Abstract
Irinotecan, en analog av camptothecin, blir ofte brukt som monoterapi eller i kombinasjon med andre kreft narkotika for behandling av tykktarmskreft. Imidlertid medikamentresistens av tumorer er en hovedhindring for vellykket behandling av kreft. I denne studien har vi etablert at celler skaffe kronisk motstand mot irinotecan. Vi profilert sine differensial genuttrykk ved bruk av microarray. Etter genet ontologi (GO) og KEGG pathway analyse av microarray data, vi spesielt undersøkt om Sestrin3 kan redusere irinotecan motstand. Våre resultater viser at Sestrin3 forbedret anticancer effekten av irinotecan
in vitro
i LoVo celler som hadde oppnådd resistens mot irinotecan. Irinotecan-resistente LoVo celler viste (ROS) produksjon lavere reaktive oksygenforbindelser enn sine irinotecan-sensitive foreldre celler. ROS produksjonen ble økt med Sestrin3 knockdown i irinotecan-resistente LoVo celler. Våre resultater tyder på at Sestrin3 kan være en god target for å utvikle behandlingsformer som kan bidra til å overvinne motstanden mot irinotecan
Citation. Choi SH, Hong HK, Cho YB, Lee WY, Yoo HY (2015) Identifisering av Sestrin3 involvert i
in vitro
Resistance av tykktarmskreftceller til å Irinotecan. PLoS ONE 10 (5): e0126830. doi: 10,1371 /journal.pone.0126830
Academic Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 04.11.2014; Godkjent: 08.04.2015; Publisert: 14. mai 2015
Copyright: © 2015 Choi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All microarray data filer er tilgjengelig fra GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) via sjonsnummer GSE59501
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Korea Helse teknologi R D Prosjekt gjennom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansiert av Helsedepartementet Velferd, Republikken Korea (HI14C3418), National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2060410) og Samsung Medical Center stipend. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
forekomsten av tykktarmskreft er over en million per år på verdensbasis, med en dødelighet på opp til 33% i utviklede land [1]. Tykktarmskreft er den femte vanligste kreftformen. Kjemoterapi har blitt anerkjent som effektive i behandling av spredning tykktarmskreft. Typisk fluorouracil (5-FU) er blitt benyttet som en eneste terapi. Men i de siste to tiårene, klinisk praksis har brukt cytotoksiske medikamenter som fluoropyrimidin, irinotecan, og oksaliplatin. Standard kombinasjon kjemoterapiregimer er FOLFIRI (folinsyre, fluorouracil og irinotecan), CapIri (kapecitabin og irinotecan), FOLFOX (folinsyre, fluorouracil og oksaliplatin), eller CapOx (kapecitabin og oksaliplatin). Erstatte irinotecan med oksaliplatin har bidratt til økt overlevelse [2, tre]. Irinotecan (CPT-11), et derivat av naturlig camptothecin, er en viktig terapeutisk legemiddel for metastatisk kolorektalcancer (CRC) pasienter [4]. Irinotecan kjemisk omdannes til sin aktive form, 7-etyl-10-hydroksycamptothecin (SN-38), som hemmer DNA-topoisomerase. Den steiling av topoisomerase ved replikasjonsgaffelen ved SN-38 induserer en permanent DNA dobbeltkjedet pause, som frembringer et DNA-skade respons (DDR). DNA-skade er primært avføles av kinaser ATR og ATM, den økte aktiviteten som fører til aktivering av kinaser sjekkpunkt chk1 /chk2 og den påfølgende fosforylering av p53. Fosforylerte p53 er mer stabil, noe som kan aktivere apoptose eller regulere cellesyklus-stans. p53 spiller også en rolle i antioksidant reaksjon, som ble oppdaget gjennom identifisering av en ny Sestrin (
SESN
) genfamilie, som er involvert i reaktive oksygenarter (ROS) regulering [5]. Basert på primær og sekundær struktur analyser ved hjelp av PSI-Blast og 3DPSSM programmer,
SESN
familie er rapportert å kode antioksidant proteiner [6, 7]. Sestrin proteiner har en høy grad av homologi med
Mycobacterium tuberculosis
protein AhpD, deling likheter i deres N-terminal domener [5]. De er ansvarlig for kata reduksjon av peroxiredoxins (Prdx) som metaboliserer peroksider [8]. Den AhpD protein, en komponent av alkyl-hydroperoksid reduktase delta i forsvaret mot ROS, er ansvarlig for regenerering av AhpC, et medlem av en konservert familie av tiol-spesifikke peroxidases (Prxs) [9].
