Abstract
Dagens narkotika utviklingsarbeid på magekreft er rettet mot flere molekylære målene som driver veksten av denne svulst. Intra-tumor biomarkør heterogenitet imidlertid ofte observert i magekreft, kan føre til partisk utvalg av pasienter. MET, ATM, FGFR2, og HER2 ble profilert på mage kreft biopsiprøver. En innovativ patologisk Vurderingen ble utført gjennom scoring av individuelle biopsier mot hele biopsier fra en enkelt pasient for å aktivere heterogenitet evaluering. Etter dette ble det falske negative risiko for hver biomarkør anslått
i silico
. 166 magekrefttilfeller med flere biopsier fra enkeltpasienter ble samlet inn fra Shanghai Renji Hospital. Etter pre-set kriterier, 56 ~ 78% tilfeller viste lav, 15 ~ 35% viste medium og 0 ~ 11% viste høy heterogenitet innenfor biomarkører profilerte. Hvis 3 biopsier ble samlet fra en enkelt pasient, den falske negative risiko for påvisning av biomarkører var nær 5% (unntak for FGFR2: 12,2%). Når 6 biopsier ble samlet, den falske negative risikoen nærmet 0%. Vår studie viser fordelen av flere biopsi prøvetaking når de vurderer personlig helsetjenester biomarkør strategi, og gir et eksempel for å møte utfordringen med intra-tumor biomarkør heterogenitet ved hjelp av alternativ patologisk vurdering og statistiske metoder
Citation. Ye P, Zhang M, Fan S, Zhang T, Fu H, Su X, et al. (2015) Intra-tumor heterogenitet av HER2, FGFR2, cMET og ATM i Gastric Cancer: Optimalisere Personlig Health gjennom nyskapende Patologisk og statistisk analyse. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10,1371 /journal.pone.0143207
Redaktør: Daniele Generali, Instituti Ospitalieri di Cremona, Italia
mottatt: 30 juli 2015; Godkjent: 02.11.2015; Publisert: 20.11.2015
Copyright: © 2015 Ye et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Astrazeneca har sponset denne studien. Den Funder gitt støtte i form av lønn for forfattere [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG og XY] og gitt anlegget og ressurser for å ferdigstille denne studien. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i «forfatterens bidrag» -delen
Konkurrerende interesser:. Forfattere tilknyttet Astrazeneca er heltidsansatte og /eller interessenter Astrazeneca. Denne studien ble sponset av Astrazeneca. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne hevder at de ikke har andre konkurrerende interesser.
Innledning
Magekreft (GC) er en av de vanligste kreftformene i verden, med rundt halvparten av alle tilfeller forekommer i Øst-Asia (hovedsakelig Kina), og er den tredje ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Selv om forekomsten er avtagende, de fleste GC tilfeller diagnostisert på et avansert stadium og prognose av sykdommen forblir fattige [2]. Median overlevelse for metastatisk GC er mindre enn ett år, mens den samlede fem års overlevelse er mindre enn 7% [3].
Intra-tumor heterogenitet er ofte observert i GC. På 1980-tallet, de Aretxabala
et al
evaluert 222 prøver fra 37 GC saker og fant en blanding av diploide og aneuploide prøver eller forskjellige aneuploide stemlines i samme sak (såkalt DNA innhold heterogenitet) i 33% av primær tumorer [4]. En lignende studie av Yonemura
et al
viste en 69% DNA innhold heterogenitet i 65 resected GC prøver [5]. Nylig, Yang
m.fl.
evaluert GC prøver fra 148 pasienter og fant en heterogenitet sats på 79,3% i human epitelial vekstfaktor-reseptor 2 (HER2) protein overekspresjon og 44% i
HER2
genamplifisering [6]. Følgelig er den høye intratumor heterogenitet observert i GC trolig bidra til behandlingsresistens og dårligere pasient prognose [7, 8], og til slutt representerer en betydelig uadressert problem møtt av klinikere, patologer og forskere.
flere molekylære mål for tiden har i enten godkjent medikamentell behandling eller lovende legemiddelgjennomgår klinisk utvikling i GC. HER2 spiller viktige roller i tumorgenese av brystkreft, eggstokk-kreft og magekreft [9] og trastuzumab, et monoklonalt antistoff mot HER2, er blitt godkjent for behandling av GC [10]. Den mesenchymale-epitelial overgang faktor (MET) genet koder for et protein som er den eneste kjente reseptor for hepatocytt vekstfaktor (HGF) ligand [11].
