Abstract
Abelson (c-Abl) proto-onkogen koder for et høyt konservert nonreceptor protein tyrosin kinase som spiller en rolle i celleproliferasjon, differensiering, apoptose og celleadhesjon. c-Abl representerer et spesifikt anti-kreft-target i prostata cancer som avvikende aktivitet av denne kinasen er blitt implisert i stimulering av prostata cancer vekst og progresjon. Imidlertid er mekanismen for regulering av c-Abl ikke kjent. Her rapporterer vi at Abl kinaser er regulert av en roman mikroRNA, MIR-4723, i prostatakreft. Expression profilering av MIR-4723 uttrykk i en kohort av prostata kreft kliniske prøver viste at Mir-4723 uttrykk er mye dempet i prostatakreft. Lav MIR-4723 uttrykk var signifikant korrelert med dårlig overlevelse utfall og våre analyser tyder på at Mir-4723 har et betydelig potensial som en sykdom biomarkør for diagnose og prognose i prostatakreft. For å evaluere den funksjonelle betydningen av redusert MIR-4723 uttrykk i prostatakreft, ble Mir-4723 overexpressed i prostatakreftcellelinjer etterfulgt av funksjonelle analyser. MIR-4723 overekspresjon ført til betydelig nedgang i cellevekst, clonability, invasjon og migrasjon. Viktigere, MIR-4723 uttrykk førte til dramatisk induksjon av apoptose i prostatakreftcellelinjer som tyder på at MIR-4723 er en pro-apoptotiske miRNA regulerer prostata kreftutvikling. Analyse av mulige MIR-4723 mål viste at Mir-4723 er rettet mot inte alpha 3 og metyl CpG bindende protein i tillegg til Abl1 og Abl2 kinaser. Videre fant vi at uttrykket av Abl kinase er omvendt korrelert med MIR-4723 uttrykk i prostatakreft kliniske prøver. Også Abl1 knockdown delvis phenocopies MIR-4723 reexpression i prostatakreftceller som tyder på at Abl er et funksjonelt relevant mål på MIR-4723 i prostatakreft. Avslutningsvis har vi identifisert en roman mikroRNA som formidler regulering av Abl kinaser i prostatakreft. Denne studien tyder på at Mir-4723 kan være et attraktivt mål for terapeutisk intervensjon i prostatakreft
Citation. Arora S, Saini S, Fukuhara S, Majid S, Shahryari V, Yamamura S, et al. (2013) mikroRNA-4723 Hemmer Prostate Cancer Vekst gjennom inaktivering av Abelson Familie av Nonreceptor Protein tyrosinkinaser. PLoS ONE 8 (11): e78023. doi: 10,1371 /journal.pone.0078023
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 28. mai 2013; Godkjent: 07.09.2013; Publisert: 01.11.2013
Copyright: © 2013 Arora et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Nasjonalt Senter for Forskningsressurser av National Institutes of Health (NIH) gjennom Grant Number RO1CA 138642, RO1CA160079, T32DK007790 og VA Merit omtale og VA Program Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den vanligste mannlige malignitet og den nest største årsaken til kreft dødsfall blant menn i USA. Prostatakreft bein metastasering er den viktigste årsaken til dødelighet hos pasienter som er rammet [1]. Til tross for mange fremskritt, er klinisk behandling av prostatakreft utfordrende og er en ledende årsak til kreft-relaterte sykelighet og dødelighet. Store utfordringer omfatter begrenset terapeutiske muligheter for metastatisk, kastrering-resistent sykdom og manglende evne til dagens diagnostiske tester for å lett skille lat fra aggressive svulster [2]. Derfor har det vært stor interesse for identifisering av romanen, alternative prostata kreft biomarkører som kan føre til utvikling av bedre prognostiske, diagnostiske og terapeutiske tiltak for sykdommen.
