Abstract
Kreftceller kommuniserer med omkringliggende stromale fibroblaster under tumorigenesis, men de komplekse molekylære reglene som styrer disse interaksjoner fortsatt dårlig forstått og dermed hindrer utvikling av terapeutiske strategier for å målrette kreft stroma. Vi har tatt en matematisk tilnærming til å begynne å definere disse reglene ved å utføre den første store kvantitativ analyse av fibroblast effekter på kreftcelle spredning over mer enn fire hundre heterotypic cellelinje motstandere. Systems-nivå modellering av dette komplekse datasettet ved hjelp singulærverdidekomposisjonen avdekket at normalt vev fibroblaster løst uttrykke minst to funksjonelt forskjellige aktiviteter, en som reflekterer transkripsjons programmer forbundet med aktiverte mesenchymale celler, som fungerer enten coordinately eller kryssende formål å modulere kreftcelle spredning. Disse funnene tyder på at kvantitative tilnærminger kan være nyttig for å identifisere organisatoriske prinsipper som styrer komplekse heterotypic celle-celle interaksjoner i kreft og andre sammenhenger
Citation. Wadlow RC, Wittner BS, Finley SA, Bergquist H, Upadhyay R, finn S, et al. (2009) Systems-nivå Modellering av kreft-fibroblast interaksjon. PLoS ONE 4 (9): e6888. doi: 10,1371 /journal.pone.0006888
Redaktør: Dov J. Stekel, University of Nottingham, Storbritannia
mottatt: 1 april 2009; Godkjent: 29 juli 2009; Publisert: 3. september 2009
Copyright: © 2009 Wadlow et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en HHMI Lege-forsker Early Career Award (SR) og en Sidney Kimmel translasjonell Science Award (SR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP kommuniserer dynamisk med omkringliggende stromale celler. Blant de mange relevante celletyper innen kreft stroma, fibroblaster ser ut til å fungere fremtredende [1]. Vi mangler imidlertid en klar forståelse av hvordan molekylær og cellulær heterogenitet innen denne celletypen funksjonelt bidrar til kreft initiering og progresjon [2]. Delvis er dette på grunn av de eksperimentelle utfordringene som ligger i å studere flercellede interaksjoner. Mens stadig mer sofistikerte dyremodeller blir brukt til å definere diskrete mekanismer som fibroblaster bidrar til tumorprogresjon, disse modellene er ikke godt egnet for systematisk funn på tvers av flere genetiske og epigenetiske sammenhenger [3] – [6]. En alternativ eksperimentell tilnærming involverer å analysere interaksjon av dissosierte kreftceller og fibroblaster in vitro [7] – [11]. Denne tilnærmingen har potensial til å muliggjøre systematisk og objektiv molekylær screening for nye stromal mål som senere kan validert i flere fysiologisk relevante systemer.
In vitro tilnærminger til å studere cellulære interaksjoner er generelt begrenset ved valg av spesifikke celler, dyrkingsbetingelser, og analyser. Det ideelle systemet ville undersøke funksjonelle samspillet mellom ulike primære kreft celle og fibroblast populasjoner co-avledet fra de samme svulster. Imidlertid primære humane kreftceller er notorisk vanskelige å forplante langvarig ex vivo, og primære tumor-avledet fibroblaster synes å gjennomgå fenotypiske endringer i korttidskultur [6]. I kontrast er etablerte cellelinjer lett dyrkes, relativt billig og lett tilgjengelig, og representerer således et potensielt nyttig og fornybar ressurs for å studere kreft-fibroblast interaksjon. I tillegg kan dyrkningsbetingelsene påvirke cellulær oppførsel, men stadig mer komplekse fremgangsmåter som forsøker å etterligne fysiologisk relevante betingelser, slik som tredimensjonal kultur, skalere dårlig [12]. Til slutt, fibroblaster påvirke mange aspekter av kreft celle atferd inkludert spredning og overlevelse, angiogenese, invasjon, metastaser, og stoffet motstand, men analyser å score stadig mer komplekse fenotyper kan være utfordrende å gjennomføre i systematiske studier.
