Abstract
autophagic celledød eller mislykket autofagi har blitt foreslått å fjerne skadet samt kreftceller, men det er fortsatt et kritisk hull i vår kunnskap i hvordan denne prosessen er regulert. Målet med denne studien var å identifisere modulatorer av autophagic celledød sti og belyse deres effekter på cellesignalisering og funksjon. Resultatet av våre siRNA bibliotek screenings viser at en intakt coatomer kompleks I (COPI) er obligatorisk for produktiv autofagi. Nedbryting av COPI komplekse medlemmer redusert celle overlevelse og svekket produktiv autofagi som innledes endoplasmatiske retikulum stress. Videre mislykket autofagi provosert av COPI uttømming vesentlig endret vekstfaktor signalering i flere kreftcellelinjer. Til slutt viser vi at COPI komplekse medlemmer er overuttrykt i en rekke kreftcellelinjer og flere typer kreft vev sammenlignet med normale cellelinjer eller vev. I kreftvev, er overekspresjon av COPI medlemmer assosiert med dårlig prognose. Våre resultater viser at coatomer komplekset er essensielt for produktiv autofagi og celle overlevelse, og dermed hemming av COPI medlemmer kan fremme celledød av kreftceller når apoptose er kompromittert
Citation. Claerhout S, Dutta B, Bossuyt W Zhang F, Nguyen-Charles C, Dennison JB, et al. (2012) Mislykket Autophagy induserer endoplasmic nettet Stress og celledød i kreftceller. PLoS ONE 7 (6): e39400. doi: 10,1371 /journal.pone.0039400
Redaktør: Gordon Langsley, Institut National de la Santé et de la recherche MEDICALE – Institut Cochin, Frankrike
mottatt: 22 mars 2011; Godkjent: 21 mai 2012; Publisert: 26 juni 2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis med tilskudd fra Komen Foundation (KG 081 694 og FAS0703849), den Cancer Prevention and Research Institute of Texas, og Ovarian Cancer Research Fund til GBM, og ved MD Anderson Cancer Center Support Grant CA016672. SC støttes av Odyssey Program og Theodore N. Law Endowment for Scientific Achievement ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center. JBD støttes av MD Anderson GlaxoSmithKline TRIUMPH stipendprogrammet og BD ved National Institutes of Health siRNA konsortium for terapi. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP møte flere barrierer som pH-endringer og en begrenset tilførsel av næringsstoffer og oksygen under kreft initiering, progresjon og formidling [1]. For å gjenopprette riktig cellefunksjon og homeostase under lavt til moderat nivå av stress, kreftceller aktivere beskyttende cellulære prosesser som autofagi. Autophagy er et sterkt konservert prosess funnet fra gjær til pattedyr. Det er et unikt nedbrytningsprosess, karakterisert ved lagring av bulk cytoplasma, inkludert proteiner og organeller, som leveres til det lysosomale system for ferdigkoke [2]. Fjerning og degradering av disse cellekomponenter produserer energi og byggesteiner er nødvendig for overlevelsen av kreftceller under metabolsk stress. Gjennomføringen av denne prosessen er utpekt produktiv autofagi eller autophagic flux [2]. Imidlertid fører ikke-produktiv, ukontrollert, eller langvarig autofagi til det som har blitt betegnet «autophagic celledød» [3], [4] eller, som vi refererer til, «mislykket autofagi» [5].
i kreft, har prosessen med å autophagy vært foreslått å bidra både til tumor suppresjon og progresjon. På den ene siden, undertrykker autophagy tumorer ved å begrense initiering og progresjon. Ekspresjonen av Beclin 1, pattedyr-homolog av gjær autophagy gen Atg6 som er kritisk for induksjon av autophagy, er redusert i mange kreft vev og kreftcellelinjer [6]. I tillegg er den ultrafiolette stråling motstand-assosiert genet (
UVRAG
), som er nødvendig for tumor suppressor funksjon av Beclin 1, er også monoallelically mutert i mange humane cancere [7]. Videre autophagy undertrykker også tumorigenesis ved å tilveiebringe ATP som er nødvendig for DNA-reparasjon [8] eller ved å eliminere den lange levetid proteinet p62 [9]. På den annen side kan autophagy fremme tumordannelse ved å overvinne stress fremkalt av mangel på næringsstoffer og oksygen i pre-invasive og raskt voksende tumorer. Vårt laboratorium har vist at den LKB1-AMPK sti-avhengig fosforylering av p27 ved treonin 198 stabiliserer p27 og tillater cellene å overleve vekstfaktor-tilbaketrekning og metabolsk stress ved å indusere autofagi [10]. Dette autophagic respons kan bidra til tumor-celle overlevelse under vekst-faktor deprivasjon eller forstyrret næringsstoff og energiomsetning. Således, avhengig av cellulær kontekst og styrken og varigheten av de spenningssignaler, autophagy enten hindrer eller fremmer kreftutvikling.