Sestrin1 Hotell og
Sestrin2
gener transcriptionally regulert under kontroll av p53, mens
Sestrin3
reguleres av AKT /FOXO akse gjennom FOXO1 /FOXO3a-mediert genet uttrykk [5, 10].
Sestrin3
er også involvert i ROS avgiftning samt forsinke cellular alderdom gjennom FOXO [11]. Av de tre medlemmene av Sestrin familien, det tredje medlem,
Sestrin3
, har blitt rapportert i litteraturen i mindre grad enn de to andre.
Selv om irinotecan viser potent aktivitet mot et bredt spekter av svulster, inkludert tykktarmssvulster, resistens er fortsatt et stort hinder for effektiv kjemoterapi. Derfor er nye mål å overvinne resistens som er nødvendig for vellykket behandling av kreft. Flere hypoteser har blitt foreslått med hensyn involvert i resistens overfor CPT mekanismer, herunder redusert cellulær akkumulering av CPT grunn av aktiv effluks av ATP-bindende kassett (ABC) transportører, enzymatiske systemer som er relevante for metabolsk omdannelse, endring i strukturen eller plasseringen av topoisomerase , og endringer i cellulær respons overfor CPT-TOPI-DNA-ternært kompleks-dannelse [7]. Selv om flere eksperimentelle tilnærminger har vært forsøkt klinisk å overvinne enkelte resistensmekanismer [7], bemerkelsesverdig suksess har ennå ikke oppnådd.
I denne studien har vi etablert en cellelinje som ervervet kronisk motstand mot irinotecan. Målet vårt var å sammenligne transkripsjons profil i irinotecan-resistente tykktarmskreft cellelinje som i foreldre irinotecan-sensitive celler, for å søke etter nye markører for å øke følsomheten til irinotecan. Vi undersøkte også om Sestrin3 kunne forsterke anticancer effekten av irinotecan
in vitro
, i irinotecan-resistente tykktarmskreft cellelinje.
Materialer og Metoder
Cellelinjer og kultur forhold
den menneskelige tykktarmskreft cellelinjer HCT116, HCT15, HCT29, KM12SM, SW620, DLD1, CoLo205, og LoVo ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, og 2,05 mM L-glutamin ved 37 ° C. Cellelinjer ble testet regelmessig for identitet og mykoplasma-infeksjon, ved hjelp av MycoAlert mycoplasma deteksjonssett (Lonza).
Western blot-analyse
Cellene ble lysert i RIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl , 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, og 0,1% natriumdodecylsulfat) supplementert med proteasehemmere og fosfatase-inhibitorer. Antistoffer brukes for immunoblotting var kanin monoklonalt anti-ATM (D2E2, Cell signalering), kanin polyklonale anti-fosfor-Chk1 (Ser317, Cell signalering), kanin polyklonale anti-ATR, TopBP1, CtIP (Bethyl laboratorier), og monoklonalt anti- NBS1 (1D7, Novus Biologicals). Polyklonale antistoffer mot Sestrin3 ble kjøpt fra Abcam. Mus monoklonalt anti-Chk1 (G-4) og anti α-tubulin ble kjøpt fra Santa Cruz bioteknologi. Antistoffer mot AMPKα (23A3), fosfor-AMPKα (Thr72, 40H9), p70S6K og fosfor-p70S6K (Thr389, 108D2), mTOR (7C10), og fosfor-mTOR (Ser2448) ble kjøpt fra Cell Signaling.