MET
genamplifisering og protein overekspresjon har vist seg å føre til konstant aktivering av MET signalveien som bidrar til tumor vekst, angiogenese og metastase [12]. Flere MET-hemmere er for tiden under GC kliniske studier, inkludert Savolitinib (fase 1 (NCT02252913) [13]) og AMG337 (fase 2 (NCT02016534)). Tilsvarende er fibroblast-vekstfaktor-reseptor-2 (FGFR2) også implisert i celleproliferasjon, differensiering og motilitet, og forsterkning av
FGFR2
-genet spiller en viktig rolle i tumorgenese av GC, for derved å understreke dens tiltrekning som legemiddelutvikling target [14-16]. Ataxia telangiectasia mutated (ATM) er en proteinkinase som tilhører den fosfatidylinositol-3′-kinase (PI3K) familien, og under normale forhold er aktivert i respons til DNA-dobbelttrådsbrudd i [17]. ATM mangel er relatert til en høy forekomst av vev maligniteter [18-20] og ATM-manglende tumorer cellene er sensitive for poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP) inhibering, et potensielt mål som er blitt foreslått for behandling av GC i flere tidligere studier [21-24]. Lynparza, den første amerikanske og europeiske-godkjent PARP hemmer målretting BRCA1 /2 mutant eggstokkreft, er for tiden gjennomgår en fase III klinisk studie i GC (NCT01924533) og ansette en pasient utvalg biomarkør tilnærming ved hjelp av ATM uttrykk ved IHC (publisering i pressen) .
i dagens æra av molekylært målrettet legemiddelutvikling, er biomarkører forventes å nøyaktig forutsi klinisk respons [25]. Høy tumor heterogenitet kan imidlertid føre til en biomarkør deteksjons forspenning hvis prøvene oppnådd fra en liten tumor region snarere enn hele tumorvevet (f.eks kirurgisk resekterte prøver er vanligvis 2 cm x 2 cm only). I kontrast er biopsiprøver vanligvis hentet fra ulike regioner i hele svulsten og vil sannsynligvis være mer representative for pasientenes generelle biomarkør uttrykk status, å argumentere for sitt potensial for å redusere virkningen av intra-tumor heterogenitet på pasientens valg bias.
i vår studie, for bedre å kunne vurdere intra-tumor heterogenitet, ansatt vi kirurgisk biopsi som vår svulst prøvetakingsstrategi. I tillegg utførte vi en innovativ patologisk vurdering gjennom scoring av individuelle biopsier mot hele biopsier fra enkeltpasienter. Heri vi også anvendt statistiske metoder for å estimere de falske negative deteksjons risikoene ved analyse av begrensede antall biopsier for å forstå forholdet mellom antall biopsier og risikoen for å velge en falsk positiv pasient for en spesiell behandling eller inkludering i en klinisk studie .
Materialer og metoder
Pasientinformasjon
Archived GC biopsiprøver ble samlet inn fra 166 pasienter som fikk gastroskopi undersøkelse med flere biopsier fra ulike kreft områder av hver pasient mellom 2007 og 2014 Renji sykehus, Shanghai, Kina. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studieprotokollen ble godkjent av Renji Hospital Institutional Review Board. Alle prøver ble gjennomgått av to utdannede patologer for GC diagnose og førti prøver ble ekskludert i studien på grunn av dårlig vev kvalitet.
immunhistokjemi (IHC)
Formalin faste og parafin innebygd (FFPE) prøver ble seksjonert i 4 um tykkelse. For MET farging, ble en kanin monoklonalt anti-total MET antistoff (cMET SP44, Ventana Medical Systems, AZ, USA) brukt og analysen ble utført på en automatisk Stainer (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA). ATM farging ble utført ved hjelp av en kanin monoklonalt anti-ATM antistoff (ab32420, Abcam, MA, USA) på en Autostainer (Thermo Scientific, MA, USA). HER2 farging ble utført ved hjelp av HercepTest kit (DAKO, Danmark) i henhold til produsentens instruksjoner på en automatisk Stainer (Discovery XT, Ventana Medical Systems, AZ, USA).