I tillegg til sin rolle i karsinogenese, autofagi modulerer også effekten av terapeutiske legemidler. Induksjon av en «produktiv» autophagic prosess ved kjemoterapi og stråling tillater overlevelse av kreftceller [11]. Dette tyder på at autofagi modulatorer kan bevisstgjøre kreftceller til konvensjonelle kreft terapier [11], [12]. Ved å målrette viktige proteiner i produktiv autophagy, kan cellene gjennomgå «mislykket autophagy», en alternativ død mekanisme for kreftceller som er resistente mot apoptose-induserende midler [11], [13]. Selv om prosessen med produktive autofagi har blitt studert inngå, er det uklart hvilke faktorer som regulerer mislykket autofagi. Identifisere disse modulatorer kan forbedre effekten av konvensjonell behandling og bidra i oppdagelsen av nye behandlinger for kreftpasienter.
Hensikten med denne studien var å identifisere regulatorer av mislykket autofagi og belyse deres effekt på signalmekanismer og cellulær overlevelse i kreftceller. Vi benyttet små interfererende RNA (siRNA) skjermer i kombinasjon med validering og funksjonelle studier. Medlemmer av coatomer kompleks I (COPI), som er involvert i cellulære trafficking, dukket opp som øverste treff fra skjermene våre moduler autofagi og celledød i kreftceller. Mislykket autofagi og endoplasmatiske retikulum (ER) stresset ble observert etter knockdown av COPI komponenter. I tillegg COPI uttømming påvirket phosphoinositide 3-kinase (PI3K) /AKT signalveien. Alt i alt har effekten av COPI på celledød, autophagy og ER stress var mer uttalt i kreftceller enn på normale celler. Dette er konsistent med overekspresjon av COPI proteiner og gener som sett i cancercellelinjer og pasientprøver.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
human brystcancercelle linjer MDA-MB-231 [10], MDA-MB-468 [10], BT549 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA), T47D [10], SKBR3 (ATCC), HCC1428 (ATCC) og MCF7 [10], ble ovarian cancer-cellelinjer SKOV3 (ATCC), og OVCAR3 (ATCC) holdes i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 5% FBS. MDA-MB-231, MDA-MD468, og SKOV3-celler stabilt transfektert med GFP-LC3 ble dyrket i det samme medium. Den osteosarcom cellelinjen U2OS (ATCC) og U2OS GFP-LC3 [10] ble dyrket i DMEM og 10% FBS. MCF10A (ATCC) ble dyrket i DMEM /F12 og 5% hesteserum med 20 ng /ml EGF, 0,5 mg /ml hydrokortison, 100 ng /ml koleratoksin, og 10 ug /ml insulin. GFP-LC3 stabile cellelinjer ble generert som beskrevet i [10]. Cellelinjer ble validert ved STR DNA fingerprinting bruke AmpFℓSTR Identifiler kit i henhold til produsentens instruksjoner (Applied Biosystems katt 4.322.288). STR profiler ble sammenlignet med kjente ATCC fingeravtrykk (ATCC.org), til cellelinje integrert Molecular Authentication database (CLIMA) versjon 0.1.200808 [14] og til den MD Anderson fingeravtrykkdatabasen. Imatinib, ble en slags gave fra Dr. S. Kondo ved MD Anderson Cancer Center, og bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) oppløst i DMSO. Brefeldin A (Sigma-Aldrich) og rapamycin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ble oppløst i metanol.
siRNA Screens
Accell siRNA skjermen for autofagi modulatorer.