Vi har derfor gjennomført en kvantitativ og integrert analyse ved hjelp av matematisk modellering av cancer celleproliferasjon i to-dimensjonale ko-kultur med et stort antall normale fibroblast cellelinjer. Disse studiene viste at normalt vev fibroblaster variabelt uttrykker minst to funksjonelt distinkte aktivitet ved modulering av kreftcellevekst. Videre transcriptional profilering av disse forskjellige fibroblast populasjoner viste at minst en av disse aktivitetene kan relateres til molekylære programmer som er til stede i aktivert mesenchyme. Systems-modellering kan derfor være nyttig for å identifisere organisatoriske prinsipper som grovt ligger til grunn interaksjoner av kreftceller og fibroblaster, og kan derfor informere systema molekylære studier av kreft-fibroblast interaksjon.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og plasmid DNA
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia) eller Coriell Cell Oppbevaringssteder (Camden, NJ). Alle fibroblast linjer ble brukt for co-kulturer innen 10 passasjer etter kjøpet. Kreft og fibroblast-cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt kalveserum (FCS), L-glutamin (4 mM), penicillin (100 enheter /ml), og streptomycin (100 ug /ml). EGFP merking av kreftcellelinjer ble gjort ved hjelp av en tredje generasjon lentiviral vektorsystem. 293T-celler ble transfektert ved å bruke lipofektamin 2000 i et subsammenflytende 10-cm skål med vektoren pCCLsin.PPT.hPGK (10 ug), inn i hvilken EGFP var blitt klonet, så vel som pMDLg /p emballasje (7 ug) og VSV-G konvolutt koding pMD.G (5 mikrogram) plasmider. Disse plasmider ble hentet fra Rafaella Sordella på MGH senter for kreftforskning og Luigi Naldini på San Raffaele TV-aksjonen Institutt for Gene Therapy. Viral supernatant ble samlet opp etter 48 timer, filtrert med et 0,45 mikron sprøytefilter, og lagret ved -80 ° C. Cancercellelinjer ble infisert i subsammenflytende brønner av 24-brønners plater ved bruk av 300 mL av virus i 1 ml DMEM kulturmedium med 10% føtalt kalveserum. Denne protokollen ga infeksjonsrater på over 80% (bestemt ved visuell vurdering med fluorescens mikroskopi). EGFP-negative celler ble fjernet ved hjelp av en modifisert 5-laser Becton-Dickinson FACSDiVa med standardteknikker som tidligere beskrevet [13].
Kvantitative co-kulturer
2 × 10
4 fibroblaster ble sådd ut i 100 pl i minst 6 replikate brønner i hver av to 96-brønners plater og tillatt å holde seg til et konfluent monolag over natten. Deretter 10
3 EGFP-uttrykkende kreftceller ble sådd i ytterligere 50 mL inn i fibroblast inneholder brønner og til tomme brønner (150 mL totalt volum per brønn). En Spectramax M5-plateavleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ble anvendt for å oppnå avlesninger fluorescerende omtrent en gang daglig i 14 dager (eksitasjon 477 nm, emisjon 515 nm). Tretti mikroliter av friskt medium ble tilsatt til hver brønn på dagene 3, 6, 9 og 12. Brønner inneholdende fibroblaster eller media alene, alle med 150 ul av medium per brønn på dag 0, ble målt i parallell og verdiene subtraheres fra co -Kultur og monokultur brønner, henholdsvis å gjøre rede for auto-fluorescens. Alle kulturer ble utført i DMEM med 10% FCS
Heterotypic xenografter:.