Utvikling av irinotecan-resistente cellelinje
Hvis du vil lage en stabil tykktarmskreft cellelinje kronisk motstandsdyktig mot irinotecan ble LoVo celler eksponert for irinotecan med en initial konsentrasjon på 0,1 mikromol /l i RPMI 1640 supplert med 10% FBS. Da dyrkede celler nådde en sammenflytning på 80%, ble 20% av cellene på ny sådd ut for neste passasje. Celler ble passert 3 ganger ved samme konsentrasjon av irinotecan for å sikre deres tilpasning og deretter behandlet med 2-ganger høyere konsentrasjon av irinotecan. Konsentrasjonen av irinotecan ble sekvensielt øket inntil den nådde en sluttkonsentrasjon på 8 umol /l. Irinotecan ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich.
celleviabilitet og cytotoksisitetsanalyser
kolorektal kreft-cellelinjer ble sådd på 96-brønners cellekulturplater i RPMI 1640, supplert med 10% FBS. Etter 24 timers inkubering ble mediet erstattet med friskt medium inneholdende irinotecan. Forskjellige konsentrasjoner av irinotecan ble brukt til å behandle cellene i 72 timer. Den cellelevedyktigheten eller cytotoksisitet ble evaluert ved bruk av celletellingsleder-8 (CCK-8) analyse, i henhold til produsentens instruksjoner. Kort beskrevet ble 10 ul av CCK-8-løsning tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i to timer ved 37 ° C,. Absorbansen ble målt ved 450 nm.
klonogene overlevelsesanalyse
Cellene ble dyrket i et medium inneholdende irinotecan i konsentrasjoner på 0,05, 0,1, 0,4, 0,8, 1,5, og 3 uM, respektivt . Etter 24 timer ble cellene løsnet og sådd ut på 60 mm kulturskåler. Etter 14 dager ble de gjenværende koloniene ble vasket med PBS, farget med krystallfiolett, og deretter talt i henhold til definerte kolonistørrelsene. Alle eksperimenter ble gjentatte ganger uavhengig av hverandre minst 3 ganger. Den statistiske signifikans av forskjellen i koloni tallene ble bestemt ved bruk av en to-tailed t-test.
Cell syklus analyse
For cellesyklus analyser, flowcytometri ble gjennomført ved hjelp LoVo celler behandlet med og uten irinotecan. Kort beskrevet ble celler ble løsnet med trypsin, vasket med PBS og resuspendert i 0,5 ml PBS. Etter fiksering med 4,5 ml av 70% etanol, ble cellene inkubert på is i 2 timer. Fikserte celler ble vasket, resuspendert i 1 ml av en propidiumjodidfarging oppløsning som inneholder 0,1% (v /v) triton X-100, 0,2 mg /ml RNase A og 20 ug /ml PI, inkubert ved romtemperatur i 30 min, og deretter holdt på is inntil flowcytometri analyse ble utført.
RNA interferens (RNAi)
For transient RNA Slå ble cellene transfektert med siRNA-måls Sestrin3 (siSESN3) eller med ikke-måls siRNA (siControl), ved hjelp av lipofektamin RNAiMAX transfeksjon reagens (Life Technologies).
Målinger av mobilnettet ROS
den generasjonen av intracellulær ROS ble evaluert ved bruk av CellRox grønn oksidativt stress reagens ( Invitrogen). Kort beskrevet ble celler ble transfektert med sirnas i 48 timer og deretter inkubert med 5 uM av CellRox reagens ved 37 ° C i 30 minutter. Etter vask to ganger med PBS, ble fluorescens intensitet målt ved hjelp av fluorescerende mikroskopi.