MDA-MB-231, ble U2OS, og SKOV3-celler stabilt transfektert med GFP-LC3 sådd ut i 96-brønners plater ved 2500 celler /brønn for MDA-MB-231 og SKOV3-celler eller 1000 celler /brønn for U2OS celler. Etter 24 timer ble mediet forandret til Accell medium inneholdende 0,05% FBS (80 ul /brønn) (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Accell sirnas (G-201 000 Humant RNAi Global, Lot 08103, i 96-brønners plater) ble oppløst i 10 ul av 1 x siRNA-buffer og inkubert på et risteapparat ved romtemperatur i 30 min. Accell media (200 ul) inneholdende 0,05% FBS ble tilsatt til hver brønn og blandet ved å pipettere fem ganger. De oppløste sirnas (20 ul) ble tilsatt til hver brønn for å lage en endelig siRNA konsentrasjon på 1 uM (100 ul /brønn). Celler ble inkubert med siRNA i 48 timer. Legemidlene ble fortynnet til et ti ganger virke konsentrasjon og tilsatt til hver brønn som indikert (11 ul /brønn) for å gjøre sluttkonsentrasjoner på 2 mM 2-deoksy-D-glukose (2DG), 100 nM rapamycin, og 10 uM imatinib. Cellene ble vasket med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS i 45 minutter ved romtemperatur. Celler ble vasket tre ganger med PBS, kjerner farget med Hoechst 33342 i 5 minutter og vasket en gang med PBS, og 250 ul PBS ble tilsatt til cellene. Autophagosome formasjonen ble bestemt av en i celle Analyzer 1000 Cellular Imaging and Analysis System (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey). Resultatene er vist som% autofagi. I tillegg ble alle genene kombinert sammen for z-poeng-beregning. Z-score på genet
I
ble beregnet ut fra som
z
i
= (
x
i Z –
μ
) /
σ
, hvor,
x
i
er% autofagi fra autofagi skjermen, og
μ Hotell og
σ
er gjennomsnittet og standardavvik basert på alle genene til stede i skjermen.
siRNA skjermen for levedyktighet modulatorer.
Vi brukte en klædd bibliotek av 779 siRNA bassenger (https://www.dharmacon.com/product /Productlandingtemplate.aspx?id=225 tab=1 for genet liste) som dekker den menneskelige kinome og kinase relaterte gener (Dharmacon SMARTpool bibliotek, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) i MDA-MB-231, MDA-MB-468 , SKOV3, og OVCAR3 cellelinjer. Hver pool av syntetiske sirnas var kledd i 96-brønners-formatet, og transfeksjoner ble utført på triplikate plater ved anvendelse av 25 nM av siRNA levert av DharmaFECT I (Dharmacon). Seks replikater av RISC-fri ikke-måls siRNA og siRNA mot PLK (giftig kontroll) i hver plate gitt negative og positive kontroller for celledød over hele skjermen, henholdsvis. Kort fortalt DharmaFECT jeg ble påført på 0,15 ul /brønn for 25 nM siRNA levering i en omvendt transfeksjon modus. Etter tre dager ble cellelevedyktigheten ble analysert med en Cell Titer blå celleviabilitet Assay (Promega, Madison, WI). Cell Titer Blå-reagens (resazurin 5 ul /brønn) ble inkludert i de siste tre timers inkubering. Levedyktige celler reduserer Resazurin til resorufin, som er sterkt fluorescerende. Fluorescensintensiteten ble målt ved anvendelse av en mikroplateavleser ved en eksitasjonsbølgelengde på 530 nm og en emisjonsbølgelengde på 604 nm. Inter skjevhet ble eliminert ved å normalisere cellelevedyktighet verdier av midlere sentrering og skalert til å ha lik varians og deretter omdannet til de tilsvarende Z-score for hver av de tre replikate eksperimenter. Z-score på genet
«jeg»
for replikere
«j»
i plate
«k»
ble beregnet som
z
ij
= (
x
ij Anmeldelser –
μ
jk
) /
σ
jk
, hvor,
x
ij
er den rå intensitet verdi, og
μ
jk Hotell og
σ
jk
er gjennomsnitt og standardavvik av intensitet for alle prøvene i plate
k
hhv. Deretter ble den midlere z-skåre beregnes over alle replikater av hvert gen i hver cellelinje, og sirnas med
z
i
ave
verdier som er lavere enn -2 ble betraktet som signifikant inhiberende «treff «for den tilsvarende cellelinje
Transfeksjon og siRNA reagenser
siRNAs. (Dharmacon; Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) ble transfektert med DharmaFECT i (Dharmacon) eller Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) ved hjelp produsentens protokoller. Sekvensene til de sirnas er som følger: kontroll RISC-fri nontargeting siRNA (D-001220-01-05), COPA (L-011835-00), COPB1 (L-017940-01), COPB2 (L-019847-00 ), COPG1 (L-019138-00), COPG2 (L-019988-01), KOLS (L-013063-01), COPE (L-017632-01), COPZ1 (L-020293-01), PLK1 (M -003290-01) BIP1 (L-008198-00-0005), Atg5 (L-004374-00), og Atg12 (L-010212-00).