Estradiol pellets (0,72 mg, 60-dagers utslipp, nyskapende forskning of America, Sarasota, FL) ble implantert i hunn nakne mus (Charles River Laboratories) to dager før xenograft injeksjoner. Mus ble delt i 2 grupper: 5 mus ble injisert med AG09877 fibroblaster og EGFP-uttrykkende T47D brystcancerceller, og 5 mus ble injisert med AG04351 fibroblaster og EGFP-uttrykkende T47D-celler. Cellene ble trypsinisert og resuspendert i Hanks balanserte saltoppløsning med en konsentrasjon på 4 x 10
6 millioner celler per 100 mikroliter. Dyr bedøvet med isofluran ble injisert med 4 × 10
6 fibroblaster og 4 × 10
5 kreftceller inn i underhudsvevet over melkefettpute. EGFP signal ble fotografert og kvantifisert ved hjelp av et bonsai fluorescens optisk imaging system umiddelbart etter injeksjon, daglig i fire dager, og deretter hver 2-3 dager. Mus ble behandlet i samsvar med MGH Institutional Animal Care og bruk komité forskrifter og ofret 43 dager etter injeksjon. Svulstvev ble resected og flash frosset. Frysesnitt ble farget med hematoksylin og eosin eller med anti-cytokeratin (CAM 5.2, Becton Dickinson).
prosessdata
For å kvantifisere effekten av fibroblaster på veksten av kreftceller, vi definert mono-kultur kurve, å være forskjellen på dag
t
mellom gjennomsnittlig fluorescens måling for brønnene med kreftceller, men ingen fibroblaster og gjennomsnittlig fluorescens måling for brønnene med media alene. Vi definerte co-kultur kurve, å være forskjellen på dag
t
mellom gjennomsnittlig fluorescens måling for brønnene med kreftceller og fibroblaster og gjennomsnittlig fluorescens måling for brønnene med fibroblaster alene. Vi fjernet konstant signal ved å subtrahere den mindre dag 0-verdi. Spesielt vi la og la. Ko-kultur-forhold ble definert som forholdet mellom arealet under disse to kurver. Spesielt der
M
er arealet under kurven, la vi være de dagene som vi har målinger og interpolert lineært mellom måle ganger. Ved trapes regelen, etter
Vi definerte
C
samme måte å være det området under kurven. Vi definerte co-kultur-forhold,
E
ved
For å beregne konfidensintervall (CIS) for
E
, vi brukte foreningen av tre bootstrap BC
en tosidig 95% CIS, hver beregnet fra 10.000 bootstrap prøver [14]. Bootstrap prøvene er dannet ved først å velge med erstatning fra de to replikere 96-brønner plater og da velger med utskifting brønner av hver type (dvs. media-bare, fibroblast, mono-kultur, co-kultur) fra de valgte platene. Den co-kulturen forholdet ble betraktet som signifikant dersom 95% KI for
E
var helt over eller under en.
Matematisk modellering
Vi antok at et lite antall funksjonelt forskjellige interaksjonstypene ligger til grunn av det store antallet datapunkter i matrisen av co-kultur forholdstall. Vi har mistanke om at hvis vi kunne finne et optimalt antall,
N
, av enklere matriser med å tilnærme co-kultur forholdet matrise, så det optimale
N
ville gi oss en ide om antall funksjonelt forskjellige interaksjonstyper på jobb og matrisene som utgjør tilnærming kan gi oss et innblikk i naturen av disse interaksjonene.
en rekke metoder eksisterer for å dekomponere en matematisk matrise til en sum av enklere matriser som er i noen forstand ortogonale eller uavhengig av hverandre, [15]. Modeller basert på singulærverdidekomposisjonen (SVD) eller prinsipal komponent analyse (PCA) er mest utbredt over et bredt spekter av biologiske, kjemiske og fysiske vitenskaper [16]. Eksempler inkluderer dekonvolveringen av anatomisk eller patofysiologiske informasjon fra dynamisk kontrastforsterket MR og analyse av tredimensjonale kvantitative struktur-aktivitetsforhold for å forutsi aktiviteten av kandidat medikamenter [17] – [19]. Vi valgte SVD for vår analyse i løpet av PCA siden PCA første sentrene dataene ved å trekke rad eller kolonne midler. Imidlertid nullverdien av vårt matrise ble satt lik en AUC-forhold på 1, betegner fraværet av en effekt av ko-kultur på kreftcelleformering. Dermed å forskyve nullverdi ved å trekke midler ville ha ofret sin iboende mening.
nedbrytnings metoder er ofte kombinert med kryssvaliderings strategier for å skille meningsfulle komponenter fra statistisk støy [20]. Den kryssvalidering strategien vi valgte å bruke syssels EM algoritme for estimering av manglende data [21] som beskrevet nedenfor.