RNA Isolation og Gene Expression Profilering
I denne studien har vi utført global genekspresjon analyser med Affymetrix Genechip Menneskelig Gene 1.0 ST oligonukleotid arrays som bruker LoVo celler og irinotecan resistente LoVo-R8 celler dyrket med eller uten irinotecan (8 mm). Prøvene ble fremstilt i henhold til de instrukser og anbefalinger som er gitt av produsenten. Det totale RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen kolonner). RNA kvalitet ble vurdert å bruke Agilent 2100 Bioanalyzer med en RNA 6000 Nano Brikke (Agilent Technologies). RNA mengden ble bestemt ved bruk av ND-1000 spektrofotometer (Nanodrop Technologies, Inc.). RNA prøver (300 ng hver) ble anvendt som input til Affymetrix prosedyre som beskrevet i protokollen. I korte trekk ble 300 ng av total RNA fra hver prøve omdannet til dobbeltkjedet cDNA, ved hjelp av en tilfeldig heksamer som omfatter en T7-promoter. Amplifiserte RNA ble dannet fra dobbelt-trådet cDNA templat skjønt
in vitro transkripsjon
og renset med Affymetrix prøven opprydding modul. cDNA’er ble regenerert ved revers transkripsjon ved hjelp av tilfeldige primere og en dNTP blanding som inneholder dUTP. cDNA ble så fragmentert av UDG og APE 1 restriksjonsendonukleaser og end-merket av en terminal transferase reaksjon som innarbeidet en biotinylert dideoksynukleotid. Fragmenterte og end-merket cDNA ble hybridisert ved hjelp av Genechip Menneskelig Gene 1.0 ST arrays for 16 timer ved 45 ° C og 60 rpm, som beskrevet i Gene Chip Hele Avskrift (WT) Sense Target merkingsassay Manual (Affymetrix). Etter hybridisering, ble chips farget og vasket i Genechip lufthåndtering Station 450 (Affymetrix), og skannet med en Genechip Array scanner 3000 7G (Affymetrix). For statistisk analyse, ble en deteksjons samtale (Present /Fraværende) genereres av Affymetrix microarray suite 5 (MAS5) algoritme. De skannede råfiler ble importert til den statistiske programmeringsmiljøet R (Version2.3), for videre analyse med verktøy fra Bioconductor Project. Expression data ble normalisert og log2-transformert ved hjelp av robust multichip gjennomsnittet (RMA) metoden implementert i Bioconductor pakken RMA (M2, M3). For å redusere støy i betydningen analyse, sonde sett som ikke viser en deteksjons samtale hastighet på minst 50% av prøvene ble filtrert ut. Høyt uttrykte gener som viste en 2 ganger endring i uttrykket ble valgt. Resultatene ble klassifisert ved hjelp av hierarkiske clustering algoritmer implementert i TMEV programvare 4.0. Array data ble avsatt på Gene Expression Omnibus med tiltredelse antall GSE59501.
Statistisk analyse
In vitro
eksperimentelle data ble hentet fra eksperimenter gjentatt tre ganger i tre paralleller. Middelverdiene ble beregnet, og signifikans ble bestemt ved bruk av Students tosidige test.
P
verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Etablering av irinotecan-resistente cellelinjer
Før generere en tykktarmskreft cellelinje med ervervet resistens mot irinotecan, har vi testet den cytotoksisitet av irinotecan på flere kolorektal kreft cellelinjer for å identifisere de mest sensitive en. Av åtte cellelinjer, LoVo cellelinjen var den mest følsomme for irinotecan (figur 1A). Cytotoksisiteten av irinotecan til foreldre og resistente LoVo (LoVo-R) celler ble bestemt ved bruk av CCK-8-analyse. De LoVo-R-celler var mer resistente mot irinotecan enn foreldre LoVo-celler. IC
50 verdier av LoVo-R og foreldre LoVo var 10 mikrometer og 1,5 mikrometer, henholdsvis. Vi etablerte flere resistente cellelinjer ved hjelp av ulike sluttkonsentrasjoner på irinotecan. Men tilsvarende nivåer av IC
50 ble funnet over de resistente cellelinjer med forskjellige sluttkonsentrasjoner av irinotecan (fig 1B). Motstanden av den LoVo-R8-cellelinjen ble bekreftet ved anvendelse av en klonogene analyse (figur 1C). Den LoVo-R8 cellelinje tilpasset til å irinotecan ved en sluttkonsentrasjon på 8 um. Det er godt kjent at irinotecan spesifikt inhiberer DNA-replikasjon ved å fange topoisomerase I i DNA-trådene som induserer cellesyklusarrest i G
2 fase. For å undersøke effekten av irinotecan på cellesyklusprogresjon av LoVo-R8-celler, har vi videre analysert cellesyklusen av denne cellelinje (Fig 1 D). Lovo foreldre celler som ble behandlet med 5 mikrometer med irinotecan viste alvorlig G
2 /M arrest. Etter 24 timer med irinotecan behandling (5 uM), cellesyklus-stans i G
2 /M-fasen ble sett bare i foreldre LoVo-celler, men de LoVo-8R celler behandlet med og uten irinotecan viste ingen forskjell i deres cellesyklusprogresjon.
