Abstract
endotelet-avhengige angiogenese er tenkt å være et viktig skritt i kreft progresjon. Vi har tidligere rapportert at metastase-forbundet i tykktarm kreft-en (MACC1) bidro til vaskulær mimikk i magekreft (GC), men det er fortsatt ukjent om MACC1 fremmer endotelet-avhengige angiogenese av GC og om TWIST1 er involvert i denne prosessen. I denne studien, vi har oppdaget MACC1 uttrykk og microvessel tetthet (MVD) ved immunhistokjemi i 159 pasienter med stadium I-III GC, og undersøkt hvilken rolle TWIST1 og vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGF-A) i MACC1-indusert endothelium- avhengig angiogenese bruker hårløse mus med GC xenografter, og menneskelige umbilical vein endotelceller (HUVECs) som var co-kultivert med kondisjonert medium fra overekspresjon og støy MACC1 GC celler. Vi fant at MACC1 uttrykk var positivt korrelert med økt MVD og tumorresidiv i GC pasienter. I GC xenograft-modeller, MACC1 forhøyet MVD og oppregulert ekspresjonen av VEGF-A, så vel som akselerert tumorvekst. I tillegg MACC1 åpenbart økt ekspresjon av TWIST1 og induserte rør-lignende dannelse av HUVECs, mens dempning av TWIST1 trykkes protein ekspresjon av VEGF-A og opphevet virkningen av MACC1 på røret formasjonen. Våre funn belyse funksjon MACC1 i endotel-avhengig angiogenese av GC og foreslå potensielle prognostisk og terapeutisk verdi
Citation. Wang L, Zhou R, Zhao Y, Dong S, Zhang J, Luo Y, et al. (2016) MACC-en Fremmer endotelet-avhengige Angiogenese i magekreft ved å aktivere TWIST1 /VEGF-A Signal Pathway. PLoS ONE 11 (6): e0157137. doi: 10,1371 /journal.pone.0157137
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 08.02.2016; Godkjent: 25 mai 2016; Publisert: 09.06.2016
Copyright: © 2016 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation for Unge Forskere i Kina (No.81302155), Natural Science Foundation National of China (No. 31271564), president Foundation of Nanfang Hospital (No.2015B007), og nøkkelen klinisk spesialitet Discipline Bygging Program of China (The Department of Oncology, Nanfang Hospital)
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Kontinuerlig blodtilførsel er nødvendig for den raske veksten av svulster [1]. I tillegg til godt studert endotelet-avhengige angiogenese, har nyere studier avdekket flere nye mønstre inkludert vaskulær mimikk og mosaikk fartøyer [2, 3]. Vi har tidligere rapportert at metastase-forbundet i tykktarm kreft-en (MACC1) bidro til vaskulær mimikk (VM) dannelse i human magekreft (GC) [4]. Imidlertid er det fortsatt ukjent om MACC1 er involvert i den sanne endotelet-avhengige angiogenese av GC.
MACC1, som en viktig regulator av hepatocytter vekstfaktor (HGF) /c-Met /mitogenaktiverte protein kinaser (MAPK ) signalveien [5-7], fremmer proliferasjon, migrering og invasjon av GC-celler [8], så vel som påvirker tumor glycometabolism [9] og mikromiljøet [4, 10, 11], ved siste forutsi dårlig klinisk resultat for GC-pasienter [8]. Tidligere studier har rapportert at flere regulatorer av VM [12, 13] deltatt i angiogenese [14, 15]. Derfor vi sterkt spekulere at MACC1 spiller en viktig rolle i endotelium-avhengige angiogenese av GC.
