Abstract
Bakgrunn
microRNAs (mirnas) funksjon som endogene regulatorer av biologiske atferd av kreft hos mennesker. Flere naturlige ikke-kodende RNA er rapportert å hemme mirnas med base-paring interaksjoner. Disse fenomenene reiser spørsmål om muligheten for kunstig enhet for å regulere miRNAs. Hensikten med denne studien er å lage syntetiske enheter som er rettet mot en enkelt miRNA eller en miRNA klynge og for å fastslå deres terapeutiske effekter på fenotyper av blæren kreftceller.
metodikk /hovedfunnene
Tandem bulged miRNA bindingsseter ble satt inn i 3 «ikke-translatert område (UTR) av SV-40 promoter-drevet Renilla luciferase genet for å bygge to «miRNA Gressklippere» for undertrykkelse av MIR-183-96-182 klynge eller MIR-210. En tredje enhet med tandem repeterte sekvenser ikke komplementære til noen kjente miRNA ble generert som en vilkårlige kontroll. I funksjonelle analyser, ble blærekreft T24 og UM-UC-3 celler transfektert med hver av de tre enheter, fulgt av analyser for påvisning av deres virkninger. Luciferasepreparater analyser indikerte at aktivitetene til luciferase journalister i miRNA Gressklippere ble redusert til 30-50% av den vilkårlige kontroll. Ved hjelp av Real-Time qPCR, uttrykket nivåer av målet mirnas ble vist til å bli redusert til 2-3 ganger av den tilsvarende miRNA-klipperen. Cellevekst, apoptose, og migrering ble testet ved MTT-analysen, flow cytometri-analyse, og in vitro assay bunnen, respektivt. Hemming av cellevekst, økt apoptose, og redusert bevegelighet ble observert i miRNA Gressklippere-transfekterte blære kreftceller.
Konklusjon /Betydning
Ikke bare et enkelt mål miRNA men også hele medlemmene av en målet miRNA klynge kan blokkeres ved hjelp av denne modulære designstrategi. Anti-kreft-effekter induseres av de syntetiske miRNA Gressklippere i blærecancercellelinjer. MIR-183/96/182 klynge og MIR-210 er vist å spille onkogene roller i blærekreft. En potensielt nyttig syntetisk biologi plattform for miRNA tap-av-funksjon studier og kreftbehandling er etablert i dette arbeidet
Citation. Liu Y, Han Y, Zhang H, Nie L, Jiang Z, Fa P, et al. (2012) Syntetisk miRNA-Gressklippere Targeting MIR-183-96-182 Cluster eller MIR-210 hindre vekst og migrasjon og indusere apoptose i blæren kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e52280. doi: 10,1371 /journal.pone.0052280
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 31 august 2012; Godkjent: 12 november 2012; Publisert: 17.12.2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Ph.D. Foundation of Ministry of Education of China (20100001110100 til ZC) programmer; fremming Program for Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Folkerepublikken Kina (CXB201005250016A til ZC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transitional celle carcinoma av blæren er den vanligste urinveiskreft i østlige og vestlige land [1]. Flertallet av blære kreft er lav grad av ikke-invasive svulster som kan utvikle seg til invasiv fenotype. I motsetning til ikke-invasiv blærekreft, muskel-invasiv svulster har en tendens til å spre seg til andre organer, og har en svært dårlig prognose [2] – [3]. De mest vanlige behandlinger for blærekreft er kirurgi, kjemoterapi, immunterapi og strålebehandling. Men de er langt fra tilfredsstillende på grunn av flere faktorer, deriblant mangel på effektivitet, fravær av spesifisitet, og full av ubehagelige bivirkninger [4] – [5]. Så det er et økende behov for å utvikle nye måter å behandle kreft. Flere nye antineoplastiske midler er for tiden under eksperimentelt og klinisk undersøkelse, men ingen store gjennombrudd er blitt oppnådd med disse terapeutiske strategier [6].