La
R
være matrisen av forskjeller mellom co-kultur forholdet matrise og en, slik at positive verdier av
R
tilsvarer co-kulturer som stimulerte kreftcelle spredning og negative verdier av
R
tilsvarer co-kulturer som hemmet kreft celle spredning. Vi ønsker å bestemme en optimal
N
for
R
. For å gjøre dette, bruker vi modeller kompleksiteten som øker med
N
å forutsi verdien av hvert element i
R
fra alle de andre elementene i
R Hotell og anser så optimal
N
som disse spådommene er maksimalt nøyaktig.
Spesielt for ethvert matrise
S
la betegne elementet av
S
i
i
th rad og
j
th kolonne la betegne
S
med innslag av
S
i
i
th rad og
j
th kolonne mangler og la være med det manglende elementet fylles ut av
x
. La vær tilnærming av
S
fått ved å legge best
N
matriser av entall verdi nedbryting av
S plakater (dvs. de tilsvarende
N
største enkeltverdier). I tilfelle av manglende data definerer vi av EM-algoritme for estimering av manglende data som følger. Letand la
I vår erfaring, dette EM algoritmen har alltid konvergert som
k
øker slik at vi kan la
Letand la være medianen av de over alt
i
og
j
.
N
som er minimal anses for å være den optimale
N
for
R
.
Gene expression profilering
Confluent plater av fibroblaster (replikere betingelsene for ko-kultur) eller kreftceller i log-fase vekst ble trypsinert, sentrifugert til pellets, og flash-frosset i flytende nitrogen. RNA ble isolert med Qiagen RNeasy kits og profilert bruker Affymetrix HG-U133 Plus 2,0 mikromatriser med standardprotokoller [22].
Resultater og Diskusjon
Vi først systematisk co-kultivert tolv menneskelige brystkreft, melanom og lungekreft cellelinjer med trettiseks ikke-transformerte, menneskelige fibroblast cellelinjer som stammer fra normal hud og lunge (se tabell S1 og Tabell S2 for detaljer). Hver kreftcellelinje ble merket med EGFP ved hjelp lentiviral transduksjon for å muliggjøre den sammensatte kvantifisering av kreftcellevekst og overlevelse over fjorten dager ved anvendelse av en enkel plateleser basert analysesystem. For hver cellelinje sammenkobling (n = 432), som vi har undersøkt i flere paralleller enn uavhengige eksperimenter, beregnet vi at forholdet mellom arealet under EGFP kurven for kreftceller dyrket i ko-kulturen, delt på arealet under kurven for kreftcellene dyrket alene (figur 1A). Vi fant ut at femtitre av 432 cellelinje motstandere (12%) var vekst-stimulerende i absolutte termer, definert av en 95% konfidensintervall med en nedre grense over en (figur 1B). I kontrast, 176 (41%) var vekst-hemmende og 203 (47%) var null. Disse dataene viser at bare et mindretall av heterotypic cellelinje motstandere gi økt kreftcellevekst.
A) Varme kart representasjon av eksperimentelt bestemt co-kultur forholdstall for 432 kreft fibroblast cellelinje interaksjoner. Red refererer til vekst-stimulerende interaksjoner og blå til vekstundertrykkende interaksjoner. B) Interaksjoner resulterer i statistisk signifikant vekst stimulering av kreftceller (dvs. den nedre grensen av 95% CI for co-kulturen forholdet er 1) er vist i rødt, og interaksjoner som resulterer i statistisk signifikant vekst hemming av kreftceller ( dvs. den øvre grense for 95% KI for co-kulturen forholdet er 1) er vist i blått. Sirkelen viser samspillet mellom T47D og AG04351, og plassen viser samspillet mellom T47D og AG09877.