Fluorescens in situ hybridisering (FISH)
Den dual-farge FISH analysen ble utført som tidligere beskrevet [26].
HER2 /CEP17
prober ble kjøpt fra Vysis (IL, USA;. Cat # 30-171060).
MET Hotell og
FGFR2
prober ble utarbeidet av merking BAC (CTD-2270N20 og RP11-62L18, henholdsvis) DNA med Red-dUTP (Enzo Biochem, NY, USA;. Cat # 02N23- 050),
CEP10
-Spectrum Grønn og
CEP7
-Spectrum grønne prober ble kjøpt fra Vysis (Kat. nr 32-112010 og # 32-132007, henholdsvis) og brukes som interne kontroller for
FGFR2 Hotell og
MET
sonder
patologi vurdering på biopsier
Basert på H . E farging, hver biopsi med tilstrekkelig tumorceller (mer enn 50 tumorceller) ble først markert av en patolog. Deretter biomarkør status inkludert IHC og FISH farging av MET, ATM, FGFR2 og HER2 ble evaluert på hver biopsi. Individuelle score for hver biomarkør ble gitt til hver biopsi (fig 1).
Dette er et eksempel sak som viser den enkelte poengsum gitt til hver biopsi for hver biomarkør. I tillegg viser figuren også heterogenitet av biomarkør status mellom ulike biopsier i samme sak.
Ifølge MetMab rettssak i GC (NCT01662869), for MET IHC flekker, en biopsi viser IHC 3+ er definert som positiv; for MET FISH, biopsi viser
MET
genet gjennomsnittlig eksemplar antall ≥ 5 er definert som positiv. Siden den pågående rettssaken for en annen MET inhibitor, AZD6094 (NCT02449551), bruker
MET
genet gjennomsnittlig eksemplar antall ≥ 4 som avskåret for monoterapi behandlingsgruppen på GC pasienter, vi videre delt MET FISH negative gruppen i to undergrupper (
MET
genet gjennomsnittlig eksemplar antall ≥ 4 og 5, og
MET
genet gjennomsnittlig eksemplar nummer 4). For ATM IHC farging, biopsi viser IHC 0 er definert som negativ ifølge Olaparib studie (NCT01063517). For FGFR2 FISH, biopsi viser
FGFR2
genamplifisering (gjennomsnittlig eksemplar antall ≥ 6) er definert som positiv i henhold til utprøving av AZD4547 (NCT01457846) og dovitinib (NCT01719549). For HER2, biopsi viser HER2 IHC 3+ eller HER2 IHC 2+ pluss
HER2
genamplifisering er definert som positiv i henhold til toga studie (NCT01041404).
For MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH og HER2, tilfeller med
alle
av biopsier viser positive er definert som positive saker. For ATM IHC flekker, er tilfeller med alle biopsier viser negativt definert som negative tilfeller
Heterogenitet graders vurdering
Etter patolog gjennomgang, graden av biomarkør heterogenitet ble bestemt i henhold til følgende kriterier:.
Høy heterogenitet: 25% av biopsier med MET IHC 3+,
MET
genamplifisering, ATM IHC 0,
FGFR2
genamplifisering eller HER2 positivitet
Medium heterogenitet. 25% ~ 50% av biopsier med MET IHC 3+,
MET
genamplifisering, ATM IHC 0,
FGFR2
genamplifisering eller HER2 positivitet
lav heterogenitet. ≥50% biopsier med MET IHC 3+,
MET
genamplifisering, ATM IHC 0,
FGFR2
genamplifisering eller HER2 positivitet.
For MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH og HER2 positivitet, gjennomsnitts prosenter av positive biopsier i et enkelt tilfelle blant de positive sakene ble beregnet. For ATM IHC den gjennomsnittlige andelen av ATM IHC negative biopsier i det enkelte tilfelle blant tilfeller med minst én ATM negativ biopsi ble beregnet. De 95% konfidensintervall av de ovennevnte gjennomsnittsverdiene ble vurdert av bootstrapping.
Falsk negativ deteksjon risikovurdering
For hver biomarkør og et forhåndsdefinert antall biopsier
n plakater (0 maksimalt antall biopsier fra et utvalg), alle mulige scenarier for å velge
n
biopsier fra hver prøve og gjøre en bestemmelse av biomarkør status for prøven, basert på
n
valgt biopsier ble generert beregnings.
Basert på scenariene foreskrives ovenfor, risikoen for falske negative deteksjon ble vurdert. For MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH, og HER2 positivitet, risikoen for falske negative deteksjon med
n
biopsier fra hver prøve ble definert som forventet antall forholdet mellom antall positive prøver som har negativ gjenkjenning resultater med
n
biopsier og det totale antallet positive prøver. For ATM IHC, den falske negative oppdagelsesrisiko med
n
biopsier fra hver prøve ble definert som den forventede verdien av forholdet mellom antall ikke-negative prøver med alle negative biopsier med
n
biopsier fra hver prøve, og det totale antall ATM ikke-negative prøver.
Alle beregningene var nøyaktig bortsett fra ATM IHC med en biopsi fra hver prøve på grunn av det ekstremt store antall av mulige scenarier. For ATM IHC med en biopsi fra hver prøve, ble risikoen for falske negative påvisning estimeres ved å ta en tilfeldig subsett av 30 ikke-negative prøver uten erstatning av gangen, beregning av risikoen for falske negative deteksjon i delsettet, å gjenta prosessen 22000 tider og tar et gjennomsnitt av risikoen for falske negative deteksjon fra 22.000 tilfeldige undergrupper. I tillegg ble 95% konfidensintervall av dette estimert risiko rapportert.
Resultater
Oversikt over GC biopsi tallene i kliniske prøver
I denne årsklasse, antall biopsi prøver fra en enkelt pasient varierte fra 1 til 9, med median på både totalt og positive biopsier (med tumorceller) på 4. de positive biopsi tallene var litt mindre enn den totale biopsi tall. Saker med 3 ~ 4 og 5 ~ 6 positive biopsier stod for 47% og 25% henholdsvis av alle prøver samlet (fig 2).
(A) Fordeling av total og positiv biopsi nummer. I denne kinesiske GC årsklasse, totalt biopsi tall fra 1 til 9, med en median på 4. Positiv biopsi (biopsi med tumor) er noe lavere enn total biopsi nummer. (B) Fordeling av positiv biopsi tall. Flertallet av biopsi tallene faller i 3 ~ 4 (47%) og 5 ~ 6 (25%).
Heterogenitet grad og falsk negativ vurdering
I de 18 MET IHC positive saker (fig 3A), 61% av tilfellene viste lav heterogenitet, mens 33% viste medium og 5,5% viste høy heterogenitet. Gjennomsnittlig andel av MET positive biopsier i det enkelte tilfelle blant de 18 positive tilfeller var 65,78% (95% CI: 52,14% -79,60%). The MET falske negative oppklaringsprosenten ble anslått til rundt 3,39% med 4 biopsier og nærmet 0% når prøvetaking 6 biopsier (fig 4a).