Det har lenge vært foreslått at kreftceller kan omprogrammeres ved sammensetting av forskjellige DNA eller RNA deler inn i nye anordninger for å gi opphav til en godartet biologisk oppførsel [7] – [8]. Syntetisk biologi behandling med flere enheter rettet mot kreftspesifikke genet trasé åpner lovende nye veier for å bedre kreftbehandling [9]. På grunnlag av en detaljert forståelse av de genetiske profiler av kreft, syntetiske biologer forsøke å fremstille forutsigbare og robuste biologiske enheter med nye behandlings funksjoner som ikke finnes i naturen. Selv om dette feltet er relativt nytt og er fortsatt i laboratoriet testfasen, har noen av de relaterte arbeider allerede vist stort potensiale i behandling av ulike typer kreft [10] -. [11]
microRNAs (mirnas ), en klasse av korte endogene RNA, regulere genekspresjon ved å binde seg til delvis komplementære sekvenser i 3’UTR av mRNA [12]. Tallrike studier har rapportert at mirnas er involvert i utvikling og progresjon av kreft hos mennesker, inkludert vekst, apoptose, invasjon og metastasering [13] – [14]. I vårt tidligere arbeid bestemmes vi genom miRNA profiler i human blærekreft ved dyp sekvensering. MIR-183-96-182 klynge og MIR-210 ble funnet å være oppregulert i human blærekreft, noe som tyder på at de kan spille viktige roller som onkogener i denne kreft [15].
En av de store målene for vårt syntetisk biologi forskning er å koble syntetiske genetiske enheter for kontroll av en svulst celle fenotype. I denne artikkelen presenterer vi to nyttige genetiske enheter-Mir-183-96-182-cluster-klipperen (miRM-183/96/182) og Mir-210-klipperen (miRM-210) -Det målet miRNAs med delvis komplementære sekvenser. Vi har også undersøkt deres terapeutiske effekter på fenotyper av blæren kreftceller. Denne tilnærmingen gir et potensielt nyttig syntetisk biologi plattform for miRNA tap-av-funksjon studier og kreftbehandling.
Resultater
Design og bygging av miRNA Gressklippere
Inspirert av observasjonene at noen RNA-molekyler uttrykt fra
Herpesvirus saimiri
eller de menneskelige pseudo regulere de endogene mirnas av base sammenkobling interaksjoner i pattedyrceller [16] – [18], har vi skapt miRNA Gressklippere inneholder bindingsseter delvis komplementære til mål-mirnas for miRNA tap-av-funksjon-studier med humane blærecancerceller (Fig. 1). For å danne en mer stabil interaksjon med miRNA, har vi utviklet flere bindingsseter av miRNA av interesse med en sentral bule ved spaltningssetene posisjoner av argonaute 2 [19]. Dette kravet er også basert på oppdagelsen av at delvis sammenkoblingen mellom mirnas og deres mål sekvenser er mer vanlig hos dyr enn i planter [12]. Bindingsstedene ble koblet sammen med «forbindelsesledd» (noen få nukleotider) med det formål å øke bindingen av miRNA-protein komplekser (miRNPs) til alle mulige bindingssetet, og øke miRNA knockdown effektivitet [20].
Vi konstruerte miRNA-gressklippere ved å sette inn flere miRNA bindingsseter inn i 3 «UTR av en Renilla luciferase genet. Hver konstruere under styring av en SV-40-promoteren ble avsluttet med et SV40 polyadenyleringssignal. En uregulert TK promoter-drevet gen som koder for ildflueluciferase ble anvendt som en kontroll. De svarte firkantene representert linkerne mellom bindingssteder.
Vi har gjort 6 dobbelt arrangerte kopier av bindingssteder for MIR-183-96-182 cluster (2 eksemplarer for hver miRNA av klyngen) . Den miRM-183/96/182 ble deretter konstruert ved innsetting av disse bindingssetene til 3′-UTR av en SV-40-promoteren-drevet luciferase reporter-genet i den siCHECKTM-2-vektor (Promega, Madison, WI, USA). For å demonstrere den modulære enhetene, vi satt inn ytterligere 6 dobbelt arrangerte kopier av bindingsseter for MIR-210 inn i det 3′-UTR av reportergen for å generere miRM-210 ved å bruke den samme vektoren. Som en vilkårlige kontroll, laget vi også en enhet med seks tandem repeterte sekvenser ikke komplementære til noen kjente miRNAs. Sekvensene brukt i denne studien var tilgjengelige i tabell S1 og Tabell S2.