transmisjonselektronmikroskopi
Celleprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble fiksert med en oppløsning inneholdende 3% glutaraldehyd pluss 2% paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer, pH 7,3, i 1 time. Etter fiksering ble prøvene vasket og behandlet med 0.1% Millipore-filtrert cacodylat buffer garvesyre, postfiksert med 1% bufret osmiumtetroksyd i 30 minutter, og beiset en bloc med 1% Millipore-filtrert uranylacetat. Prøvene ble dehydrert i økende konsentrasjoner av etanol, infiltrert og innstøpt i LX-112 medium. Prøvene ble polymerisert i en 70 ° C ovn i 2 dager. Ultratynne snitt ble kuttet i en Leica ULTRACUT mikrotom (Leica, Deerfield, IL), farget med uranylacetat og føre citrate i en Leica EM Stainer, og undersøkt i en JEM 1010 transmisjonselektronmikroskop (JEOL, USA, Inc., Peabody, MA ) ved en akselererende spenning på 80 kV. Digitale bilder ble oppnådd ved anvendelse av en AMT Imaging System (Advanced Techniques Mikros Corp., Danvers, MA).
SDS-PAGE og Western blot-analyse
Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [12]. Følgende antistoffer ble brukt: p62 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), LC3 (Novus Biologicals, Littleton, CO), IRE1α, BIP calnexin, Atg5, Atg12, pSer473AKT, pThr308AKT, AKT, pSer235 /236 S6, pSer65 4EBP og 4EBP (alle fra Cell Signaling Technology, Beverly, MA), COPB1 (Fisher Scientific, Lafayette, CO), og β-aktin (Sigma-Aldrich). Antistoffer mot COPA, COPB2, KOLS, COPG1, og COPG2 var en slags gave fra Dr. Wieland (Universitetet i Heidelberg, Heidelberg, Tyskland). Kvantifisering av bandet intensiteten ble utført av Un-Scan-It gel (versjon 5.1, Silk Scientific Corporation) og uttrykt ved dobling av kontroll.
Confocal og Fluorescensmikroskopi
Konfokalmikroskopi .
farging for LAMP2 (BD Biosciences, 1/200) eller COPB2 (1/1000) ble utført ved hjelp av standard prosedyrer. For tfLC3 analysen, celler forbigående uttrykker tfLC3 [15] ble dyrket over natten og behandlet som beskrevet. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med 4′-6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). For Annexin-V-Alexa 568 flekker, celler som stabilt uttrykker GFP-LC3 ble dyrket i åtte brønn kammer lysbilder (BD Biosciences) og behandles som angitt. Annexin-V-Alexa 568 (Roche, Mannheim, Tyskland) farging ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Alle bildene ble tatt på en Olympus FV1000 mikroskop med 100X objektiv (N.A. 1,30). Bilder ble ervervet og behandlet ved hjelp av Fluoview programvare og ImageJ
Fluorescensmikroskopi
immunfluorescens bilder for p62 (BD Biosciences, 1/200).. Ble kjøpt ved hjelp av en Nikon Eclipse TE200-E mikroskop og IPLab bildebehandlingsprogrammer (BioVision Technologies, Exton, PA).