Det er rapportert at angiogenese er nært beslektet med post-kirurgi tumorresidiv [16]. Men det er ikke klart om kombinasjon av MACC1 og høy tetthet av microvessel (MVD) ytterligere innflytelse sykdomsfri overlevelse (DFS) for GC pasienter, og heller ikke den molekylære mekanismen for MACC1 angiogenese. I vår foreløpige undersøkelser har vi vist at TWIST1 var nødvendig for MACC1-indusert VM i GC [4], mens TWIST1 ekspresjon fremmet vaskularisering av bryst-karsinom [17, 18] og støttet den vaskulære utvikling ved oppregulering vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) – A [19], som er den første form for identifiserte pro-angiogene faktor [20, 21]. Disse resultatene antyder sterkt at TWIST1 /VEGF-A angiogen akse har en sentral rolle i endotelet-avhengige angiogenese av svulster. Viktigere, tidligere rapporter om analyse av publiserte microarray datasett viste at MACC1 mRNA nivåer var signifikant korrelert med VEGF-A uttrykk i GC vev (TCGA; n = 387, r = 0,224, P 0,001) (S1 fig). Fremfor alt hypoteser om vi at MACC1 fremmer endotel-avhengige angiogenese via aktivering TWIST1 /VEGF-A signale akse i GC.
I denne studien undersøkte vi hvorvidt MACC1 var positivt assosiert med endotel-avhengige angiogenese. Vi oppdaget om MACC1-positive uttrykk og høy MVD spådd korte DFS hos pasienter med GC etter radikal reseksjon. Deretter undersøkte vi rolle MACC1 i angiogenese in vivo og in vitro. Til slutt fant vi ut om TWIST1 /VEGF-A angiogen aksen representerte den underliggende mekanismen for MACC1-indusert endotel-avhengig angiogenese.
Materialer og Metoder
Pasient og Tumor vevsprøver
Parafin-embedded patologiske prøver ble innhentet fra 159 pasienter med stadium i-III GC som gjennomgikk radikal kirurgisk reseksjon ved Nanfang Hospital of Southern Medical University (Guangzhou, Guangdong, Kina) mellom 2005 og 2010. Alle pasientene ble diagnostisert i henhold til 7 th utgaven foreslått av amerikanske Joint Committee on Cancer Manual (AJCC) 2010 iscenesettelse system av GC. Vi bekreftet at alle forsøkene ble utført i samsvar med de relevante retningslinjer og informert samtykke ble innhentet fra alle fag. Studien protokollene ble godkjent av de etiske komiteer på Nanfang Hospital og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient.
dyremodeller
Mann NOD-SCID nakne mus av fem uker gamle ble oppnådd fra Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina). Stabil overekspresjon av MACC1 genet (oxMACC1) og vektorkontrollceller eller stanse av MACC1 (shMACC1) og rykke kontroll GC-celler (1 x 10
7 celler /mus, n = 6) ble injisert subkutant i venstre og høyre sider av ryggen, som tidligere beskrevet [8]. Tumorknuter ble overvåket etter 3 dager ved kalibermålinger av lengde og bredde av tumorene. Tumorvolumene ble beregnet i henhold til formelen: Volum = bredde x lengde x (bredde + lengde) /2. Alle mus ble plassert i en bestemt patogen fritt anlegg i mikroisolatorbur med fri tilgang til autoklaveres mat og surgjort vann supplert med sulfamethoxazole-trimetoprim. Alle dyreforsøk ble godkjent av Forsøksdyr Administration Committee of Nanfang Hospital (Permit Number: NFYY-2015-10) og i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr utgitt av det amerikanske National Institutes of Health. Tumorene fikk vokse til 0,5-1 cm i størrelse i den største dimensjon og ble høstet på dag 18, fordi store tumorvolumet var utsatt for sentral nekrose av svulster som påvirket resultatene i de følgende eksperimenter [8]. Deretter ble vev samling prosedyrer igangsatt etter at dyrene hadde blitt avlivet ved halshugging. Mus ble fjernet fra sine bur og forsiktig behersket mens hviler på benkeplaten. Halshugging ble utført manuelt, og resulterte i eutanasi innen ca 10 sekunder. De subkutane svulster ble brukt til immunhistokjemisk (IHC) farging.
Menneske vaskulær endotel Cell Tube Dannelse analysen
HUVECs tube-analysen ble utført ved å pipettere 200 mL Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ , USA) i hver brønn av 24-brønns plate, som så ble polymerisert i en time ved 37 ° C. HUVECs (1 x 10
5) med 200 ul kondisjonert medium ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 12 timer. Bilder ble tatt ved hjelp av et lyse-feltet mikroskop ved en forstørrelse på 100 x. De kapillarrør ble kvantifisert ved å telle gjennomsnittlig antall fullførte tubulære strukturer i tre tilfeldig utvalgte felt.