Redusert aktiviteter luciferasepreparater journalister i miRNA-gressklippere kan bidra til miRNA bindingssteder
For å teste effekten av miRNA- gressklippere, analysert vi Renilla luciferase aktivitet i forhold til ildflue luciferase aktivitet i T24 eller UM-UC-3 celler 48 timer etter transfeksjon med hver enhet. Luciferase reporter analyser viste at virksomheten til reporterne som inneholder bulged miRNA bindingssteder ble redusert i blæren kreftceller, sammenlignet med ikke-målrettede-kontroll (P 0,01 for hver gruppe). Hemninger (%) av luciferase uttrykk ble vist i Tabell 1.
De miRNA Gressklippere oppnådd effektiv bekjempelse av mål miRNA nivåer i blærekreftcellelinjer
For ytterligere å undersøke funksjonaliteten av miRNA-gressklippere, undersøkte vi de relative uttrykk nivåer av målet mirnas i enhets-transfekterte human blærekreft T24 og UM-UC-3 celler. QPCR Resultatene viste at ekspresjon av det tilsvarende miRNA-gressklipper induserte en dramatisk reduksjon i ekspresjonsnivåene av målet mirnas i de to blærecancercellelinjer (P 0,05 for hver gruppe). Hemninger (%) av miRNA uttrykk ble vist i tabell 2. uttrykk nivåer av MIR-96, MIR-182, og MIR-183 kan ikke undertrykkes av miRM-210. På samme tid, kan ekspresjonsnivået av MIR-210 også ikke endres ved miRM-183/96/182. Resultater av qPCR forsøket ble vist i tabell S3.
Hemming av cellevekst indusert av miRNA-klippere i blærekreftcellelinjer
Menneske blære kreft cellelinjer T24 og UM- UC-3 ble transient transfektert med enhetene i 96-brønners plater. I begge blærecellelinjene, miRM-183/96/182 eller den miRM-210 reduserte MTT-reaktivitet (fig. 2). En slik observasjon kan enten indikere en celle vekststans eller celledød.
T24 og UM-UC-3 celler ble transfektert med enhetene i 96-brønners plater. Celleveksten ble målt ved MTT-assay ved forskjellige tidsintervaller. ANOVA ble anvendt for sammenlikning av kurver av cellevekst. (A) miRM-183/96/182 hemmet cellevekst i T24 celler (P 0,05). (B) miRM-183/96/182 hemmet cellevekst i UM-UC-3 celler (P 0,05). (C) miRM-210 hemmet cellevekst i T24 celler (P 0,01). (D) miRM-210 hemmet cellevekst i UM-UC-3 celler (P 0,01). Data var gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter; barer, SD.
Oppstart av celle apoptose indusert av miRNA Gressklippere i blærekreftcellelinjer
For å teste celledød, ble apoptose eksperimenter utført. Begge de to cellelinjer ble sådd ut i seks-brønns plater og transfektert med enheter. Vi gjennomførte apoptose analyser ved hjelp av en Annexin V-PE apoptose deteksjon kit for å avgjøre om de to typene av våre syntetiske miRNA Gressklippere indusere celle apoptose i blæren kreftceller. Resultatene er vist i fig. 3 viste at de apoptotiske celler (%) av T24 og UM-UC-3 cellelinjer transfektert med miRM-183/96/182 eller den miRM-210 var høyere enn de som er transfektert med den vilkårlige kontroll.