Abelson (Abl) serie med svært konservert nonreceptor protein tyrosin kinaser spiller viktige roller i ulike biologiske prosesser, inkludert celle overlevelse, spredning, celle adhesjon og motilitet [3]. Pattedyrceller har to Abl familie kinases- Abl1 (c-abl) og Abl2 (Abl-Related-Gene, Arg) – som er allestedsnærværende uttrykt [3], [4]. Sentralt i de biokjemiske og fysiologiske funksjoner av Abl-kinaser er kombinasjonen av en regulert SH3-SH2-TK (Src-homologi 3-Src-homologi 2-tyrosin-kinase) domene kassetten med cytoskeletal protein- og DNA-bindende domener, en kombinasjon som overfører unike aliserte egenskapene til disse proteinene [5]. Aktiviteten av Abl-kinaser er tett regulert av et komplekst sett av intramolekylære interaksjoner som har betydning for den Abl kinase domene og føre til effektiv auto-inhibering av tyrosin-kinase-aktivitet [6]. Forstyrrelse av autoinhibition, for eksempel ved translokasjon av
Abl1
eller
Abl2
ved siden av en rekke forskjellige gener (f.eks
Bcr
,
Tel
,
ETV6
), fører til konstitutiv aktivering, som driver kreftformer, spesielt leukemi [4], [7], [8]. Mutasjoner i
Abl1
genet blir ofte assosiert med kronisk myelogen leukemi (KML) der
Abl1
genet aktiveres ved å være translocated i
Bcr plakater (knekkpunkt klynge region) gen på kromosom 22, og skaper en ny fusjon genet,
Bcr-Abl
, som koder for et uregulert, tyrosin kinase.
Selv om Abl1 og Abl2 er godt kjent for kjøring leukemi utvikling, deres rolle i solide tumorer har blitt verdsatt bare nylig [4]. c-Abl og /eller Abl2 er aktivert i noen solide tumorcellelinjer via spesielle mekanismer som ikke involverer genmutasjon /translokasjon, og deres aktivering fremmer proliferasjon, matriksdegradering, invasjon, tumorgenese, og /eller metastase, avhengig av tumortypen [4]. Samle bevis tyder på at aktivering av c-Abl /Abl2 fremmer prostatakreft progresjon [4]. c-Abl og /eller Abl2 ekspresjon ble betydelig økt (bestemt ved immunohistokjemi [IHC]) i forskjellige tumorer inkludert prostata kreft [4], [9], [10]. Betydelig, tie c-Abl hemmet osteoblast spredning og fremmet osteoblastdifferensiering, noe som indikerer at c-Abl hemming kan forhindre beinmetastatisk vekst [11]. Dasatinib (BMS-354825), en dobbel Src-familie kinase (SFK) [12] og Abl-kinase-inhibitor [13] er under klinisk testet for behandling av prostata cancer benmetastase og er for tiden i fase 3 kliniske forsøk [14] – [ ,,,0],16]. En annen SFK /abl-inhibitor bosutinib (SKI-606) blokkert migrasjon, invasjon, forankrings-uavhengig vekst og proliferasjon av PC3 og DU-145-prostatacancerceller ledsaget av en betydelig minskning i fosforyleringen av signalmolekyler (AKT, mitogen-aktivert protein kinase , fokal adhesjonskinase) [17]. Videre bosutinib hemmet
in vivo
PC3 tumorvekst med subcuteaneous eller intraskeletal injeksjon [4], [17]. Aktivering av c-Abl ved blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) fremmes prostatacancer celleoverlevelse [18]. Abl kinaser også spille en rolle i å regulere prostatakreft motilitet /invasjon og progresjon [19] – [21]. Dermed Abl kinaser spiller viktige roller i prostatakreft og utgjør viktige mål for spesifikke anti-kreft terapi. Imidlertid er den molekylære mekanisme av over-ekspresjon av Abl-kinaser i prostata cancer ikke kjent. Her rapporterer vi at Abl kinaser er regulert av en roman mikroRNA, MIR-4723, i prostatakreft.
microRNAs (mirnas) utgjør et evolusjonært konservert klasse av små ikke-kodende RNA som negativt regulerer uttrykket av flere gener via sekvens spesifikke interaksjoner med 3′- utranslaterte regioner (UTR) av beslektede mRNA mål [22]. Det har blitt etablert som mirnas kontrollere ulike viktige cellulære prosesser som proliferasjon, apoptose, differensiering, utvikling [23], og er innblandet i menneskelige sykdommer, inkludert kreft [24]. mirnas har blitt identifisert som fungerer som klassiske onkogener eller tumorsuppressorgener [24]. Samle bevis tyder på at det finnes en sammenheng mellom miRNA uttrykk og klinisk tilbakefall, utvikling av metastaser og /eller overlevelse [25], [26]. På grunn av sine vev og sykdomsspesifikke uttrykk mønstre og regulatoriske potensial, er mirnas blir vurdert som potensielle biomarkører for diagnose og prognose av menneskelige maligne [27].