Cellelinjer og cellekulturer
OxMACC1 og shMACC1 gastrisk adenokarsinom cellelinjer ble utført som beskrevet i vår tidligere studie [8]. Celler ble opprettholdt med Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA), og 0,5 mikrogram /ml puromycin [8]. Cellelinjer ble godkjent av kort tandem repeat og genotypet ved re-utvidelser, og eksperimenter ble utført med lav passasje kulturer av disse bestandene. HUVECs ble innhentet fra Yiyuan Bioteknologi Company (Guangzhou, Kina), og dyrket i endotelceller vekstmedier (Gibco, Carlsbad, CA, USA) supplert med 0,1 mg /ml heparin og 20% FBS (HyClone) i henhold til leverandørens forslag. For forsøkene ble celler brukes mellom 2 og 5 passeringer.
Plasmider og Cell Transfeksjon
Humant TWIST1 ble amplifisert ved PCR og klonet inn i vektoren pcDNA3.1 (Primersekvensene i tabell S1) ( Invitrogen), og det rekombinante plasmid pcDNA3.1 /TWIST1 ble konstruert. Den tie effektivitet av tre par TWIST1 spesifikke siRNA (Sigma, St. Louis, MO, USA) i ORF regionen ble undersøkt av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR, Primer sekvenser i S2 tabell). GC-celler ble transfektert med pcDNA3.1 /Twist1 og TWIST1 spesifikke siRNA hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
Immunohistochemistry Farging
IHC farging ble utført i henhold til standard protokoll [8]. Snittene ble inkubert med en serie av primære og sekundære antistoffer (S3 Table). Farging score ble evaluert av tre uavhengige anmeldere, og halv kvantitative scoring system ble bestemt som rapportert andre steder [8]. Kort fortalt, for MACC1 fargeintensitet, seksjonene ble scoret som 0 (negativ), en (svak), 2 (middels) eller 3 (intens). Mens farging utstrekning ble skåret i henhold til område prosenter: 0 (0%), 1 (1% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%), eller 4 (76% -100%). Produktene av fargeintensitet og grad score var de endelige farge score (0-12) for MACC1 uttrykk. Svulster av endelig flekker score ≥ 3 ble ansett for å være positive uttrykk, fordi 95% av normal mage vev uttrykt lavt nivå av MACC1 med IHC score på 3 i vår forstudie [8]. Vi videre definert 3 ~ 7 så lavt uttrykk og 8 ~ 12 så høyt uttrykk for å utføre kvalitativ analyse.
microvessel Tetthet
MVD ble bestemt som beskrevet av Weidner et al. [22] . MVD ble vurdert i henhold til blodplate-endotelial celleadhesjonsmolekyl-1 (CD31) IHC-farging av tumorkarene. Seksjonene ble først skannet ved lav effekt objektiv (forstørrelse 100 ×) for å velge de mest vaskularisert (hot-spots) områder. Microvessels i hot-spots ble deretter telles på en forstørrelse på 200 ×, og gjennomsnittlig fartøy teller i seks hot-spots ble beregnet som MVD. Alle tellinger ble uavhengig vurdert av tre observatører som var blindet for de tilsvarende clinicopathologic data. MVD ble klassifisert som enten høy (≥ 36,8) eller lav ( 36,8); 36.8 var medianverdien av MVD.
Enzyme-linked immunosorbent analysen
Konsentrasjonen av TWIST1 og VEGF-A ble kvantifisert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig TWIST1 (Sandwich, Levetid biovitenskap, CA, USA) og VEGF-A (R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA) enzymbundet immunosorbent (ELISA) kit i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene presentert middelverdier fra tre separate forsøk.
Western Blot analyse
Totale proteiner ble ekstrahert og underkastet Western blot som beskrevet tidligere [8]. De polyklonale kanin primære antistoffer mot MACC1 (Abcam, Cambridge, Massachusetts, USA), TWIST1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), VEGF-A antistoffer (Proteintech, Chicago, IL, USA), og den sekundære fluorescens geit anti-kanin-antistoff (LI-COR, Lincoln, NE, USA) ble anvendt i dette eksperimentet. Blottene ble skannet med Odyssey bildesystem (LI-COR).