T24 og UM-UC-3-celler ble transfektert med enhetene i 6-brønners plater. Celle apoptose ble målt ved strømningscytometri ved 48 timer etter transfeksjon. (EN). Representative bilder av flowcytometri analyse i T24 celler. (B). Representative bilder av flowcytometri analyse i UM-UC-3 celler. (C). Celle apoptose-induksjon ble observert i miRM-183/96/182-transfekterte blærekreft T24 og UM-UC-3 celler ved hjelp av strømningscytometri-analyse. (D). Celle apoptose-induksjon ble observert i miRM-210-transfiserte blærekreft T24 og UM-UC-3 celler ved hjelp av strømningscytometri-analyse. Vi utførte hvert eksperiment minst tre ganger. Feil barer, SD. ** P 0,01, sammenlignet med ikke-målrettede-kontroll
Hemming av cellemigrasjon indusert av miRNA Gressklippere i blærekreftcellelinjer
Celler ble sådd i 12-brønnen. plater og transfektert med enhetene. Deretter undersøkte vi hvilken rolle hver enhet på tumorcellemigrasjon ved å utføre scratch analyser. Som vist på fig. 4, vandringsavstander av celler i gruppene transfektert med miRNA Gressklippere var signifikant lavere enn de i gruppene transfektert med den vilkårlige kontroll.
T24 og UM-UC-3 celler ble transfektert med anordningene i 12-brønners plater. Cellemigrering ble målt ved bunnen av analysen. (A) miRM-183/96/182 og miRM-210 hemmet celle migrasjon i T24 celler uavhengig. (B) miRM-183/96/182 og miRM-210 hemmet celle migrasjon i UM-UC-3 celler uavhengig. Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger, og et representativt bilde ble vist. Resultatene er vist i gjennomsnitt ± SD. ** P. 0,01, sammenlignet med ikke-målrettede-kontroll
Diskusjoner
Det er i stor grad erkjent at mirnas indusere mRNA degradering via sekvensspesifikke interaksjoner. Imidlertid har senere arbeider foreslått at hovedfunksjonen av enkelte miRNA-mRNA-interaksjoner er å blokkere miRNA, i motsetning til å undertrykke ekspresjon av målgener [12]. Flere eksperimentelle resultatene støtter denne nye oppfatning av miRNA regulering. I pattedyrceller, ble
PTENP1
pseudogen med konservert miRNA bindingsseter i sin 3’UTR vist seg å regulere
PTEN
uttrykk gjennom base paring interaksjon med miRNAs. Et lignende fenomen ble også oppdaget i
KRAS Hotell og dens pseudogen
KRAS1P product: [16] – [17]. Sekvens-spesifikk miRNA nedbrytning ble nylig observert i marmoset T-celler transformert med
Herpesvirus saimiri plakater (HVS). Viruset koder en liten ikke-kodende RNA-kalt HSUR1-som inneholder områder med omfattende komplementaritet i Mir-27a. Baseparing mellom MIR-27a og HSUR1 kan nedregulerer uttrykket nivåer av MIR-27a [18]. Basert på disse funnene, spekulerer vi at en naturlig liten RNA-molekylet kan opptre som en gressklipper for mirnas som binder seg til de spesifikke gjenkjenningsseter i sin nukleotidsekvens. Så det virker rimelig at kunstige miRNA regulatoriske enheter med sekvenser delvis komplementære til miRNA av interesse har også evnen til å hemme den tilsvarende endogen miRNA aktivitet og /eller uttrykk.
For å teste denne hypotesen, vi konstruert kunstige enheter som inneholder flere bulte miRNA bindingssteder og kalte dem «miRNA Gressklippere». Tydeligvis grunnen til å velge dette navnet for det syntetiske enheten er at den kan «klippe ned» miRNA uttrykk akkurat som en gressklipper. Anordningene var utformet for å være modulbasert, hvor tandem-bindingssetene kan bli endret av de andre. Deres ekspresjon ble drevet til høyt nivå ved de sterke SV-40 virus-promoter i humane blærecancerceller. Ved hjelp av to valideringsforsøk, vi viste at miRNA Gressklippere konstruert av oss var funksjonell. For det første, luciferase analyser bekreftet at aktiviteter av luciferase journalister i miRNA Gressklippere ble undertrykt i de to blæren kreftceller. Dernest ble Real-Time qPCR utføres for å detektere uttrykket nivåer av målet mirnas i blæren kreft celler transfektert med enhetene, og vi viste at mengder av disse mirnas ble redusert med tilsvarende miRNA-klipperen. Ifølge disse to funnene, konkluderer vi at miRNA-klippere funksjonelt hemme et enkelt mål miRNA eller blokkere en hel klynge av relaterte miRNAs.