Crystal Violet celleviabilitet analysen
Livskraftig assay (krystallfiolett) ble utført ved hjelp av standard prosedyrer.
klonogene replating analysen
celler ble dyrket under forskjellige betingelser, og alle cellene ble oppsamlet ved trypsinering og ble platet ved 100-400 celler pr brønn i seks-brønners vevkulturplater. Kolonier ble dyrket i 11-14 dager i fullstendig vekstmedium og farget med 0,5% krystallfiolett-oppløsning (80% dH
2o, 20% metanol, 0,5% krystallfiolett). Bilder fra koloniene ble tatt ved bruk av FluorChemE avbildningssystem (Cell Biosciences, Inc.), og antallet kolonier ble analysert ved hjelp av AlphaVIEW SA (versjon 3.2.3.0, Cell Biosciences, Inc.). Eksperimentet ble utført i triplikat og gjentatt to ganger.
RPPA Analyse
RPPA prosedyrer for antistoffarging og signaldeteksjons ble utført som tidligere beskrevet [10], [16].
Oncomine data Base
Bittner multicancer datasettet er tilgjengelig i den offentlige sfæren på https://www.oncomine.org/main/index.jsp [17], og derfor ingen IRB godkjennelse var nødvendig. Vev med differensial uttrykk for COPI komplekse medlemmer (P≤10
-6) ble valgt.
Statistikk og dataanalyse
Alle data ble analysert ved hjelp av GraphPad Prism 5-programvaren (GraphPad programvare , Inc., San Diego, CA, USA). Sammenligninger mellom de to gruppene ble evaluert statistisk ved en to-halet paret t-test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. For å sammenligne genuttrykk nivåer i godartede og kreft grupper, ble en to-utvalgs t-test benyttet. Vi brukte Cox proporsjonal hazard regresjonsmodell for univariate overlevelsesanalyse. Cutoffs av de høye og lave uttrykk grupper ble optimalisert for å oppnå lavest p-verdi. Alle statistiske analyser, boksplott, og Kaplan-Meier overlevelses tomter ble utført ved hjelp av R-programvare (https://www.r-project.org).
Resultater
siRNA Screening Identifiserer Coatomer Complex medlemmer som modulatorer av levedyktighet og autofagi
for å identifisere nye molekylære spillere i kontrollen av autophagic celledød, vi har utført to typer RNA interferens (RNAi) skjermer for å finne gener som når slått ned resultert i både redusert celleviabilitet og dannelse av autophagosomes. Vi først vist menneske kinome fordi kinaser og kinase-relaterte gener er viktige regulatorer av komplekse cellulære funksjoner som autofagi. sirnas ble transfektert i fire forskjellige cellelinjer: to eggstokkreft cellelinjer (SKOV3 [
HER2
forsterket;
CDKN2A
,
PIK3CA
, og
TP53
mutanter] og OVCAR3 [
PIK3R1 Hotell og
TP53
mutanter]) og to brystkreftcellelinjer (MDA-MB-231 [
BRAF
,
CDKN2A
,
KRAS
, og
TP53
mutanter] og MDA-MB-468 [
EGFR
forsterket;
PTEN
,
RB1
,
TP53
, og
SMAD4
mutanter]) med ulike genetiske bakgrunn. Totalt, identifiserte vi 67 gener, 9% av det kinome, som da slås ned betydelig redusert cellelevedyktighet (z-poeng mindre enn -2) (tabell S1). Av disse 67 positive treff, knockdown av 12 gener redusert levedyktighet av minst to av de cellelinjer som ble testet. Disse genene var
akt2
,
CHEK1
,
COPB2
,
PRKAR2B, RPS6KA2 Hotell og
WEE1 product: (i tre av fire cellelinjer) og
AVPR1B
,
CNKSR1
,
DGUOK, INSRR
,
JAK2, TAF1L
(i to av fire cellelinjer).