Kvantitativ Real-Time PCR
Sekvensen av primeren for TWIST1 er oppsummert i S4 tabell. Total RNA ble ekstrahert ved hjelp Trizol Kit (Invitrogen) og revers transkribert ved hjelp av M-MLV RT kit (Promega, Madison, WI, USA). QRT-PCR ble utført med SYBR grønt fargestoff (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 13.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL , USA). Forholdet mellom MVD og clinicopathologic variabler ble undersøkt av Chi-kvadrat test. DFS ble definert som intervallet fra dato for operasjonen til datoen for den første gjentakelse. DFS Hastigheten ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden, og overlevelse forskjeller ble sammenlignet med log-rank test. En multivariat analyse ble utført ved hjelp av Cox regresjonsmodellen. Fare forhold ble presentert med sine 95% konfidensintervall. Den correlationship mellom MACC1 og MVD ble bestemt av Spearmans rank test. Statistisk sammenligning av ulike forsøksgrupper in vivo og in vitro ble utført ved Student t-test. Verdien av P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Heving av MVD og VEGF-A er relatert med tumorresidiv i GC Pasienter
For å vurdere neovascularization indeksen, MVD ble bestemt av IHC farging av CD31 i 159 vev av pasienter med stadium i-III GC. Representative eksempler på farging med høy og lav forstørrelse er vist i fig 1A. Medianverdien av MVD, definert som cut-off-verdi, var 36,8. Vi definerte verdiene høyere enn cut-off så høyt MVD, ellers så lavt MVD. Blant de 159 GC pasienter, ble 106 (66,7%) delt i MVD-høy gruppe og 53 (33,3%) ble gruppert i MVD-lav gruppe (Fig 1 A). Sammenhengen mellom MVD og de ulike clinicopathological parametre ble oppført i S5 tabell. Vi fant ut at MVD-høy var hyppigere hos GC pasienter med tilbakefall (P = 0,001, figur 1C og 1D). Det var ingen signifikant sammenheng refererer til kjønn, alder, histologisk differensiering klasse, dybden av invasjonen (T stadier), lymfatisk metastase (N etapper), og samlet TNM stadier mellom to grupper. Men vår videre analyse viste at MVD var høyere i Stage III enn i både Stage II (P = 0,009) og Stage I (P = 0,007) (fig 1 F), mens dette ikke var tilfelle vurderer individuelle T eller N scenen.
(A) representant farging av CD31 i GC vev. (B) Representative bilder av VEGF-A farget i menneskelige GC vev. (C-E) Representative mikrofotografier (C) og stolpediagram som viser MVD (D) og VEGF-A uttrykket (E) var høyere i tilbakefalls GC enn hos ikke-tilbakefall GC pasienter. Scale bar = 50 mikrometer.
#P 0,01, n = 65 og n = 94 for ikke-tilbakefall og tilbakefall pasienter. (F G) i fase I pasienter, MVD var lavere (F) og gjennomsnittlig VEGF-A score tendens til å være lavere (G) enn i Stage II og trinn III.
#P 0,01 kontra tilsvarende kontrollgruppe, N.S., ingen betydning; n = 26, n = 50 og n = 83 for Stage I, II og III, henholdsvis.
Det er dokumentert at VEGF spiller en sentral rolle i å stimulere tumorblodårer dannelse og biologisk korrelater med MVD [20, 23]. VEGF-A ble det mest studerte av VEGF-familien [20, 21]. Gitt den viktige rollen til VEGF-A i tumor angiogenese, gjennomførte vi den immunfarging i 159 GC vev (figur 1B). Ifølge VEGF-A flekker score, ble pasientene delt inn i grupper på negativ (scorer 0-2), lav (scorer 3-7) og høye uttrykk (scorer 8-12). Det var 108 VEGF-A-positive pasienter, som tok de fleste (positiver 67,9% vs. negativer 32,1%). Blant dem ble 47 (29,6%) pasienter definert som lav ekspresjon, og 61 (38,4%) var så høy ekspresjon. Forholdet mellom VEGF-A uttrykk og tilbakefall ble ytterligere evaluert i GC. Som et resultat, ble VEGF-A funnet å være positivt korrelert med tumortilbakevendende GC-pasienter (P 0,001, figur 1C og 1E). Videre, selv om det ikke var noen statistisk signifikant (P 0,05), VEGF-A uttrykk tendens til å være høyere i Stage II-III enn i Stage jeg bedømme fra box-plot (figur 1G), som foreslo en positiv regulerende rolle VEGF-A på MVD i GC progresjon.