Flere og flere studier har vist at mirnas ofte deregulert i mange typer kreft hos mennesker. Som de kritiske roller mirnas i kreft gradvis utforsket, har sine søknader som potensielle terapeutiske mål vakt stor interesse i å utvikle ny strategi for behandling av kreft [21] – [22]. Enten enkeltvis eller som en klynge, er ekspresjonsnivåene av MIR-96, MIR-182, og MIR-183 har vist seg å være oppregulert i flere kreftformer, inkludert prostatakreft, brystkreft, lungekreft, medulloblastom, blærekreft og etc. [23] – [27]. Lin et al. fant at MIR-96 indusert spredning og forankring uavhengig vekst av brystkreft cellelinjer [28]. Segura et al. funnet at MIR-182 overekspresjon fremmet migreringen av humane melanomceller in vitro og deres metastaser in vivo [29]. Sarver et al. funnet at MIR-183 fungerte som et onkogen ved å øke kreftceller migrasjon [30]. MIR-210 har dukket opp som en roman svulst biomarkør regulert av hypoksi. Den unike frø regionen MIR-210 skiller den fra alle de andre miRNAs. Uttrykk av MIR-210 var knyttet til tumorvekst, invasjon og dårlig pasient overlevelse [31]. Yang et al. oppdaget at MIR-210 nedregulering hemmet cellevekst og celle indusert apoptose i humane hepatomceller [32]. Fasanaro et al. oppdaget at anti-MIR-210 transfeksjon redusert cellemigrering, cellevekst hemmet og induserte apoptose [33]. Disse studiene gir bevis for de viktige rollene de fire selektive mirnas i patogenesen av kreft hos mennesker. Men deres effekter på fenotyper av blærekreft celler forblir stort sett ukjent.
I denne studien har vi vist at Mir-183-96-182 klynge eller MIR-210 undertrykkelse av den tilsvarende miRNA-klipperen ikke bare hemmet vekst og migrasjon, men også indusert apoptose i humane blærecancerceller. Hemmingen av cellevekst var på grunn av induksjon av celle-apoptose. Disse resultatene antydet at MIR-183/96/182 klynge og MIR-210 spiller viktige roller i reguleringen av biologiske atferd av blæren kreftceller.
Alle de observerte endringene i fenotype bør formidles av miRNA-regulerte gener . Det har blitt demonstrert i tidligere arbeid som knockdown av MIR-183/96/182 klynge resulterte i anriking av apoptose trasé og feilregulering av PI3K /AKT /mTOR vei [26]. Komponenter av PI3K /AKT /mTOR sti ble rapportert å være kritisk for tumorgenese, inkludert cellulær proliferasjon, vekst, overlevelse og mobilitet [34]. Det ble også rapport som viser at denne klyngen hemmet sink opptak via undertrykkelse av sink-tilhengere [23]. Sink er en inhibitor av HIF-1α i humane kreftformer som undertrykker viktige gener involvert i tumorprogresjon, slik som VEGF, MDR1 og BCL2 [35]. MIR-210 har vært kjent for å regulere hypoksi, noe som er viktig for kreftcelleoverlevelse og invasjon. Flere MIR-210 mål som påvirker cellevekst, apoptose, og migreringen har allerede blitt identifisert, slik som E2F transkripsjonsfaktor 3 (E2F3) [36], fibroblast-vekstfaktor-reseptor som en (FGFRL1) [37], homeobox A1 (HOXA1) [38], FLICE-assosiert stort protein (FLASH) /caspase-8-assosiert protein-2 (Casp8ap2) [39] og Efrin-A3 (EFNA3) [33]. Ytterligere analyser er nødvendig for å undersøke deres genetiske regulering i blærecancerceller.
