en dose tidligere vist å være effektive [20], [21]. Selv om 100% av musene fra begge grupper utviklet leversvulster, var det en signifikant reduksjon (30%) i den totale svulstbelastningen i leveren hos de anti-CCL5-behandlede mus sammenlignet med kontrollgruppen, som vurdert ved å måle levervekt (1,24 vs 1,78, P 0,05). (Figur 3B)
i tillegg til leversvulster, vi også observert forskjeller i omfanget av macrospcopic peritoneal carcinosis mellom de to gruppene av behandlinger (Figur 3C). Mens peritoneal formidling ble funnet i 100% av kontrollmusene, ble det bare observert i 40% av de som ble behandlet med anti-CCL5 antistoffer.
mPDGFRβ vaksinasjon reduserer veksten av CT26 tykktarmskreft metastaser
Gitt at den anti-CCL5 strategi kan bare føre til en moderat terapeutisk effekt mot kreft i tykktarmen, ved forsøkte vi å evaluere potensialet til CCL5 blokade administreres i kombinasjon med et anti-PDGFRp strategi. Faktisk er PDGF /PDGFRp samhandling kjent for å spille en nøkkelrolle i å fremme flere maligniteter inkludert tykktarmskreft. Spesielt Wehler et al [30], har vist at PDGFRp uttrykk korrelert med lymfatisk formidling i menneskelig tykktarmskreft. Arbeid på 99 menneskelige CRC biopsier, forfatterne rapportert av immunhistokjemi og RT-PCR som PDGFRp uttrykk skjedde i 60% av pasientene. Tilsvarende ble PDGFRp ekspresjon detektert i fire humane CRC-cellelinjer: Caco-2, HT29, SW480 og SW620. I samsvar med dette, vi observerte høye nivåer av uttrykk for mPDGFRβ i CT26 avledet levermetastaser (Figur 4A). Som en konsekvens, laget vi en DNA-vaksine som koder for mPDGFRβ og bekreftet den korrekte ekspresjon av mPDGFRβ ved Western Blot-analyse etter forbigående transfeksjon av CHO-celler (Figur 4B). Vi deretter fremstilt formuleringer av DNA-vaksine plasmider med 704, en tetrafunctionalized amfifil blokk-kopolymer som tidligere har vist seg å forbedre intramuskulær DNA-vaksinering ved samtidig å øke transgene ekspresjon og aktivering av immunitet [25], [26]. Styrken på 704 formulert DNA-vaksine plasmid for å tillate genavlevering til
tibialis anterior
musklene i 6 uker gamle Balb /c-mus ble vurdert ved Western blotting (figur 4C) og bekreftet muskulær ekspresjon av proteinet etter administrering av lavdose-DNA (25 ug). I henhold til en tidligere optimalisert immuniseringsprotokoll [25], [26], ble mus utfordret på dag 0, og restimulert på dag 21 og dag 42 med DNA-vaksine (50 ug) eller kontrollvektor formulert med 0,3% polymer 704. To uker etter den prime-boost immunisering ble sera fra begge grupper av dyr analysert for tilstedeværelse av spesifikke antistoffer mPDGFRβ. Som avbildet på figur 4D, immunisert mus viste en humoral respons på mPDGFRβ protein påvist ved ELISA (P = 0,005). Tilstedeværelsen av spesifikke mPDGFRβ antistoffer i deres sera ble ytterligere bekreftet ved å teste deres evne til å reagere med båndet av det rensede antigenet fra den mPDGFRβ-transfekterte CHO-celler ved hjelp av Western blot-analyse (figur 4E), og ved reprobing den blot med en kommersiell antistoff spesifikt til mPDGFRβ. Evnen til vårt DNA-basert vaksine for å indusere en mPDGFRβ spesifikke adaptiv immunrespons førte oss til å undersøke om denne tilnærmingen kunne beskytte CT26-utfordret mus. Etter en profylaktisk innstilling, vi administreres mPDGFRβ vaksine i henhold til prime-boost diett beskrevet ovenfor før inoculating de CT26 celler under leveren kapsel (figur 5A). Tjueen dager etter tumorcelle-utfordring, sammenlignet vi graden av tumorutvikling innenfor lever fra både immuniserte og kontrolldyrene.