For å utforske relevansen av disse co-kulturer i vivo, vi neste fokusert på to spesifikke kreft fibroblast motstandere som viste motstrid proliferative effekter in vitro. Nærmere bestemt, AG09877 stimulert proliferasjon T47D, mens AG04351 var vekst-inhibitorisk for denne samme kreftcellelinje. Ko-injeksjon av T47D-celler og fibroblaster AG09877 subkutant i nakne mus førte til dannelsen av små svulster i løpet av en uke (figur 2A og 2B). I motsetning til dette ble xenografting av disse kreftceller med AG04351 fibroblaster ikke resultere i tumordannelse. Disse resultatene bekreftet at motstridende effekter av ulike fibroblast populasjoner på kreftcellevekst in vitro kunne også observeres in vivo. T47D alene er svakt tumorigen (data ikke vist) [23], [24], og det faktum at de induserte tumorer tilbakegang permanent etter den første uken antydet at vekst-stimulerende effekt av AG09877 fibroblaster var generelt tilstrekkelig til å opprettholde den langvarige veksten av denne cellelinje in vivo. Spesielt, er imidlertid en dyr faktisk utviklet en vedvarende tumor i løpet av seks uker. Patologisk undersøkelse av dette enkelt svulst avslørte EGFP-positive kreftceller innebygd i en betydelig desmoplastic stromal komponent (Figur 2C). Selv om bare et enkelt eksperiment, det provoserende resultatet antydet at vekst-stimulerende fibroblaster som er identifisert i vitro kan være i stand til å utøve både forbigående og mer varig effekt på tumorigen tilstøtende kreftceller in vivo.
A) EGFP signal fra injeksjoner EGFP-uttrykk T47D celler med AG09877 fibroblaster (5 mus, blå kurve) eller AG04351 fibroblaster (4 mus, rød kurve). Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. B) Representative bilder av mus xenopodet med hver blanding tatt 3 dager etter injeksjon, med hvite piler som peker til injeksjonssteder. C) Mikrofotografier av en T47D-AG09877 svulst. Fra venstre til høyre:. Hematoxylin og eosin farging, GFP fluorescens, og immunhistokjemi for cytokeratin
siden forsøkte å identifisere organisatoriske prinsipper for matrise av co-kulturer som kan gi innsikt i de biologiske faktorer som bestemmer kreft-fibroblast interaksjon. Systematisk gjenskape den cellulære samspillet matrise ved hjelp heterotypic xenografter kanskje har tilbudt ytterligere innsikt i fysiologiske betydningen av individuelle motstandere, men var ikke mulig for 432 ulike interaksjoner. Vi brukte derfor et system-nivå tilnærming å karakterisere og vår modell in vitro data. Til å begynne med, flyktige inspeksjon av dataene i figur 1 viste at kreftcellelinjer som kan grupperes i de som var hovedsakelig inhibert (n = 3), i stor grad hemmet (n = 6), eller sterkt stimulert (n = 3) av fibroblaster Dette antyder at vekstrespons av en kreftcellelinje i et gitt stromal ko-kulturen ble forhåndsprogrammeres og uavhengig av den parede fibroblast-linje (for eksempel figur 3A). Det er imidlertid bare SKBR3 viste ensartede responser på tvers av alle fibroblast linjer, impliserer flere fibroblast-spesifikk bidrag til kreftcelle-proliferasjon. I flere tilfeller var tilstrekkelig til å overstyre den generelle predisposisjon for kreft cellelinje, som fører til en vekst stimulerende interaksjon med en ellers vekst-hemmet kreft cellelinje eller omvendt (f.eks figur 3B) fibroblast dette bidraget. Således er vekstrespons av cancercellelinjer til stromal ko-kulturen viste seg å resultere fra kombinasjonen av et dominerende kreftcelle bestemt innsats og en mindre, men ofte er kritisk viktig fibroblast virkning.