MIR-4723 er en nylig oppdaget miRNA [28] som er ikke undersøkt. Vi analyserte uttrykk for MIR-4723-5p (major form av MIR-4723, referert til som MIR-4723) uttrykk i en kohort av prostata kreft kliniske prøver, og fant at Mir-4723 uttrykk er mye dempet i prostatakreft og er betydelig korrelert med dårlig overlevelse utfall og tumorprogresjon. Funksjonelle studier med prostatakreft cellelinjer viste at tilberedning av MIR-4723 uttrykk ført til betydelig nedgang i cellevekst, clonability, invasjon og migrasjon. Betydelig, MIR-4723 reexpression førte til dramatisk induksjon av apoptose i prostatakreftcellelinjer som tyder på at MIR-4723 er en pro-apoptotiske miRNA som regulerer prostata kreftutvikling. Videre tyder våre data på at denne romanen miRNA er en viktig regulator av Abl1 og Abl2 kinaser som igjen regulerer prostata kreftutvikling. Så vidt vi vet er dette den første rapporten som (i) definerer roman miRNA-mediert regulering av Abl kinaser i prostatakreft og (ii) identifiserer en roman tumor suppressor miRNA i prostatakreft. Dette reguleringsmekanisme vil potensielt være nyttig for terapeutisk intervensjon i prostatakreft.
Resultater
MIR-4723 Expression er mye dempes i Prostate Cancer
For å vurdere rollen til speil 4723 i prostatakreft, ble Mir-4723 uttrykk analysert i humane kliniske prostata prøver (fig. 1a). Clinicopathological kjennetegn ved pasientene er oppsummert i tabell S1. Vi undersøkte uttrykk nivåer av MIR-4723 i laser capture microdissected (LCM) prostata kreft vev (n = 57) og matchet tilstøtende normale regioner av real-time PCR. Mens uttrykket av MIR-4723 var uendret i 6/57 tilfeller (10%) og høyere i 9/57 tilfeller (16%), en stor del av vevsprøver (42/57, ~74%) viste lavere MIR-4723 nivåer i forhold til matchet normalt vev. Forskjellene var statistisk signifikant med Wilcoxon Signed Rank test (p 0,0001). Dette tyder på at Mir-4723 er mye nedregulert i prostata kreft og er en potensiell prostata kreft svulst suppressor.
(A) Kvantitativ RT-PCR-analyse av relative MIR-4723 uttrykk nivåer i laser capture microdissected (LCM) PCa vev (n = 57) og pasient tilpasset tilstøtende normale områder. Data ble normalisert til RNU48 kontroll. Tabell oppsummerer de relative MIR-4723 uttrykk nivåer i disse prøvene. (B) Korrelasjon av MIR-4723 uttrykk med clinicopathological karakteristikker av prostatakreftpasienter inkludert Gleason grad, patologisk stadium og biokjemisk tilbakefall.
nedregulering av MIR-4723 Expression er assosiert med tumorprogresjon i Prostate Cancer
Vi er fast bestemt om MIR-4723 uttrykk i kliniske vev ble korrelert med clinicopathological egenskaper som Gleason grad, patologisk stadium og biokjemisk tilbakefall av kreft (fig. 1B). Redusert MIR-4723 uttrykk ble observert i 66% av tilfellene av lav Gleason Karakter (4-6), 74% av tilfellene av Gleason grad 7 og i 75% av tilfellene av høyere Gleason grad (8-10). Denne trenden tyder på at uttrykket av MIR-4723 har en tendens til å avta i høyere klasse prostatakreft. Tilsvarende redusert MIR-4723 uttrykk ble observert i 68% av tilfellene av patologisk stadium pT2 vs 73% av tilfellene av pT3 mens det var ingen signifikant korrelasjon med biokjemisk tilbakefall.