for å identifisere gener som også er involvert i reguleringen av autophagy i kreftceller, gjennomførte vi en bildebasert liten RNAi bibliotek (Accell; Tabell S2) skjerm med autophagosome formasjon som et endepunkt. MDA-MB-231, SKOV3, og U2OS kreftcellelinjer ble stabilt transfektert med grønt fluorescerende protein-mikrotubul-assosiert protein en lettkjede 3 (GFP-LC3) reporter vektor [18], [19]. Fordi LC3 er degradert under sluttfasen av produktiv autofagi [20], ble den vedvarende akkumulering av LC3 i punctate vesikler brukes som en markør for svekket eller mislykket autofagi. Rapamycin, 2-deoksy-D-glukose (2DG), og imatinib var positive kontroller for autophagosome formasjonen. Non-targeting egge sirnas, brukt som negative kontroller, førte ikke til autofagi (fig. S1 A-C). I alle cellelinjene som ble testet, observerte vi at nedbrytning av coatomer proteinkomplekset subenhet beta-1 (COPB1) forårsaket en akkumulering av de LC3-positive flekker som er forenlig med autophagy (fig S1A-C,. Tabell S3), noe som indikerer at autophagy mekanismen er konservert blant ulike kreft linjene. I konklusjonen, ved hjelp av siRNA skjermer vi identifisert COPB2 og COPB1 som modulatorer av henholdsvis celle levedyktighet og autofagi.
Coatomer Proteiner modulere celleviabilitet
COPB1 og COPB2, komponenter av COPI komplekset, ble vurdert som attraktive kandidater for videre studier basert på betydelig innvirkning på kreftceller på både celle levedyktighet og autophagosome dannelse (tabell S1 og S3, fig. S1). I en sekundær skjerm, vi validert og analysert effektene på cellevekst og autophagosome formasjon etter banket ned uavhengige medlemmer av dette komplekset i tre kreftcellelinjer (MDA-MB-231, MDA-MB-468 og SKOV3). Som vist i fig S2, sirnas redusert ekspresjon av flere COPI komponenter. I samsvar med våre funn fra siRNA skjermen, uttømming av COPA, COPB1, COPB2, COPG1, KOLS, og COPZ1 redusert cellevekst (Fig. 1A og C). I motsetning til dette, celleviabilitet var upåvirket i celler behandlet med ikke-målsøkende siRNA (Fig. 1A og B) eller bare moderat påvirket på MCF10A, en normal-lignende brystkreft cellelinje, etter COPB2 knockdown (fig. S9B). Tilsetning av den pan-kaspaseinhibitor zVAD ikke redde celledød (data ikke vist) indikerer at celledøden var kaspase-uavhengig. For å bekrefte at kreft celler er forpliktet til døden når COPI er svekket, bestemt vi klonogene bedring etter 72 timer av siRNA behandling i MDA-MB-231 (Fig. 1 D) og U2OS (Fig. 1E) kreftceller. I begge cellelinjene, ble replating effektivitet ikke reduseres etter COPG2 uttømming i forhold til kontroll, bekrefter våre resultater. I motsetning til dette, reduserer ekspresjon av COPA eller COPB2 nesten fullstendig opphevet klonogene gjenvinning (fig. 1D og E), som er i overensstemmelse med våre resultater levedyktighet (fig. 1A). Spesielt, replating Effektiviteten ble ikke redusert i U2OS celler behandlet med rapamycin (fig. 1F), i samsvar med muligheten av rapamycin til å indusere produktiv autophagy som en overlevelses prosess. Celledød etter COPI knockdown var ytterligere Visualized og bekreftet ved hjelp Annexin V farging (fig. S3). Til sammen viser disse resultater at de fleste COPI komponenter modulere levedyktighet av kreftceller.