A) Den vekstrespons av kreft cellelinjer (sirkler) til fibroblaster (avlange former) bestemmes hovedsakelig av den forhåndsprogrammerte evnen av kreftceller til å spre svar på generiske fibroblast signaler (svarte piler) delte felles på tvers av alle fibroblast linjer. Noen kreftcellelinjer (grønn) er vekst stimulert, mens andre (gul) er ikke svarer eller vekst-hemmet. B) Andre signaler som produseres av undergrupper av fibroblaster (røde piler) legge kompleksiteten ved enten å ytterligere stimulere kreftcelle spredning (øverst til venstre panel) eller kompensere for manglende respons på generiske signaler (nedre venstre panel). Selv om alle signaler i denne skjematiske er definert som vekst-stimulerende, kan de også være vekst-inhiberende og dermed legge ytterligere kompleksitet.
Selv om figur 3B viser skjematisk en parsimonious to signal-modellen, totalt antall av interaksjon typer kunne ikke lett utledes gjennom kvalitativ undersøkelse av våre datasett. Vi brukte derfor matematisk modellering basert på singulærverdidekomposisjonen å spørre om komplekst mønster av vekst stimulering og hemming vi har observert over dette datasettet resulterte fra et lite, begrenset antall interaksjonstyper mellom kreftceller og fibroblaster. Rotne matrise av co-kultur forhold til en sum av
N
komponent matriser, vi brukte en leave-one-out kryssvalidering strategi for å definere den optimale verdien for
N plakater (figur 4 , se materialer og metoder for fullstendige opplysninger om modellen). Vi fant at median kryssvalideringsfeil nådde bunnivå med
N
= 3, noe som tyder på at netto co-kultur ratio for hver cellelinje sammenkobling skyldes summen av interaksjons verdier representert ved tre forskjellige komponent matriser. Matrix A, som står for det meste av feilen reduksjon i modellen, reflekterte varierende respons fra ulike kreftcellelinjer til generiske stromal signaler som produseres av fibroblaster (figur 5A). For eksempel, 9 av 12 cancercellelinjer generelt svarte på fibroblaster med bremset vekst, som eksemplifisert ved SKBR3 og MCF7, mens tre cancercellelinjer var vanligvis vekst-stimulerte, som vist ved BT-474 og SK-MEL-2.
Median leave-one-out kryssvalideringsfeil når matrise av co-kultur forholdstall tilnærmes ved summen av N komponent matriser.
A) -C) Nedbrytning av co -Kultur matrise inn i 3 komponent matriser. Når gjeldende, kreft og fibroblast-cellelinjer er delt inn i to grupper (X, grønn, og Y, lilla) slik at interaksjonene innenfor samme gruppe gjøre vekst-stimulerende (dvs. positiv) bidrag til den beregnede ko-kultur-forhold og interaksjoner mellom motsatt gruppene utgjør vekst-inhibitorisk (dvs. negativ) bidrag til den beregnede ko-kultur-forhold. P-verdiene refererer til vev opprinnelses segregering mellom X og Y-grupper. Sirkler angir samspillet mellom T47D og AG04351, og firkantene angir samspillet mellom T47D og AG09877. Red refererer til vekst-stimulerende interaksjoner og blå til vekstundertrykkende interaksjoner, med intensitet svarende til styrken av effekten og skalert uavhengig av hverandre i hver matrise.
I motsetning til dette matrise B og C matrise reflektert tydelig fibroblast aktiviteter som korrelerte signifikant, men ufullkomment med en gitt fibroblast vev av opprinnelse (p = 6 x 10
-5 og p = 0,0072 for henholdsvis matriser B og C) (figurene 5B og 5C). I løpet av hver matrise, ble fibroblaster oppdelt i to grupper som har vært i kontakt med distinkte undergrupper av kreftcellelinjer for å fremme cancer celleproliferasjon (grønn vs. lilla i figur 5). Mens flertallet av kreftcellelinjer samhandlet samarbeide med «hud-lignende» fibroblaster i matrisen B, et annet flertall favoriserte de «lunge-lignende» fibroblaster i matrise C. Derfor, vi var i stand til å identifisere flere eksempler der samme fibroblast -cancer sammenkobling førte til positive effekter på kreftcelleformering i en matrise og negative effekter i den andre (f.eks T47D-AG07139), noe som tyder på at fibroblaster kan interagere med kreftceller i minst to funksjonelt forskjellige måter.