heterogenitet distribusjon av MET protein uttrykk (A),
MET
gjennomsnittlig genkopitallet (B), ATM-proteinet uttrykket (C),
FGFR2
forsterkning (D), og HER2 positivitet (E). AMP: forsterkning. AVG. Gjennomsnittlig eksemplar antall
Risikoen for falsk negativ deteksjon sammen med ulike biopsi tall i MET IHC (A), MET FISH (B), ATM IHC (C), FGFR2 FISH (D) og HER2 (E). Merk: * Beregnet ved resampling, 95% KI:. 7,5% -20,94%
I de 13 MET FISH positive tilfeller (figur 3B), 77% av tilfellene viste lav heterogenitet, mens 15% viste middels og 8% viste høy heterogenitet. Gjennomsnittlig andel av MET FISH positive biopsier i det enkelte tilfelle blant de 13 positive tilfeller var 74,05% (95% CI: 57,53% -89,10%). The MET FISH falsk negativ oppklaringsprosenten ble anslått til rundt 3,30% med 4 biopsier og nærmet 0% når prøvetaking 7 biopsier (fig 4B). I tillegg ble signifikant korrelasjon funnet mellom MET IHC score og resultater MET fisk (p 0,01, κ = 0,62, Fishers eksakte test)
I de 58 tilfellene med minst én ATM negativ biopsi (Fig 3C) 62% av tilfellene viste lav heterogenitet, mens 35% viste medium og 3,6% viste høy heterogenitet. Gjennomsnittlig andel av ATM IHC negative biopsier i det enkelte tilfelle blant de 58 tilfellene var 63,07% (95% CI: 54,93% -71,39%). Minibanken IHC falsk negativ oppklaringsprosenten ble anslått til rundt 0,19% med 4 biopsier, og nærmet seg 0% med 5 biopsier (fig 4C).
I de ni FGFR2 FISH positive tilfeller, 56% av tilfellene viste lav heterogenitet, mens 33% viste medium og 11% viste høy heterogenitet (fig 3D). Gjennomsnittlig andel av FGFR2 FISH positive biopsier i det enkelte tilfelle blant de 9 positive tilfeller var 56,30% (95% CI: 36,85% -76,85%). Den FGFR2 FISH falsk negativ oppklaringsprosenten ble anslått til rundt 3,70% med 4 biopsier og nærmet 0% med 6 biopsier (fig 4D).
I de 32 HER2 positive tilfeller, 78% av tilfellene viste lave heterogenitet, mens 22% viste medium heterogenitet og ingen av tilfellene viste høy heterogenitet (fig 3E). Gjennomsnittlig andel av HER2 positive biopsier i det enkelte tilfelle blant de 32 positive tilfeller var 75,16% (95% CI: 65,88% -85,11%). HER2 falske negative oppklaringsprosenten ble anslått til rundt 0,21% med 4 biopsier og nærmet 0% med 5 biopsier (fig 4E).
Diskusjoner
Intra-tumor biomarkør heterogenitet har lenge vært et problem i utvelgelsen av pasienter til kliniske studier, og derfor, forstå svulst heterogenitet er avgjørende for vellykket implementering av en personlig helse biomarkør (PHB) strategi. Imidlertid få studier har hittil løst dette problem, og det er ikke standardisert strategi for å måle graden av tumor heterogenitet. I denne studien tok vi en ny fremgangsmåte ved å utføre enkelte biopsi og beregning av nivået av heterogeniteten i hvert enkelt tilfelle. Våre resultater viste at høye nivåer av heterogenitet ble bare funnet i 0 ~ 11% av den positive (eller negative for ATM) saker, mens de fleste positive tilfeller (56% ~ 78%) viste lav heterogenitet, noe som indikerer et relativt lavt nivå av heterogenitet for våre utvalgte biomarkører i denne kohort av GC tilfeller.