(A) MDA-MB-231, MDA-MB-468, og SKOV3-celler ble transfektert med siRNA målretting uavhengige medlemmer av COPI. Knockdown av PLK1 ble brukt som positiv kontroll for celledød. Celle nummer etter 72 timer ble målt ved krystallfiolett farging. (B, C) Representative lysmikroskopi bilder av MDA-MB-231-celler behandlet med RF eller siRNA mot COPB2. (D) klonogene replating effektiviteten av MDA-MB-231 brystcancerceller etter redusert ekspresjon av COPA, COPB2 eller COPG2 sammenlignet med celler behandlet med RISC-fri (RF). Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre paralleller av to uavhengige eksperimenter. Klonogene replating effektivitet av U2OS kreftceller etter behandling med siRNA mot COPB2 eller COPG2 (E) eller rapamycin (F). Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre paralleller av to uavhengige eksperimenter. **, P 0,01; ***, P. 0,001
Coatomer Proteiner modulere Autophagy
Deretter testet vi om uttømming av forskjellige uavhengige COPI komplekse proteiner initiert autofagi, ved hjelp av punktformet GFP-LC3 formasjon som en avlesning. Redusert uttrykk for COPA, COPB1, COPB2, COPG1, KOLS, og COPZ1 indusert punktat GFP-LC3 formasjonen i MDA-MB-231, MDA-MB-468 og SKOV3 kreft cellelinjer (Fig. 2A). Disse resultatene var sammenlignbare med de som ble sett når cellene ble behandlet med imatinib, en positiv kontroll for autophagosome induksjon (fig. 2A-C). Autophagosome Dannelse ble også vurdert ved omdannelsen av endogene LC3-I til LC3-II ved hjelp av immunblotting fordi mengden av LC3-II korrelerer med mengden av autophagic membraner merket med LC3-II [19]. I samsvar med data innhentet i kreftceller eksogent overuttrykker GFP-LC3 (fig. 2A-C), og med unntak av COPG2, noe som reduserer ekspresjon av de coatomer subenheter førte til en akkumulering av endogent LC3-II i MDA-MB-231 celler (fig. 2D). Lignende resultater ble funnet i MDA-MB-468 og U2OS kreftceller (fig. 2E). Vi ytterligere validert utholdenhet av LC3-II økning etter COPI utarming av en utvidet tidsforløpet analyse (Fig. 2F). En vedvarende redusert uttrykk for COPI opprettholdt LC3-II uttrykk tilsynelatende uten degradering av LC3-II, som tyder på nedsatt autofagi. Elektronmikroskopi-analyse (Fig. 3A, C og E; inserts figur 3B, D og F). Bekreftet dannelsen og markert økning (figur 3G.) Av autophagosomes etter COPB2 tømming (fig 3C og D.) Og imatinib behandling (fig. 3E og F) ved ultra nivå ved tilstedeværelse av dobbeltmembranorganeller som inneholder ufordøyde cytoplasmiske innhold [18]. I motsetning til dette tak siRNA (RF) (Fig. 3A og B) ikke fremme autophagosome formasjonen. Selv om økningen i autophagosomes var lik mellom MDA-MB-231 celler behandlet med COPB2 siRNA og imatinib, fant vi at autophagosomes indusert av COPB2 siRNA var betydelig større enn autophagosomes indusert av imatinib som vurderes av kvantifisering av autophagosomal /cytoplasma område på elektron mikros bilder (fig. 3 H). Denne observasjonen ble ytterligere bekreftet ved bestemmelse av størrelsen av GFP-LC3 positive organeller av MDA-MB-231-celler behandlet med COPB2 siRNA eller tak siRNA (fig. S4A). Størrelsen på autophagosomes indusert av siCOPB2 er også større enn den for sult-indusert autophagosomes (fig. S4B og S4C). Samlet indikerer disse resultater at COPI uttømming resulterer i akkumulering av LC3 positiv flekker i kreftceller.
(A) MDA-MB-231, MDA-MB-468, og SKOV3-celler som stabilt overuttrykkende GFP-LC3 var transfektert med siRNA rettet mot uavhengige medlemmer av COPI i 72 timer, og autophagosome formasjonen ble analysert ved hjelp av IN Cell analysator 1000 system. Imatinib ble anvendt som en positiv kontroll for autophagosome formasjonen. Resultatene er gjennomsnittet ± SD fra tre paralleller. Representative kurve for to uavhengige eksperimenter er vist. (B, C) Representant epifluorescent mikroskopi bilder (i celle Analyzer 1000) av GFP-LC3-positive vesikler i kontroll MDA-MB-231 celler eller etter COPB2 uttømming. (D) Immun analyse av LC3 i MDA-MB-231 celler 72 timer etter siRNA mediert uttømming av uavhengige medlemmer av COPI. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (E) MDA-MB-468 og U2OS celler behandlet med RF eller COPB2 siRNA ble analysert for proteinnivåer LC3. (F) MDA-MB-231-celler ble transfektert med siRNA mot COPB2, COPG2 eller RISC-fri (RF) og dyrket i de angitte tidsrom, lysert, og immunoblottet med antistoffer mot LC3, COPB2, COPG2 og β-aktin. *, Aspecific bånd.