MACC1 Positively korrelerer med MVD og VEGF-A i human GC
for å avklare videre rolle MACC1 i neovascularization av GC, vi setter ut for å avgjøre om MACC1 var korrelert med MVD og angiogen faktor VEGF-A. Deretter ble IHC-farging utført for å påvise MACC1 ekspresjon i GC vevssnitt (figur 2A). Som antydet i figur 2B, MACC1 viste økt ekspresjon i GC pasienter med tilbakefall enn de uten. Spesielt, MACC1 positivt korrelert med MVD (r = 0,258, p = 0,001, figur 2C) og øket VEGF-A ekspresjonsnivået i GC vev (p = 0,008, figur 2D). Heri disse funnene indikerte at MACC1 korrelert med MVD og VEGF-A i menneskelig GC.
(A) Representant MACC1 farget bilder i GC vev. Scale bar = 50 mikrometer. (B) Hyppigheten av negative, lav og høy MACC1 uttrykk i GC pasienter kategorisert etter tilbakefall. (C) MACC1 uttrykk scorene var positivt korrelert med MVD (r = 0,258, P = 0,001 og n = 159). (D) VEGF-A var høyere i MACC1 positivitet svulster.
#P 0,01, n = 23 og n = 136 for MACC1-negative og MACC1-positive svulster, henholdsvis. MACC1 positivt uttrykk inkludert MACC1-lav og -Høy uttrykk.
MACC1 og MVD Indikerer Short DFS for GC Pasienter
Ifølge multivariat analyse ved hjelp av Cox-modell, MVD (P = 0,043, HR = 1,737) og generelle TNM stadier (P 0.001, HR = 2,559) var uavhengige prognostiske parametre forutsi risikoen for tilbakefall etter radikal reseksjon i fase i-III pasienter (S6 Table). Kaplan-Meier overlevelseskurve ble plottet ved hjelp av nevnte prognostiske faktorer. Blant de 159 pasientene, 94 (59,1%) fikk tilbakefall og median tid til tilbakefall var 27,0 måneder. DFS tid var signifikant kortere hos pasienter med avansert TNM stadium (P 0,001, figur 3A). Dessuten, ikke bare MACC1-positive eller MVD-høy alene påvirket DFS, kan en kombinasjon av begge også forutsi den korte DFS i GC-pasienter (figur 3B-3D). Påfallende, 3 års DFS sats for kombinasjonen av MACC1-positive og MVD-høy pasienter var bare 34,5%, mens det var 55,3% for pasienter med svulster som var MVD-lav og negativ for MACC1 (Fig 3D).
(A) Kaplan-Meier analyse av GC pasienter DFS tid i subgrupper av fase i-III. (BD) Kaplan-Meier plott som viser MACC1 positivt uttrykk og forhøyet MVD indikerte kort DFS av GC pasienter kategorisert etter MACC1 uttrykk (B), MVD nivå (C) og ved en kombinasjon av MACC1 positivitet og MVD-høy (D).