(A) følsomheten til åtte koloncancercellelinjer til irinotecan ble målt ved bruk av CCK-8-analyse. For CCK-8-analysen ble cellene eksponert for irinotecan ved gitte konsentrasjoner i 72 timer før måling. Cellelevedyktigheten ble presentert som prosent i forhold til ubehandlede celler. (B) Motstanden av etablerte LoVo-celler til irinotecan ble målt ved bruk av CCK-8 assay og (C) den klonogene overlevelsesanalysen. Kolonier som overlevde den klonogene overlevelsesanalysen ble målt etter ytterligere inkubering i ytterligere 14 dager. (D) cellesyklusprogresjon av LoVo-R8. *
p
≤ 0,05.
Gene uttrykk rekke analyse av irinotecans bestandig LoVo-R8 celler
Etter fastsettelse av irinotecan-resistente LoVo-8R cellelinjer, vi undersøkt deres genuttrykk profiler ved hjelp av DNA microarray. Ved hjelp av en filterkriterium minst to ganger endring med
p
0,05, antallet gener med endringer i ekspresjon i LoVo-8R-celler, sammenlignet med foreldre LoVo-celler, ble bestemt. Totalt 599 og 566 gener ble oppregulert og nedregulert, henholdsvis, utgjør 3,5% av den totale genene probet (figur 2A og 2B). En funksjonell annotering av disse genene ble utført ved anvendelse av en gen ontology basert analyse av biologiske egenskaper. Genene ble kategorisert i 15 funksjonelle grupper (Fig 2A og 2B). De fleste av disse genene var forbundet med den inflammatoriske respons, angiogenese, celleproliferasjon, eller cellemigrering.
Gener som ble utvalgt ved hjelp av et filter kriterium på minst en to-gangers forandring sammenlignet med kontroller med
p
0,05. Gener med endret ekspresjon i irinotekan-resistente LoVo cellelinje sammenlignet med originalen LoVo-cellelinjen, er kategorisert i 15 funksjonelle grupper basert på genet ontology. Genet tall vises i grafer (A) og probet genet tall i denne rekke analyse og prosentverdiene av vesentlig endret genene er presentert i en tabell (B). (C) Hierarkisk klynge analyse av irinotecan-resistente LoVo celle uttrykk mikromatriser. En klynge basert representasjon av endrede genene i irinotecan-resistente celler med intensitet, normalisert til foreldre LoVo cellelinje. Gener som ble oppregulert i forhold til foreldre LoVo celler er vist i rødt, og de som ble nedregulert vises i grønt. Uttrykket nivåer av disse genene ble forandret ≥1.5-fold eller ≤0.6-fold i irinotekan-resistente LoVo cellelinjer sammenlignet med den opprinnelige LoVo-cellelinjen. Gene symboler vises i riktig rad.
En hierarkisk clustering varmekart (figur 2C) skildrer de mønstre av endring i genuttrykk nivåer observert i irinotecan-resistente LoVo celler. Hele 24-genene viste seg å være involvert i reaksjonsveien irinotecan eller å være cellesyklus-stans-relaterte gener, basert på analyse av biologiske egenskaper som utføres ved hjelp av genet ontology. Totalt 53 banene ble funnet, basert på den KEGG sti analyse. Hele clustering varmekartet er presentert som supplerende data i S1 fig. Vi analyserte også funksjoner av kjente gener som er involvert i reaksjonsveien for irinotecan kolorektal kreftceller. CYP3A4 og CYP3A5 er involvert i dannelsen av carbonyloxycamptothecin, en inaktiv metabolitt av irinotecan. RNA nivåer av to ATP-bindende kassett trans proteiner (ABC), ABCG2 (kjent som brystkreft motstand protein) og ABCB1 ble dramatisk oppregulert i irinotecan-resistente celler (figur 2C og S1 Table). Det er ikke overraskende, med tanke på at utstrømming av irinotecan i tumorceller er avslørt som en potensiell strategi for å overvinne resistens.