MIR-4723 er en diagnostisk og prognostisk Marker i prostate Cancer
i lys av den observerte utbredt nedregulering av MIR-4723 i prostatakreft kliniske prøver, evaluert vi potensialet kliniske betydningen av MIR-4723 uttrykk. For å bestemme den potensielle evnen til MIR-4723 som en diagnostisk biomarkør for prostatakreft, utførte vi ROC (Receiver Operating Characteristic) analyser på kohort av kliniske prøver (Fig. 2A). ROC-analyser viste at MIR-4723 uttrykket kan være en enkelt signifikant parameter for å diskriminere mellom normale og tumorvev med et område under ROC-kurven (AUC) på 0,727 (95% CI: 0,655 til 0,792, p 0,0001). Videre stratifisert vi vår prostatakreft klinisk kohort basert på MIR-4723 uttrykk og fremført Kaplan-Meier overlevelsesanalyse. Denne analysen viste at overlevelse var signifikant redusert hos pasienter med lav MIR-4723 uttrykk (Fig. 2B) (p = 0,0431). Disse analyser viser at MIR-4723 har betydelig potensiale til å bli brukt som en diagnostisk og prognostisk markør for prostatakreft.
(A) ROC-kurve analyse som viser evnen til mir-4723 uttrykk for å diskriminere mellom ondartede og ikke- maligne prostata vevsprøver. (B) Kaplan-Meier overlevelseskurver for pasienter med prostatakreft, stratifisert basert på MIR-4723 uttrykk (lav og høy). p-verdi basert på log rank test (* p 0,05).
MIR-4723 Overuttrykte undertrykker tumorigenitet av prostata kreft celler
For å vurdere potensialet for en svulst undertrykkende rolle MIR-4723, overexpressed vi MIR-4723 i prostata kreft cellelinjer (PC3 og LNCaP) etterfulgt av funksjonelle analyser (Fig. 3). Transient transfeksjon av MIR-4723 forløper førte til overekspresjon av MIR-4723 som bestemmes av real-time PCR (Fig. S1). Uttrykk av MIR-4723 førte til markert morfologiske endringer i begge cellelinjer (Fig. 3A). Nærmere bestemt, ble en markert nedgang i den fraksjon av langstrakte, spindelformede celler parallelt med en økning i avrundede, apoptotiske celler. De morfologiske endringer observert med MIR-4723 overekspresjon foreslått en økning i apoptotiske celler. En betydelig reduksjon i cellenes levedyktighet ble observert over tid i PC3 /LNCaP-celler som overuttrykker MIR-4723 (Fig. 3B) sammenlignet med celler som uttrykker kontroll MIR (MIR-CON). MIR-4723 overekspresjon også redusert clonogenicity av PC3 /LNCaP celler sammenlignet med MIR-CON (Fig. 3C). Transwell migrering og invasjon analyser viste at MIR-4723 ekspresjon redusert migrering (fig. 3D) og invasjon (fig. 3E) i begge cellelinjer. Disse observasjonene tyder på at Mir-4723 overekspresjon undertrykker tumorigenitet av prostatakreftceller.
For å evaluere den funksjonelle betydningen av mir-4723 i prostatakreft, MIR-4723 forløper ble overuttrykt i PC3 /LNCaP cellelinjer ved transient transfeksjon etterfulgt av funksjonelle analyser (utført 72 timer etter transfeksjon). (A) Morfologiske endringer i PC3 /LNCaP celler ved MIR-4723 uttrykk vurdert av fasekontrast microsopy. (B) Cellular levedyktighet analysen, (C) Colony dannelse analysen, (D) Transwell-migrasjon analysen og (E) Invasion analysen i PC3 /LNCaP celler Mock transfektert eller transfektert med MIR-CON eller MIR-4723 (* P 0,05 ).
Overuttrykte MIR-4723 induserer apoptose i prostatakreftceller
Vi målte apoptose kontroll (uekte eller MIR-CON transfektert) og Mir-4723-transfekterte celler ved flow cytometrisk analyse av Annexin-V-FITC-7-AAD fargede PC3-celler (fig. 4A-B). Det ble observert at den gjennomsnittlige apoptotiske cellen fraksjoner (Early apoptotisk + apoptotisk) ble signifikant øket ved MIR-4723 reexpression (12% + 5%) sammenlignet med MIR-CON eller mock-transfekterte celler (3% + 1%), med en ledsagende reduksjon i levedyktige cellepopulasjonen. Dette peker på en pro-apoptotiske rollen MIR-4723 og antyder at Mir-4723 påvirker apoptotiske trasé i å regulere tumorigenicity.