Det skal også bemerkes at de to miRNA-gressklippere er ikke helt effektiv, fordi de har bare ført til marginale fenotypiske endringer i blærecancerceller . Det er flere faktorer som kan påvirke effektiviteten av enhetene. Funksjonen til en miRNA-gressklipper, avhenger ikke bare av antall miRNA bindingsseter, men også av mengden av klippe RNA i forhold til mengden av de endogene miRNAs. For å gi en mer effektiv behandling av kreft, kan flere punkter tas i betraktning. Tilsetning av mer miRNA bindingssetene til enhetene kan øke konsentrasjonen av de delvis komplementære sekvenser, og vil derfor øke den hemmende effekten av miRNA-gressklippere. For å uttrykke enhetene på et høyt nivå, kan man velge flere potensielle sterke arrangører for kjøring transkripsjon og bruke virale vektorer for å levere miRNA-gressklippere. Noen andre muligheter gjenstår å bli vist.
I sammendraget, anti-vekst effekter mediert av apoptose og anti-migrasjon effekter både indusert av de syntetiske miRNA Gressklippere rettet mot Mir-183-96-182 klynge eller speil 210 i blærekreftceller. Ytterligere undersøkelser er fortsatt nødvendig å bevise nytten av vår syntetisk biologi plattformen i mirnas funksjoner studier og kreft behandlinger.
Materialer og metoder
Cellelinjer og cellekultur
Menneskelig blære overgangs~~POS=TRUNC cellelinjer T24 og UM-UC-3 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Begge ble opprettholdt i RPMI-1640 (1640) medier supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin sulfat). Celler ble rutinemessig dyrket ved 37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2.
Opprettelse av miRNA-gressklippere
bulte miRNA bindingssteder for Mir-96, speil 182, ble MIR-183, og MIR-210 og linkerne mellom dem utviklet og kjemisk syntetisert. Enten kombinasjonen DNA del for Mir-183-96-182 klynge inneholder 2 kopier av bindingssteder for hver klynge miRNA eller den spesifikke DNA del for MIR-210 inneholder 6 kopier av bindingssteder for MIR-210 ble klonet inn siCHECKTM-2 luciferase vektor (Promega, Madison, WI, USA) fordøyd med
Xhol Hotell og
Notl
. Som et ikke-målrettet-kontroll, en anordning med seks tandem gjentatte bindingsseter komplementære til noen kjente mirnas ble også konstruert ved anvendelse av de samme metodene som beskrevet ovenfor. Grundige beskrivelser av beslektede sekvenser ble presentert i Tabell S1 og S2 Tabell.
Cell transfeksjon
Celler ble platet tyve timer før transfeksjon for å oppnå 70-80% konfluens på tidspunktet for transfeksjon. 1 ug av hver enhet ble transfektert inn i cellene ved hjelp Hiperfect Transfeksjon Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoller.
Luciferase reporter analysen
Celler ble sådd i seks-brønns plater (5 × 10
5 /brønn) og transfektert med miRNA-klippere eller vilkårlige kontroll. Luciferase-aktivitet ble detektert ved å anvende den dobbelte luciferase-analysesystemet (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens instruksjoner ved 48 timer etter transfeksjon. Den Renilla luciferase aktiviteten ble normalisert til ildflue luciferase aktivitet. Inhiberingen (%) av luciferase-ekspresjon ble beregnet ved følgende formel: Inhibering (%) = (relativ luciferaseaktivitet i den ikke-målrettet kontroll – relativ luciferaseaktivitet i miRNA-klipperen) /relativ luciferaseaktivitet i den ikke-målrettet kontroll x 100 %. Forsøkene ble utført i duplikat og gjentas minst tre ganger.