MACC1 Fremmer GC endotelet-avhengige Angiogenese in vivo og in vitro
Angiogenese er så viktig for tumorvekst. I første omgang testet vi om endring av MACC1 uttrykk kan påvirke veksten av tumor in vivo. Vi opprettet BGC-823 cellelinjer med oxMACC1 og shMACC1 som beskrevet tidligere [8], og deretter ble cellene injisert subkutant i NOD-SCID nakne mus (n = 6 /gruppe). Som et resultat (figur 4A og 4B), ektopisk ekspresjon av MACC1 lettes tumorigenesis in vivo: det gjennomsnittlige volum av oxMACC1 tumorene var markant større enn den til vektor-kontrollene på dag 18, og shMACC1 injiserte mus viste signifikant minimal tumorvolum. Som vist på figur 4C og 4D, ekspresjonen av VEGF-A ble signifikant økt i de oxMACC1 gruppene sammenlignet med vektor-kontrollgrupper (P = 0,007). I motsetning til VEGF-A poengsum i shMACC1 gruppene var betydelig lavere enn i de rykke ut-kontrollgruppene (P 0,001). I begge cellelinjer, ble mengden av MVD funnet å være markedsført av oxMACC1 og hemmet av shMACC1 (P = 0,025 og P = 0,002, figur 4C og 4E).
(A) Representative bilder av subkutan implantert overekspresjon av MACC1 (oxMACC1) og stanse all MACC1 (shMACC1) svulster i GC xenografter. (B) tumorvolumet kurver på GC-xenotransplantater i 18 dager etter inokulering. * P 0,05;
#P 0,01, n = 6. (C-E) Representative farging av MACC1, VEGF-A, CD31 (C) og kvantifisering (D 0,05;
#P 0,01, n = 6 sammenlignet med den tilsvarende kontrollgruppe. (F) Representative bilder av rør dannelse i tredimensjonale kultur (venstre panel) og kvantifisering (høyre panel) av HUVECs behandlet med kondisjonert medium fra BGC-823 eller MKN-28 GC-celler i 12 timer. WT, vill type. V, vektor. Ox, oxMACC1. S, krafse. Sh, shMACC1. Scale bar = 50 mikrometer. * P 0,05;
#P 0,01, n = 3.
For å bekrefte rollen MACC1 i angiogenese in vitro, vi brukte en veletablert tredimensjonal (3D) kulturmodell i indirekte co-kultur system. Som vist på figur 4F, tettheten av vaskulære rør-lignende strukturer ble dramatisk økt i HUVECs ko-dyrket med kondisjonert medium fra oxMACC1 BGC-823 og MKN28 celler (p = 0,05 og p = 0,003), mens det var betydelig redusert fra shMACC1 BGC-823 og MKN28 celler, sammenlignet med tilsvarende vektor- og krafse-kontrollceller 12 h (p = 0,006 og p = 0,02). Samlet utgjør disse resultatene viste at MACC1 akselerert tumorvekst og indusert endotel-avhengig angiogenese av GC.
MACC1 Fremmer angiogenese ved oppregulering TWIST1 Expression
Vi har tidligere rapportert at TWIST1 var en viktig faktor i MACC1 indusert VM av GC-celler. MACC1 kunne transcriptionally oppregulere TWIST1 [4]. Dette fikk oss til å undersøke om TWIST1 engasjert i MACC1-indusert endotel-avhengig angiogenese av GC. Resultatene viste i figur 5A og 5B antydet at uttrykket av TWIST1 ble åpenbart oppregulert i oxMACC1 GC cellelinjer (P 0,001 og p = 0,024), men ble betydelig nedregulert i shMACC1 GC cellelinjer sammenlignet med tilsvarende kontrollceller (P = 0,002 og P 0,001). Lignende konklusjoner i ELISA-assay (fig S2). Deretter vi har oppdaget protein ekspresjon av VEGF-A i to GC-cellelinjer (figur 5A og 5B), ble VEGF-A sterkt øket ved MACC1 oppregulering (P 0,001 og p = 0,008), men ble redusert med shMACC1 (P = 0,039 og p = 0,041). Lignende resultater ble oppnådd ved ELISA-analysen (figur 5C og 5D). I tillegg IHC flekker i subkutane svulster med GC xenografter viste at TWIST1 og VEGF-A var betydelig større for oxMACC1 celler versus vektor-kontroller, og ble markert redusert for shMACC1 celler versus krafse-kontroller (P = 0,003 og p = 0,026, Fiken 4C og 5E)
(A og. B) Western blot-analyse (øvre panel) og kvantifisering (nedre panel) av MACC1, TWIST1, og VEGF-A-ekspresjon i respons til overekspresjon eller stanse av MACC1 (oxMACC1 og shMACC1) i BGC-823 og MKN-28 GC-celler. * P 0,05;
#P 0,01, n = 3. WT, vill type. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (C 0,05;
#P 0,01, n = 3.