Uttrykk av gener involvert i veien for DNA-skade sjekkpunkt
Å finne nye markører som er relatert til irinotecan motstand, undersøkte vi uttrykket av flere gener som er involvert i DNA-skade sjekkpunkt signalering. Irinotecan-sensitive LoVo-celler viste et samme nivå i CtIP (CtBP samspill protein) og TopBP1 (topoisomerase (DNA) ll-bindende protein 1) ekspresjon, på en doseavhengig måte. I irinotecan-resistente LoVo celler, CtIP uttrykk var mer eller mindre økt. Med uttrykket av TopBP1 ble ikke endret. CHK1 (CHEK1, sjekkpunkt kinase 1) ble aktivert av fem mikrometer av irinotecan i foreldre LoVo celler. Imidlertid, CHK1 ble ikke aktivert i LoVo-8R celler behandlet med samme konsentrasjon av irinotecan (figur 3A). Dermed kan bare fosforylert CHK1 viste en differensial uttrykk mønster i irinotecan-sensitive versus-resistente celler (S2 Fig). Aktiveringen av CHK1 ved eksponering overfor ioniserende stråling (IR) eller UV-stråling var normale i både irinotecan-sensitive og resistente-celler (figur 3B). Imidlertid fosforyleringen nivået av CHK1 som respons på IR og UV var høyere i irinotekan-sensitive LoVo-celler. Disse resultatene gjorde oss videre undersøke cellesyklus arrest relaterte gener, for å finne nye markører for irinotecan motstand.
(A) Uttrykk av flere gener involvert i DNA-skade respons i irinotecan-resistente celler. CHK1 ble aktivert ved 5 mikrometer i foreldre LoVo celler, men resistente LoVo celler viste ikke aktiveringen av CHK1. (B) DNA-skader, slik som IR og UV-indusert aktivering av CHK1 i LoVo og LoVo-celler 8R. Fosforyleringen av CHK1 som respons på IR (10 Gy) og UV (50 J /m
2) høyere i LoVo-celler enn det som i LoVo-celler 8R. Grafen viser fosforylering nivå CHK1. Forskjellene ble betraktet som signifikant på
p
0,05 ved t-test. *, Sammenligning mellom LoVo celler vs LoVo-R8 celler.
Sestrin3 knockdown forbedret irinotecan celle cytotoksisitet i resistente LoVo celler
For å finne markører for irinotecan motstand, vi analyserte oppregulert gener funnet å være involvert i cellesyklus arrest, basert på microarray data. Sestrin3 ble dramatisk oppregulert i de LoVo-R8-celler (tabell 1). Sestrin3 knockdown påvirket ikke giftigheten av irinotecan til foreldre LoVo-celler. Den relative mengden av Sestrin3 mRNA nivå ble økt i LoVo-R8 celler, og western blot analyse viste Sestrin3 proteinnivå ble også økt i LoVo-R8 celler (figur 4A og 4B). Ved hjelp av qPCR-analyse ble Sestrin3 transkripsjon bekreftet å bli nedregulert ved å transfektere siSESN3, men levedyktigheten av LoVo-celler ble ikke påvirket av siSESN3 behandling (figur 4C). Sestrin3 knockdown redusert motstand av LoVo-celler R8 til irinotecan, redusere IC
50 verdien til 4 um (figur 4D). Sestrins, en familie av stress-induserbare proteiner, deler en høy grad av homologi med det bakterielle AhpD protein som er ansvarlig for å katalysere reduksjonen av peroxiredoxins. Vi målte ROS akkumulering under kontrollerte Sestrin3 nivåer i hver cellelinje (figur 4E). LoVo-R8-celler viste en lavere ROS opphopning enn deres foreldre LoVo-celler. Sestrin3 knockdown økt ROS-produksjon i begge celletyper.