i tillegg har vi også utført falske negative vurderinger for hver biomarkør for å estimere de falske negative priser assosiert med innsamling av ulike antall biopsier. Resultatene viste at når 3 eller flere biopsier ble samlet, de falske negative risikoen var nær 5% for alle testede biomarkører (7,14%, 5,16%, 0,86% og 1,41% for henholdsvis MET IHC, MET FISH, ATM IHC, og HER2 ). Dette nummeret (3-4 biopsier) tilsvarer omtrent gjennomsnittlig antall biopsier samlet i klinisk praksis for denne gruppen, og som sådan, indikerer relativt lav falsk negativ risiko forbundet med disse biomarkører i vår kohort. Et unntak at FGFR2 FISH viste en høyere feilaktig negative klassifiseringen (12,2% feilaktig negative klassifiseringen til 3 biopsier), kan være på grunn av den begrensede FGFR2-positive prøvestørrelse (9 positive prøver). Når totalt 6 biopsier ble samlet inn fra en enkelt pasient, den falske negative risiko for MET, ATM, FGFR2 og HER2 nærmet 0% i denne gruppen. Disse resultatene gir et eksempel på hvordan øke biopsi tall kan brukes til å løse utfordringen med biomarkør heterogenitet i distribusjon av kliniske pasientvalg tilnærminger.
Med tanke på viktigheten av nøyaktig pasientutvelgelse i kliniske studier, har vi bestemt mener at tilstrekkelig adressering biomarkør heterogenitet er avgjørende for å lykkes. For eksempel, MetMab viste en signifikant forbedring i både progresjon overlevelse (2,9 vs. 1,5 måneder) og total overlevelse (12,6 vs. 3,8 måneder) [27] i en fase 2 studie (NCT01590719) men, denne forbedringen har ikke lykkes å overføre til fase 3-innstillingen (NCT01662869). Spesielt ble MET protein overekspresjon (ved IHC) valgt som en pasient utvalgskriteriene [28]. Selv om det fortsatt er et problem for debatt, er det mulig at løftet om MetMab i fase 2, men det er svikt i fase 3 var i hvert fall delvis en konsekvens av svulst heterogenitet, og en manglende evne til pasienten utvalget strategi (IHC) til robust løse utfordringen med intra-tumor heterogenitet i GC.
til slutt, vi har også sammenliknet positivitet rate (eller negativitet sats for ATM) av biomarkører oppdaget i denne kohort av biopsiprøver med kirurgiske prøver fra våre tidligere studier ( tabell 1). Med unntak av ATM, ble både biopsi og kirurgiske prøver oppsamlet fra det samme lokale sykehus. Resultatene viste at selv om positivitet priser er høyere (for ATM, negativitet prisene er lavere) i biopsiprøver, det samlede resultatet i biopsiprøver var lik kirurgiske prøver. Denne økningen i positivitet sats (eller nedgang i negativitet sats for ATM) er trolig forklares med påvisning av positive tilfeller bruker flere biopsier som var savnet ved hjelp av tidligere utvalgsstrategier (ie. Kirurgiske reseksjoner).
Det positive /negative rate for hver biomarkør er sammenlignbar mellom de biopsiprøver i denne studien og kirurgiske prøver profilerte i våre tidligere studier, inkludert ATM [29] og andre biomarkører [26]. En svak økning i positive satser for biomarkører (eller nedgang i negativ rente for ATM) ble observert, noe som muligens kan forklares ved påvisning av positive prøver som tidligere var savnet ved analyse av kirurgiske prøver på grunn av intra-tumor heterogenitet. Begge biopsi og kirurgiske prøver ble samlet fra samme lokale sykehuset [26], bortsett ATM [29].
Til sammen denne studien har adressert utfordringen med svulst heterogenitet fra en innovativ vinkel ved hjelp biopsier som svulsten sampling tilnærming og gi individuelle biomarkør score til hver biopsi. Våre resultater viser et relativt lavt nivå av heterogenitet på tvers av biomarkører som analyseres i denne kohorten. Likevel kan graden av heterogenitet innen andre pasient kohorter være annerledes og bør analyseres fra sak til sak. Videre er resultatene viste en reduksjon i frekvensen av falske negative deteksjon korresponderer med en økning i biopsi nummer for alle biomarkører som ble testet her, demonstrerer fordelen av flere biopsiprøver og tjener som et eksempel på adressering intra-tumoral heterogenitet ved hjelp av statistiske metoder.
takk
Vi takker Astrazeneca for å sponse denne studien.