RNA ekstraksjon og Real-Time qPCR
Totalt RNA ble isolert fra T24 celler og UM-UC-3 celler bruker TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble syntetisert ved bruk av M-MLV revers transkriptase (Promega, Madison, WI, USA). Real time PCR ble utført ved hjelp av All-in-One
TM miRNA QRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). U6 liten kjernefysiske RNA (snRNA) ble valgt som endogen kontroll. De miRNA qPCR Primere ble bestilt fra GeneCopoeia, Inc. Katalog antall All-in-One ™ miRNA qPCR Grunning var som følger: HSA-MIR-96~HmiRQP0852; HSA-MIR-182~HmiRQP0239; HSA-MIR-183~HmiRQP0244; har-MIR-210~HmiRQP0317; snRNA U6 ~ HmiRQP9001 (Selskapet ga ikke sekvensen av disse primere). PCR-blandinger ble fremstilt i henhold til produsentens protokoller med PCR-betingelser for 40 sykluser med 15 sek ved 95 ° C, 20 sek ved 55 ° C, og 30 sekunder ved 70 ° C på en ABI PRISM 7000 Fluorescerende Kvantitativ PCR System (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA). Den relative uttrykk for hver miRNA ble beregnet ved bruk av 2
-ΔΔCt metoder. Inhiberingen (%) av miRNA ekspresjon ble beregnet ved følgende formel: Inhibering (%) = (relativ miRNA ekspresjonsnivået i celler transfektert med de ikke-målrettede-kontroll – relativ miRNA ekspresjonsnivået i celler transfektert med miRNA-klipperen) /relativ miRNA ekspresjonsnivået i celler transfektert med den ikke-målrettet kontroll x 100%.
celle~~POS=TRUNC vekst~~POS=HEADCOMP assay
virkningene av de utformede enheter på celleformering ble undersøkt ved hjelp av MTT-analyse i henhold til de rapporterte metoder [40 ]. 24, 48 eller 72 timer etter transfeksjon, 20 ul MTT (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn i en 96-brønners plate, og cellene ble dyrket i 5 timer. Da de mellom blandinger MTT ble kassert og 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO) ble tilsatt til hver brønn. Absorbans ble målt ved en bølgelengde på 490 nm (med 630 nm som referansebølgelengde) ved anvendelse av en ELISA-mikroplateleser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Analyser ble gjentatt minst tre ganger.
celle apoptose assay
celle apoptose ble påvist ved anvendelse av et annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) /propidiumjodid (PI) apoptose deteksjon kit (BD, San Jose, CA, USA) i henhold til leverandørens protokoller. 48 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet opp, sentrifugert og resuspendert i 500 ul av 1 x bindingsbuffer. Annexin V-FITC (5 ul), og 10 ul PI ble deretter tilsatt til hvert rør. Rørene ble inkubert i mørke ved romtemperatur i 15 min. Celleapoptose Analysen ble utført umiddelbart på en flowcytometri (EPICS, XL-4, Beckman, CA, USA). Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger.
Cellemigrering assay
Cell motilitet ble undersøkt ved bunnen av analysen i henhold til de fremgangsmåter som tidligere er beskrevet [41]. Celler ble sådd ut i 12-brønns plater ved en densitet på 1,0 x 10
5 celler per brønn. Vi transfekterte celler med anordningene og inkubert rettene ved 37 ° C inntil cellene nådde 100% konfluens. En kunstig gap ble deretter generert ved å skrape med en pipette tips. Fotografiske bilder ble tatt fra hver brønn umiddelbart og igjen etter 20 timer med et digitalt kamera system. Programvaren HMIAS-2000 ble brukt til å beregne cellemigrasjon avstand (mikrometer). Hver Forsøket ble gjentatt minst tre ganger.
Statistiske analyser
Data fra alle forsøkene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av t-test eller ANOVA og P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske tester ble utført ved hjelp av SPSS versjon 17,0 programvare (SPSS, Chicago, IL, USA).
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
miRNA sekvenser i Study
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052280.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Syntetisk miRNA-Mower sekvenser i Vector
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052280.s002 plakater (DOC)
tabell S3.
Delt-Ct-verdier av Real-Time qPCR i begge blærekreftcellelinjer transfektert med de syntetiske enheter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0052280.s003 plakater (DOC)
Takk til
forfatterne står i gjeld til giverne, hvis navn ble ikke inkludert i forfatterlisten, men som deltok i dette programmet.