Til nå virker det som TWIST1 er involvert i MACC1-indusert endotel-avhengig angiogenese, så det kommer en annen mulighet:? Er TWIST1 nødvendig angiogenese indusert av MACC1
TWIST1 er nødvendig for MACC1 angiogenese i GC Cells
for å avgjøre om TWIST1 er viktig for MACC1 angiogenese i GC, uttrykt vi ektopisk TWIST1 genet (oxTWIST1) i shMACC1 celler og slått ned den endogene TWIST1 (siTWIST1) i oxMACC1 celler. Tre uavhengige siRNA konstruksjoner mot Twist1 i ORF-regionen ble brukt (S2 tabell). I mRNA-nivåer, alt av de tre siTWIST1 hell trykkes TWIST1 ekspresjon og den mest effektive ene ble anvendt for å transfektere GC-celler (S3) Fig. Effektiviteten av overekspresjon eller stanse ble verifisert ved QRT-PCR og Western blot.
Neste, vi har oppdaget proteinet uttrykket nivået av VEGF-A med Western blot i GC cellelinjer. I begge cellelinjer, ble endring av VEGF-A proteinekspresjon tydeligvis økes ved oxTWIST1 (P = 0,015 og P = 0,02, figur 6A), men det var signifikant redusert ved siTWIST1 (P = 0,022 og P = 0.01, figur 6B). I tube-analysen, ble tettheten av røret formasjon fremmet av oxTWIST1 (P = 0,007 og P 0,001) og ble hemmet av siTWIST1 (P 0,001 og P 0,001, figur 6C). Samlet viser resultatene fra disse komplementære sett av overekspresjon og knockdown eksperimenter demonstrerte at TWIST1 var nødvendig og tilstrekkelig til å delta i MACC1-indusert endotel-avhengige angiogenese, noe som betyr at MACC1 indusert angiogenese via aktivering av TWIST1 /VEGF-A angiogen akse i GC.
(A og B) Western blot-analyse (øvre panel) og kvantifisering (nedre panel) av VEGF-A-ekspresjon i stanse av MACC1 (shMACC1) GC-celler som overuttrykt TWIST1 (oxTWIST1) og overekspresjon av MACC1 (oxMACC1 ) GC celler som forstummet TWIST1 (siTWIST1). * P 0,05;
#P 0,01, n = 3. (C) Representative mikrografer av vaskulære rør-lignende formasjon i tredimensjonale kulturer av HUVECs ble behandlet med supernatantene av shMACC1 /oxTWIST1 eller oxMACC1 /siTWIST1, og med tilsvarende kontroller ved 12 timer. Scale bar = 50 mikrometer. * P 0,05;
#P 0,01, n = 3 i hver gruppe.
Diskusjoner
Angiogenese er tenkt å være et viktig skritt i kreft progresjon, og flere studier har vist sine roller i aggressive kreftformer [24] . Til tross for at tidligere studier har funnet flere effektive regulerings faktorer som fremmer endotelet-avhengige angiogenese [14, 15, 18, 25], den potensielle rolle MACC1 i GC angiogenese er ukjent. I denne studien undersøkte vi hovedsakelig rolle MACC1 på endotelium-avhengige angiogenese av GC. Resultatene viste at oppregulering av MACC1 hadde signifikant korrelasjon med høyere MVD og VEGF-A-ekspresjon i GC. Kombinasjonen av MACC1 positivitet og høy MVD forutsagte korte DFS i GC-pasienter. Videre fant vi at MACC1 økt uttrykk for TWIST1 i GC cellelinjer og tilrettelagt tube dannelse av HUVECs. MACC1 ikke bare forhøyet VEGF-A level in vitro, men også akselerert tumorvekst og induserte microvessel dannelse in vivo. Derfor presentere data fra våre studier viser at MACC1 er en onkogen enhancer for endotelet-avhengige angiogenese og tumorprogresjon hos GC.