tross det faktum at de fleste feil reduksjon i modellen ble bidratt med matrisen A, i noen tilfeller effektstørrelse i matriser B og C i kombinasjonen var tilstrekkelig til å overstyre det i matrisen A. faktisk viste nærmere analyse at netto effekt av forskjellige fibroblaster på kreftcelle spredning kan bare bestemmes nøyaktig ved å vurdere
kvantitative
bidrag av effekter fra alle tre matriser. Dette er illustrert ved interaksjoner mellom brystcancercellelinje T47D og de to hud-fibroblast-cellelinjer AG09877 og AG04351 (angitt i figur 1A og figur 5A-C av firkanter og sirkler, henholdsvis). Matrisen A (figur 5A) viste at T47D ble generelt disponert for veksthemming av alle fibroblast cellelinjer. En plausibel biologisk forklaring på dette kan være uttrykk for en celleoverflatereseptor for noen cytostatisk faktor utskilt av alle fibroblaster. Men matrise B (figur 5B) indikerte at de fleste hud fibroblast cellelinjer hadde en vekst stimulerende aktivitet for T47D, med noen få hederlige unntak, inkludert AG04351. I teorien kan dette aktivitet skyldes ekspresjonen av de fleste hudfibroblaster fra en spesifikk mitogen vekstfaktor. I motsetning til dette matrise C (figur 5C) indikerte at de fleste hud-fibroblast-cellelinjer hadde også en andre distinkt veksthemmende aktivitet for T47D, med det viktige unntak av AG09877 og flere andre. Denne aktiviteten kan umulig besk tilskrives den sekresjon av de fleste hudfibroblaster av en spesifikk veksthemmende cytokin. Således AG09877, ved å uttrykke den vekst-stimulerende aktivitet og mangler den veksthemmende aktivitet, gjort to funksjonelt distinkte vekst-stimulerende bidrag til T47D vekst som var tilstrekkelig i kombinasjon for å overstyre den generelle predisposisjon av T47D til fibroblast-mediert veksthemming. I kontrast, AG04351 bare gjort vekst undertrykkende bidrag med hensyn til både fibroblast aktiviteter.
For å få innsikt i den molekylære identiteten til disse fibroblast aktiviteter, vi isolert RNA fra 36 fibroblastcellelinje monokulturer og utført mikromatrisebaserte genekspresjon profilering ved hjelp av Affymetrix genet chips. Vi først identifisert gener som var forskjellig uttrykt mellom hud og lunge fibroblaster, mellom grupper X og Y i matrisen B, og mellom grupper X og Y i matrise C. Vi brukte genet sett berikelse analyse (GSEA) [25] for å identifisere gensettene beriket innenfor hver sammenligning. Ved hjelp av en falsk oppdagelse hastighet (FDR) terskel på 0,25, identifiserte vi ni gensettene anriket på huden sammenlignet med lungefibroblaster skillet, hvorav to som karakteriserer den epiteliale-til-mesenchymale overgang (EMT) fenotype (tabell 1) [26]. Selv om forbundet med høyere FDRs, ble begge settene også beriket i B
x (hud-lignende) vs. B
y (lunge-aktig) utmerkelse. I motsetning til dette ble ingen gensettene flagget i C
x (hud-lignende) vs. C
y forskjell (lunge-lignende), hvilket antyder at dette fibroblast-aktiviteten kan enten reflektere transkripsjonelle forskjeller bare indusert innenfor rammen av co-kultur eller ikke-transkripsjon forskjeller som ikke kan lett oppdages ved hjelp av microarray-baserte transcriptional profilering.