(A) apoptose analyse i PC3 celler etter MIR-CON (venstre panel) eller speil 4723 (høyre panel) transfeksjon i 72 timer som vurderes av Annexin V-FITC /7-AAD farging. (B) Representasjon av gjennomsnittlig apoptotic fraksjoner (tidlig + sent apoptotiske) i hver gruppe (* p 0,05)
MIR-4723 induserer G2-M Arrest i prostata kreft celler
FACS (fluorescens-aktivert cellesortering) analyse viste at ekspresjon av MIR-4723 i PC3-celler fører til en betydelig økning i antall celler i G2-M-fasen av cellesyklusen i forhold til MIR-CON (fig. 5) . Dette tyder på at Mir-4723 uttrykk induserer G2-M arrest i prostata kreft celler.
Cell syklus analyse etter mock (venstre panel) /MIR-CON (midtre panelet) eller MIR-4723 (høyre panel) behandlinger som viser induksjon av G2 /M fase arrestasjonen av MIR-4723. 72 timer etter transfeksjon. Cellene ble farget med DAPI atom flekken for FACS analyse.
MIR-4723 Targets Abl kinaser i prostata kreft celler
For å identifisere effektorer av MIR-4723, en liste over potensielle miRNA mål ble opprettet ved å kombinere spådd mål fra miRDB målet prediksjon algoritme [29], [30] og profilering uttrykket av gener knyttet til apoptose og cellesyklusen ved hjelp av veien fokusert PCR Arrays. I samsvar med de observerte effekter av MIR-4723 på apoptose og cellesyklus, fant vi flere viktige molekyler av disse cellulære prosesser som potensielle MIR-4723 mål. Profilering av apoptose og cellesyklusrelaterte gener gående viste nedregulering av den Abl1-genet (Fig. 6A-B). For å validere disse resultatene, utførte vi RT-PCR-analyse for å undersøke den relative mRNA uttrykk nivåer av Abl1 og fant at Mir-4723 overekspresjon fører til redusert Abl1 uttrykk (Fig. 6C). Dette tyder på at Mir-4723 undertrykker Abl1 via mRNA degradering.
(A) Profilering av apoptotiske gener og, (B) Cellesyklus relaterte gener etter overekspresjon av MIR-4723 i PC3 cellene viser nedregulering av Abl1 av speil 4723. (C) Relativ mRNA ekspresjon av Abl1 genet som bestemt ved RT-PCR. (D) Skjematisk fremstilling av Abl1 og Abl2 3′-UTR viser de relative posisjonene til antatte MIR-4723 bindingssteder. (E) immunoblotter av endogent Abl1, Abl2 og andre MIR-4723 mål i PC3 celler transfektert som angitt. GAPDH ble brukt en lasting kontroll. (F) Abl1 3 «UTR konstruere omfatter MIR-4723 bindingssteder eller kontroll konstruksjon ble kotransfektert inn PC3 celler med MIR-4723 eller MIR-CON og analysert for relativ luciferase aktivitet (* p 0,05)
i silico
analyser viste at Abl1 besitter fem potensielle Mir-4723 målse innenfor sin 3′-UTR (fig. 6D). Nettsteder 2-5 er evolusjonært konservert hos primater (sjimpanse, gorilla, rhesus ape) (fig. S2). Vi fant også at det nært beslektede Abl2 besitter en potensiell MIR-4723 målområde innenfor sin 3′-UTR (Fig. 6D, nedre panel). Dette nettstedet er bevart i sjimpanse og gorilla (fig. S2).
Guidet av disse funnene, vi utførte Western blot analyse for mulige MIR-4723 mål i PC3 celler som enten var uekte transfektert eller transfektert med MIR-4723 /MIR-CON (fig. 6E). Interessant, ledet MIR-4723 overekspresjon til redusert protein nivåer av Abl1 og Abl2 som koder for Abelson familie av ikke-reseptor tyrosin proteinkinaser. I tillegg fant vi at Mir-4723 undertrykker metyl CpG bindende protein (MeCP2) og grin, alfa 3 (ITGA3). Den 3’UTR av MeCP2 besitter ti potensielle Mir-4723 målse mens det av ITGA3 har fire potensielle Mir-4723 målse (Fig. S3).