(A) Den relative mengde av Sestrin3 mRNA nivå ble øket i LoVo-R8 celle ved realtime PCR. (B) Ifølge oppregulert Sestrin3 avskrift, western blot analyse viste Sestrin3 proteinnivå ble også økt i LoVo-R8. Behandling av Sestrin3 siRNA (siSESN3) effektivt nedregulert proteinnivået av økt Sestrin3 i LoVo-R8. (C) Sestrin3 avskrift ble nedregulert ved trans siSESN3 i qPCR analyse (til venstre). LoVo-celler ble utsatt for irinotecan med doseavhengig, og levedyktigheten av LoVo ble ikke påvirket selv under siSESN3 behandling (høyre). Celler ble behandlet med siSESN3 i 48 timer. Kulturmedier ble endret med medium inneholdende den angitte konsentrasjon av irinotecan og ytterligere inkubert i 72 timer. Den cellelevedyktighet er presentert som prosent i forhold til ubehandlede celler. (D) Sestrin3 transkripsjon ble også ned regulert i LoVo-R8 ved trans siSESN3 i qPCR analyse (til venstre). LoVo-R8-celler var resistente overfor irinotecan, men ble endret til å være utsatt for irinotecan ved siSESN3 behandling (høyre). (E) Fluorescens bilder av intracellulære ROS farget med CellRox grønne reagens. Cellene ble transfektert med kontroll siRNA eller siSESN3. ROS ble målt etter 48 timer. (F) Western blot som viser proteinnivåer AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, p70S6K, og p-p70S6K i LoVo LoVo-og R8 sammen med eller uten irinotecan. (G) Diagram som viser nivåene av proteiner. Forskjellene ble betraktet som signifikant på
p
0,05 av t-testen. *, Sammenligning mellom gruppen uten irinotecan vs gruppe med 10 mikrometer irinotecan i LoVo og LoVo-R8; #, Sammenligning mellom LoVo vs LoVo-R8.
Deretter undersøkte vi fosforylering av AMPK, mTOR, og p70S6K å undersøke om Sestrin3 påvirker motstand mot irinotecan gjennom AMPK /TORC1 pathway ( fig 4F og 4G). LoVo-R8 celler viste høyere uttrykk nivåer av AMP aktiverte protein kinase (AMPK) og av AMPK fosforylering enn foreldre LoVo celler. Fosforylering av mTOR og S6K (p70S6 kinase), ble en mTORC1 underlaget økt i LoVo-8R celler. Videre LoVo-8R celler viste konstitutiv aktivering av AMPK og mTOR med eller uten irinotecan sammenlignet med LoVo celler.
Diskusjoner
Irinotecan har vært mye evaluert som monoterapi og i kombinasjonsregimer med andre kjemoterapeutiske legemidler. Etter godkjenning for behandling av metastatisk kolorektalcancer har irinotecan blitt brukt til å behandle en rekke andre kreftformer, blant annet lungekreft, magekreft, hjernesvulster og brystkreft. Imidlertid har medikamentresistens av tumor for irinotecan begrenset dets effekt i kliniske behandlinger. Vi har etablert en stabil cellelinje som er resistent mot irinotecan. Den mest sensitive cellelinjen ble valgt fra åtte kolorektal-cellelinjer, basert på cytotoksisitetsanalyser. Vi indusert kronisk motstand ved å eksponere cellene til en økende dose av irinotecan. For å bekrefte deres tilpasning, ble celler som ervervet resistens dyrket i et rusfritt medium for tre passasjer. Etter dyrking i stoff-fri medium, lovo-R8 celler som hadde oppnådd resistens mot irinotecan opprettholdt den til samme nivå som de fersk etablerte celler. Microarray data ble analysert for å identifisere viktige gener som spiller viktige roller i motstanden mot irinotecan. Totalt 1165 differensielt uttrykte gener (degs) ble erholdt. En Gene Ontologi anrikning analyse viste at nivået av Sestrin3 ble dramatisk økt. Men uttrykket nivåer av de to andre medlemmene av Sestrin familien, Sestrin1 og Sestrin2, ble noe endret. Sestrins er en familie av høyt konserverte, stress-responsive proteiner. Sestrin1 og Sestrin2 er transcriptionally regulert av p53. Sestrin3, regulert av gaffelhodetranskripsjonsfaktor, viser oksidoreduktase aktivitet
in vitro
. Det har blitt rapportert at SESN3 kan beskytte cellene mot oksidativt stress ved å modulere peroxiredoxin (PRX) gjenfødelse [10]. Vi forventet at Sestrin1 og Sestrin2 ekspresjon ville være oppregulert fordi forskjellige DNA-skade midler er kjent for å påvirke cellesyklusprogresjon gjennom p53-aktivering. Fra våre array-data, S2 tabell viser ekspresjonsnivåene av Sestrins, så vel som gener relatert til p53 pathway. Av de 24 genene identifisert i denne studien som blir involvert i irinotecan sti av tykktarmskreft, uttrykket nivåer av
CES1 Hotell og
CES2 plakater (involvert i omdannelsen av den pro-drug til irinotecan ) ble redusert med ca 25%. Av de 24 genene, de koder ATP bindende kassetten (ABC) proteiner som er involvert i utstrømming, for eksempel
ABCB1 Hotell og
ABCG2
, var de mest up-regulerte gener. Motstand mot irinotecan er påvirket av DNA reparasjonssystemer.