EMT beskriver et koordinert program av cellulære fenotyper stadig mer anerkjent som avgjørende for metastasering av carcinoma celler. Disse fenotypene inkluderer tap av epitelial celle polaritet, økt cellulær migrering og invasjon inn i omgivende vev [27]. Videre tyder nyere bevis på at EMT programmer også regulere mesenchymale cellefunksjoner inkludert angiogenese [28]. Videre transkripsjonsfaktor sneglen, en hovedregulator av EMT, er uttrykt i aktiverte fibroblaster innenfor healing sår og ved den tumor-stromal grensesnitt [29]. Våre data således antydet at EMT programmer er fortrinnsvis uttrykt av mange hudfibroblaster, kanskje som tjener som det molekylære grunnlaget for en av de fibroblast aktiviteter (type B) som beskrevet av vår kvantitativ modell.
Nærmere inspeksjon av de to EMT gen sett viser at mange av genene som driver anrikning i hudfibroblaster (dvs. kjerne anriket gener) er celleoverflaten og utskilles molekyler som er innblandet i stromale bidrag til tumorprogresjon (figur 6). For eksempel matriksmetalloproteinaser og katepsin inkludert MMP-2, MMP-12, og cathepsin Z er oppregulert i tumor stroma og fremme kreftcelle spredning, migrasjon og invasjon av nedverdigende basalmembraner og utsette kryptiske trekkende og vekstsignaler [30] . Tenascin C er en matricellular protein som stimulerer cancer celleproliferasjon og angiogenese [31]. N-cadherin (CDH2) er uttrykt i filopodia av myofibroblasts som migrerer mot ondartede kreftceller i et transformerende vekstfaktor beta-avhengig måte [32]. SPARC- (utskilt protein sure og rikt på cystein) er en annen stromal matriks protein som øker kreftcelleinvasjon og som er inverst korrelert med overlevelse hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen [33], [34]. Stromal PDGFRB regulerer interstitiell væske trykk og narkotika opptak innen svulster [35]. Dermed de samme genene som regulerer EMT i epiteliale kreftceller regulerer også funksjonelle bidrag til ondartet progresjon fra svulsten stroma. Beriket uttrykk av disse genene i huden fibroblaster antyder vev-spesifikk forprogrammering av mesenchymale populasjoner for svulst stromal funksjonalitet.
Heat kartet (til høyre) og berikelse plot (til venstre) for EMT genet satt fra GSEA analyse av hud vs. lunge fibroblaster [26].
fibroblaster derfor syntes å vise minst to forskjellige effekter på proliferativ respons på kreftceller i co-kultur. Viktigere, en
kvantitativ balanse
mellom disse to fibroblast aktiviteter og den generelle responsen av kreftceller til fibroblast signaler bestemmes i stor grad av co-kultur-forholdet for en bestemt cellelinje sammenkobling. Disse uavhengige fibroblast effektene kan tilsynelatende sameksistere innenfor enkelte fibroblast populasjoner, fungerer enten samarbeide eller kryssende formål med hensyn til kreft cellevekst. Forbløffende nok tyder vår analyse at begge aktivitetene skille fibroblaster i stor grad i henhold til vev opprinnelsesland. Videre microarray profilering indikerte at en av disse aktivitetene kan reflektere differensial uttrykk for en koordinert transcriptional program assosiert med aktiverte mesenchymalceller. Videre arbeid vil være nødvendig for å fullkarakterisere molekylære grunnlaget for hver fibroblast aktivitet og å vurdere relevansen av våre funn til kreft-fibroblast samhandling i reelle svulster.
Dette arbeidet ble begrenset av naturen av cellepopulasjoner undersøkt , for så vidt som etablerte kreftcellelinjer og normale fibroblaster vev kan ikke helt phenocopy disse cellepopulasjoner som finnes innenfor en utviklende menneskelig svulst. Ytterligere studier med større eller mer varierte fibroblast paneler kan også identifisere nye og ulike mønstre av aktivitet. Videre har disse forsøkene, inneholdt bare 12 cancercellelinjer.