Vi undersøkte om c-Abl protoonkogenet er en direkte funksjonell målet MIR-4723 i prostatakreft. Transient transfeksjon av humane kreftceller PC3 med den Abl1 3’UTR plasmidet sammen med MIR-4723 forløper førte til en betydelig reduksjon i promoter-aktivitet sammenlignet med kontroll-vektor (fig. 6E) som tyder på at MIR-4723 undertrykker direkte dette genet. Disse observasjonene førte oss til å konkludere med at MIR-4723 regulerer en kohort av gener som spiller en viktig rolle i cellulære overlevelse, vedheft, invasjon og metastase spesielt Abl kinaser.
Abl1 knockdown Delvis Phenocopies MIR-4723 Reexpression i prostatakreft celler
for å finne ut om Abl er et funksjonelt relevant mål på MIR-4723 i prostatakreft, hemmet vi Abl1 uttrykk ved hjelp av siRNA for å se om Abl1 knockdown funksjonelt etterligner effekten av MIR-4723 overekspresjon. Vi behandlet PC3 celler med Abl1 siRNA fulgt av
in vitro
funksjonelle analyser (Fig. 7). To sett med siRNA mot Abl1- Abl1 siRNA1 og siRNA2- ble brukt for å oppnå effektiv knockdown som bedømt ved immunoblotanalyse (Fig. 7A). Ikke-spesifikk siRNA (NS) ble anvendt som en kontroll. En signifikant reduksjon i cellelevedyktighet ble observert i Abl1 siRNA behandlede PC3-celler sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA (fig. 7B). Abl1 knockdown også ført til redusert clonogenicity av PC3 celler sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 7C). Cellesyklus analyse viste at Abl1 knockdown førte til G2-M fasen arrest lik MIR-4723 overekspresjon (Fig. 7D). Apoptose analysen viste at apoptotiske celler fraksjonene ble betydelig økt ved Abl1 knockdown sammenlignet med kontroll siRNA-behandlede celler, en effekt som ligner den som ble observert på MIR-4723 gjeninnføring i PC3 celler (Fig. 7E). Disse resultatene tyder på at Abl1 er en viktig faktor for de tumorigene egenskaper av prostata kreft celler og at Abl1 hemming delvis phenocopies anti-tumorigen effekter av MIR-4723 i prostatakreft.
PC3 celler ble transfektert med Abl1 siRNA /ikke-spesifikk (NS) kontroll siRNA i 72 timer fulgt av ulike analyser. To sett med siRNA mot Abl1- Abl1 siRNA1 og siRNA2- ble brukt for funksjonelle analyser. (A) Relativ Abl1 protein uttrykk etter siRNA trans vurdert av immunoblotting. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Celleviabilitet analysen, (C) Colony dannelse analysen, (D) Cell syklus analyse, (E) apoptose analysen i PC3 celler etter NS siRNA (venstre panel) /Abl1 siRNA1 (midtre panelet) /Abl1 siRNA2 (høyre panel) behandlinger.
uttrykk for Abl kinase er omvendt korrelert med MIR-4723 Expression in Prostate Cancer
for ytterligere å bekrefte Abl som en patologisk relevant mål på MIR-4723
in vivo
, undersøkte vi sammenhengen mellom MIR-4723 og Abl uttrykk i en undergruppe av vår kliniske kohort. Vi utførte immunhistokjemisk farging for Abl i PCA vev (n = 12) og observert en negativ korrelasjon mellom Abl og MIR-4723 uttrykk (Fig. 8). Kliniske prøver med lav MIR-4723 uttrykk (i forhold til nærliggende normalt vev) viste høye nivåer av Abl uttrykk (Fig. 8).
Vi har undersøkt sammenhengen mellom MIR-4723 og Abl uttrykk i en undergruppe av vår kliniske kohorten ved å utføre immunhistokjemisk farging for Abl i PCA vev (n = 12). Relative uttrykk nivåer av Abl (som scoret av IHC) og Mir-4723 (som bestemmes av RT-PCR) for de analyserte prøvene er representert i søylediagram.