Vi har tidligere rapportert at MACC1 ble svekket av metabolsk stress via AMP-aktivert protein kinase (AMPK ) aktivering, og involvert i tumor energiomsetningen ved å styrke Warburg effekten [9]. MACC1 fremmet GC celleproliferasjon og invasjon ved å indusere den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) ved aktivering av HGF /c-Met signalveien [8], og induserte VM dannelse av GC ved HGF /c-Met-TWIST1 /2-VESA cadherin /VEGFR2 signalaksen [4]. I tillegg har det blitt rapportert at MACC1 deltar i forskjellige signaleringsnett, herunder Akt /β-catenin [26] og Ras /Erk [27], aktivering av disse ble også rapportert å forbedre TWIST1 uttrykk [28-30]. I bukspyttkjertelcancercellelinjer, har HGF /c-Met blitt vist til å overføre intracellulært signal via MAPK-reaksjonsveien [31], og er viktig for å fosforylere og stabilisere TWIST1 i brystkreft [28]. Vår tidligere studie gitt den første bevis for at MACC1 transcriptionally oppregulert TWIST1. Samtidig viste vi at HGF tilrettelagt den kjernefysiske translokasjon av MACC1 og oppregulering av TWIST1 å fremme VM i GC, mens en c-Met hemmer motvirket denne prosessen [4]. Imidlertid MACC1 som nøkkelen reguleringsfaktor for HGF /c-Met /MAPK-signalveien [5], dens forhold til TWIST1 i endotelium-avhengige angiogenese av GC har ennå ikke blitt funnet. I denne studien, resultatene viste at MACC1 oppregulert TWIST1 uttrykk og indusert vaskulær tube-lignende formasjon i HUVECs. Derfor MACC1 som en transkripsjonsfaktor kunne transcriptionally modulere endotelet-avhengige angiogenese og megle TWIST1 oppregulering, som er ansvarlig for angiogenese og tumorprogresjon av GC.
Til dags dato, den dominerende rollen TWIST1 i tumorprogresjon er tenkt som skal indusere EMT [32]. Svært få studier viste at TWIST1 fremmet endotelet-avhengige angiogenese ved brystkreft [33] og i leverkreft [34] ved å rekruttere makrofager, endre metalloproteinase 9 uttrykk og aktivering av VEGF-A signale [19]. For ytterligere å undersøke om TWIST1 er også som en viktig mediator i MACC1-indusert endotel-avhengig angiogenese i GC, identifiserte vi at uttrykket av TWIST1 ble betydelig økt i nærvær av MACC1. Videre tie TWIST1 sterkt undertrykt MACC1-mediert tube dannelse av HUVECs, noe som tyder på at TWIST1 er nødvendig for MACC1-mediert angiogenese av GC.
De mekanismene bak VEGF-A-indusert angiogenese av kreftceller i både grunnleggende og kliniske undersøkelser er intensivt undersøkt [35-37]. Det har blitt foreslått at VEGF-A fungerer som en bryter for å fremme angiogenese [38]. I samsvar med den viktige rollen til VEGF-A på angiogenese, den foreliggende undersøkelsen bekreftet at ekspresjon av VEGF-A og MVD, samt tumorvekst var signifikant økt i MACC1 overekspresjon GC-celler. Samlet er disse resultatene indikerer at VEGF-A signalveien er involvert i MACC1 /TWIST1-indusert endotel-avhengig angiogenese av GC.
Konklusjoner
I konklusjonen, vår studie gitt både klinisk og eksperimentelle bevis for funksjonen av MACC1 i endotelium-avhengig angiogenese av GC. Ektopisk uttrykk for MACC1 fremmet tumor spredning, betydelig oppregulert TWIST1 uttrykk in vivo, og indusert vaskulær tube-lignende formasjon in vitro. Disse funnene tyder på at MACC1 fremmer endotelet-avhengige angiogenese i GC av signalveien vist i figur 7. Forstå hvordan MACC1 er involvert i GC patogenesen vil være nyttig for å utvikle potensielle terapeutiske mål i forvaltningen av GC.
Oppsummering diagram av denne studien, MACC1 overekspresjon i magekreft (GC) aktiverer TWIST1 angiogenetic akse, noe som fører til oppregulering av VEGF-A, og letter angiogenese.