ERCC1 Hotell og
ERCC2
, som deltar i nucleotide excision reparasjon, viste en viss økning i sitt uttrykk. Men uttrykket av
MLH1 Hotell og
MLH6 plakater (involvert i mismatch reparasjonsprosessen) endret seg lite. Av de 24 genene, gjorde de som er involvert i den apoptotiske sti ikke vise noen forskjell i uttrykk mellom irinotecan-sensitive og irinotecan-resistente celler. Tatt i betraktning disse variasjoner i genekspresjon, kan ervervet resistens for irinotecan i LoVo-R8-celler skyldes nedsatt cellulær akkumulering av irinotekan eller å konvertering av irinotekan til en aktiv metabolitt, fordi SN-38 ble redusert til en viss utstrekning.
Irinotecan behandling er assosiert med G2 cellesyklus arrest. Vi undersøkte den kategorien av cellesyklus arrest i Gene ontologi, for å finne de viktigste målene for cellesyklus-mediert motstand. Sestrin3 ble vist å modulere PRX regenerering i kreftceller. Ekspresjonsnivået av Sestrin3 ble økt gjennom transkripsjonen aktivering av FOXO1. Mens Sestrin familien er innblandet i redoks kontroll [5, 8, 12], har nyere studier vist rolle Sestrins i mTORC1 signalering. mTORC1 inhiberes av medlemmer av familien Sestrin (SESN1 /2), gjennom AMPK-mediert aktivering av TSC1 /2-komplekset [12]. Sestrin3 er blitt rapportert å hindre mTORC1, basert på det funn at FOXO1 /3a-mediert transkripsjonen oppregulering av Sestrin3 fortsetter å aktivere AMPK /TSC1 /2, som eventuelt hemmer mTORC1 aktivitet [13]. I tillegg fører aktivering mTORC1 til akkumulering av ROS, noe som resulterer i aktivering av JNK /FOXO signalering, og en positiv tilbakekoblingssløyfe fra Sestrin uttrykk [5, 14]. Imidlertid er rollen til Sestrin3 i onkogenese og motstand mot kreftlegemidler forblir tvetydig. Undersøkelse av AMPK /mTOR sti i LoVo og LoVo-R8 celler viste at AMPK signal ble aktivert i irinotecan behandlet celler eller irinotecan-resistente celler (figur 4F). Vanligvis er det forventet at mTOR signaliserer etter hemming av aktiv AMPK ville indusere autofagi [15.]. I vår studie, men AMPK aktivering hemmet ikke mTOR. Selv mTOR signal er nært forbundet med AMPK signal og er faktisk ned-stream til AMPK, TSC1 /2 og rheb er hub molekyler av mTOR signalveien integrere ulike innganger [16, 17]. Vår studie viser en positiv i stedet for en negativ regulatoriske forhold mellom AMPK og mTOR.
Vårt resultater og tolkninger ble fokusert på antioksidant effekten av Sestrin3 på motstand mot kreft narkotika. Generelt, kreftcellene gjennomgår aerob glykolyse for å tilfredsstille den høye nærings krav som stilles til den cellulære og ekstracellulære miljø ved deres hurtige spredning. Krav om økt energiproduksjon bringe kreftceller til å vende alvorlig oksidativt stress, som aktiverer forskjellige forsvars og reparasjonsmekanismer mot genotoksiske medikamenter, selv om ROS kan også virke som spesifikke andre budbringere i signaleringskaskader som er involvert i celle-proliferasjon og differensiering. I kreftceller, kan akkumuleringen av ROS stimulere cellulær proliferasjon, mutagenese, og genomiske ustabilitet [18, 19]. Følgelig er en opphopning av store mengder ROS oppdaget i celler transformert med
RAS
onkogen [18, 20, 21].