Diskusjoner
en ekspansiv mengde litteratur viser at mirnas er vesentlig endret i prostata kreft [31]. Som de molekylære interaksjoner av mirnas med sine beslektede mål gener blir undersøkt, ble denne studien forsøkte å identifisere nye mirnas som regulerer prostata kreftutvikling. I denne studien har vi identifisert en roman tumorundertrykkende miRNA, MIR-4723, i prostatakreft. MIR-4723 er en nylig oppdaget miRNA [28] som ikke er utforsket ennå. Expression profilering av MIR-4723 uttrykk i en kohort av prostata kreft kliniske prøver viste at Mir-4723 uttrykk er mye nedregulert i prostatakreft. I lys av den lave uttrykk, vurdert vi potensialet i MIR-4723 som en prostatakreft biomarkør. Våre analyser antyder at lav MIR-4723 uttrykket kan være en vesentlig parameter for å diskriminere mellom normale prostata og tumorvev. Videre lav MIR-4723 uttrykk var signifikant korrelert med dårlig overlevelse utfall og tumorprogresjon i kliniske prøver. Disse funnene tyder på at denne romanen miRNA har betydelig potensial som en sykdom biomarkør for prostatakreft diagnose og prognose.
Den observerte nedregulering av MIR-4723 uttrykk i PCA kliniske prøver også foreslått at denne romanen miRNA kan ha svulst-undertrykkende aktivitet. For å teste dette, vi utførte funksjonelle studier med prostatakreft cellelinjer PC3 og LNCaP. Vi overexpressed MIR-4723 i disse PCA cellelinjer etterfulgt av funksjonelle analyser. Våre data tyder på at overekspresjon av MIR-4723 i PCA celler undertrykker tumorigenicity, bekrefter tumor-undertrykkende rolle MIR-4723 i prostatakreft. MIR-4723 overekspresjon ført til betydelig nedgang i cellevekst, clonability, invasjon og migrasjon. Viktigere, disse studiene indikerer at MIR-4723 er en pro-apoptotiske miRNA som regulerer prostata kreftutvikling. Dette er den første rapporten impliserer en tumor suppressor rolle for denne miRNA i prostatakreft der vi viser at den har en viktig pro-apoptotisk rolle.
I pattedyrceller, mirnas årsaken genet Slå av sine mål gener via både translasjonell inhibering og mRNA degradering og en individuell miRNA er i stand til å regulere mange forskjellige mRNA [22]. For å forstå den funksjonelle rollen MIR-4723 i prostata kreftutvikling, så vi for de antatte målet gener som spiller en viktig rolle i cellulære overlevelse, vedheft, invasjon og metastasering. Våre data tyder på at c-Abl protoonkogenet og Abl2 /Arg er viktige funksjonelle mål for Mir-4723 i prostatakreft. Abl1 og Abl2 kode Abelson familien av ikke-reseptor tyrosin proteinkinaser som er allestedsnærværende uttrykt og sterkt konservert i evolusjonen metazoan [3]. Disse kinaser spiller en rolle i regulering av celleproliferasjon, differensiering, apoptose, celle adhesjon og stressresponser [3]. Avvikende aktivitet av disse tyrosin-kinaser har vært implisert i stimulering av kreftvekst og progresjon i forskjellige tumorer, spesielt leukemier. Studier tyder på at aktivering av c-Abl /Abl2 fremmer prostatakreft progresjon [4]. I prostatatumorer, c-abl og /eller Abl2 ekspresjon ble betydelig økt, vurdert ved immunohistokjemi [IHC]) [4], [9], [10]. Aktivering av c-Abl ved blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) fremmes prostatacancer celleoverlevelse ved å indusere ekspresjon av det antiapoptotic protein, MCL-en, via en p68 /β-catenin signalveien [18]. Abl kinaser også spille en rolle i motilitet /invasjon av prostata kreft celler, som c-Abl /Arg-mediert fosforylering av galectin-3 hindret spalting av PSA og dermed øke full-lengde ekstracellulære galectin-3 og fremme migrasjon og invasjon av PCA celler [19], [21]. En rolle av c-Abl i sykdomsprogresjon har vist seg på grunn av sin evne til å fosforylere et Wiskott-Aldrich syndrom proteinfamilie, delen 3 (WASF3), et protein som kontrollerer celle motilitet og invasjon og blir oppregulert i avansert metastatisk PCa [20 ]. Dermed disse kinaser er viktige mål for spesifikke anti-kreft terapi og Abl kinase hemmere er for tiden i kliniske studier for behandling av prostatakreft bein metastasering. Dasatinib (BMS-354825), en dobbel Src familien kinase (SFK) [12] og Abl kinase inhibitor [13] er for tiden i fase 3 kliniske studier [14] – [16]. Dasatinib hemmer proliferasjonen og fremmer differensiering av osteoblaster, noe som indikerer at c-Abl inhibering kan forhindre metastatisk beinvekst [11]. Bosutinib (SKI-606), en annen SFK /abl-hemmer, hemmer veksten av prostata kreft celler
in vitro Hotell og
in vivo product: [17]. Samlet er disse studiene tyder på at Abl kinaser spiller viktige roller i prostatakreft. Imidlertid er mekanismene for regulering av Abl kinase aktiviteter ikke helt forstått. Her rapporterer vi en roman miRNA mediert regulering av disse kinaser i prostatakreft.
mikroRNA mediert regulering av Abl1 og Bcr-Abl har blitt utforsket i blodkreft maligniteter. Bueno
et al.
Viste at Abl1 er et direkte mål på MIR-203 i hematopoetiske maligniteter. MIR-203 er brakt til taushet av genetiske og epigenetiske mekanismer i blodkreft maligniteter uttrykker enten Abl1 eller Bcr-Abl1, og restaurering av Mir-203 uttrykk redusert Abl1 og Bcr-Abl1 nivåer og hemmet celledeling [32], [33]. I en fersk undersøkelse, har MIR-451 også vist seg å ha negativ regulere Bcr-Abl uttrykk ved kronisk myelogen leukemi [34], [35]. Imidlertid er slike studier mangler i prostata kreft. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten vise roman miRNA mediert inaktivering av Abl kinaser i prostatakreft. I lys av vår nåværende resultater, foreslår vi at de observerte effektene av MIR-4723 på apoptose, spredning, invasjon og migrasjon er mediert av sin evne til å undertrykke Abl kinaser.
En person miRNA er i stand til å regulere flere distinkte mRNA [36], [37], og det har vist seg at pleiotropisk undertrykkelse av multiple nedstrøms mål kan forklare de fenotypiske forandringer observert av endrede nivåer av visse mirnas [38] – [42]. Vi fant ut at Mir-4723 undertrykker også Methyl CpG bindende protein (MeCP2) og grin, alfa 3 (ITGA3). MeCP2 er en kjernefysisk multifunksjonell protein involvert i flere cellulære prosesser, slik som kromatin omorganisering, arkitektur og transkripsjonsregulering [43]. I de senere årene har en rolle for MeCP2 dukket opp i cellevekst og spredning [44]. I prostata cancer, studier antyder at MeCP2 er nødvendig for prostatacancer cellevekst [45], [46]. Hemming av MeCP2 uttrykk ved stabil kort hårnål RNA stoppet veksten av både normale og kreft menneskelige prostata celler mens ektopisk MeCP2 uttrykk dratt en vekst fordel for menneskelige prostata kreft celler. Viktigere, dets ekspresjon tillatt androgen-avhengige celler til å vokse uavhengig av androgen stimulering og for å beholde tumorigene egenskaper i androgen-utarmet betingelser [45]. I en annen studie, stanse av MeCP2 i PC3 celler førte til redusert spredning og økt apoptose [46]. Integrin A3 (ITGA3), en celle adhesjonsmolekyl av integrinfamilien, spiller flere viktige roller i prosesser som kreves for progresjon av kreft, deriblant spredning, overlevelse, invasjon og metastase [47]. Dette integrin reseptor danner komplekser med ulike membran, cytoskeletal og signalmolekyler å regulere celle adhesjon, migrasjon, signaltransduksjon over cellemembraner, og cytoskeletal organisasjon [47], [48]. Inte er attraktive mål for anti-kreftbehandling, og det har vært preklinisk og klinisk utvikling av antagonister rettet mot inte [49].
I konklusjonen, vår studie identifiserer MIR-4723 som en viktig miRNA som regulerer prostatakreft vekst gjennom inaktivering av Abl kinaser, MeCP2, ITGA3. Vår studie slår fast at lav uttrykk for MIR-4723 er assosiert med dårlig overlevelse og utviklingen av prostatakreft.