(A-F) Transmisjonselektronmikroskopi-analyse av autophagy i MDA-MB-231-celler behandlet med RF eller siRNA mot COPB2 i 48 timer eller imatinib i 24 timer. Hvite pilspisser indikerer autophagosomes vises i panelene C og E. (B, D, F) høy forstørrelse bilder av eske områder. Skala barer indikerer 2 mikrometer (A, C, E) og 500 nm (B, D, F). (G) Antall autophagosomes per celle ble beregnet ved å telle antall dobbeltmembranorganeller i 20 eller flere enkeltceller. (H) Prosent autophagosomal område ble beregnet ved å måle området som dekkes av dobbel membran organeller i cytoplasma av 20 eller flere individuelle celler. **, P 0,01; ****, P 0,0001,
Brudd COPI Induserer Mislykket Autophagy
På grunn uttømming av COPI komplekse medlemmer forårsaket celledød og autophagosome formasjon, vi setter ut for å teste om mislykket autofagi var mekanismen. For å skille mellom mislykket og produktiv autofagi vi analysert p62, som fortrinnsvis degradert under autofagi, men nivåene forblir konstant eller økt ved induksjon av mislykket autofagi [21]. Som bestemt ved immunoblotanalyse av forskjellige kreftcellelinjer (Fig. 4A) og immunofluorescensanalyse i MDA-MB-231-celler (fig. 4B, C), fikk siCOPB2 ikke redusere P62 nivåer, som ville være forventet av produktiv autophagy, men øket nivåene av p62 sammenlignet med kontrollnivåer. I motsetning til dette ble P62 nivåer redusert i MCF10A (fig. S9D), selv om COPB2 protein nivåer ble signifikant redusert (fig. S9C). I tillegg har vi brukt bafilomycin A1 (BafA1), et lysosom-spesifikk inhibitor for proteindegradering og ende stadier av autophagy fremgangsmåte for å inhibere autophagic fluks [18], [22]. BafA1 behandling har vist seg å øke LC3-II-nivå i celler som gjennomgår produktiv autofagi men har begrenset effekt på LC3-II-nivå i celler som gjennomgår mislykket autofagi [20]. I MDA-MB-231 celler med knockdown av COPB2, gjorde BafA1 behandling ikke ytterligere øke LC3-II (fig. 4D) i motsetning til COPG2 oppbrukt eller kontrollceller, noe som indikerer nedsatt nedbrytning av autophagosomal innhold av lysosomene etter COPB2 utarming . Vi bekreftet denne observasjonen i U2OS kreftceller behandlet med enten BafA1 eller rapamycin (Fig. S5). Nedsatt degradering av den indre luminal innholdet i autophagosomes av lysosomer kan skyldes: 1) mislyktes autophagosome /lysosome fusjon; 2) nedsatt nedbrytning; eller 3) ufullstendig gjenvinning av de autolysosomal komponentene [18], [23]. For å finne ut hvilke av disse mulighetene var ansvarlig for økningen i LC3-II og p62 i celler med COPI utarming, vi først analysert fusjon av autophagosomes (GFP-LC3) og lysosomer (LAMP2) etter knockdown av COPI i MDA-MB-231 celler stabilt transfektert med GFP-LC3 (fig. 5A). Confocal analyse viste colocalization av GFP-LC3 og LAMP2 i kreftceller behandlet med siRNA mot COPB2 (Fig. 5A), noe som tyder fusjon ble ikke fullstendig blokkert av uttømming av COPI. Vi testet ytterligere effekten av COPB2 siRNA på autophagosomal degradering ved hjelp mRFP-GFP tandem fluorescerende merket LC3 (tfLC3 [15]). I celler transient transfektert med tfLC3, GFP- /RFP-positive puncta representerer autophagosomes ikke smeltet til lysosomer, mens RFP-positive /GFP-negative puncta representerer autolysosomes som GFP er raskere stanset ved lav lysosomal pH [15]. MDA-MB-231 celler transient transfektert med tfLC3 viste colocalization av mRFP og GFP signal etter COPI uttømming eller BafA1 behandling (Fig. 5B, rad 2 og 3), en indikasjon på svekket modning av autophagosomes. Behandling av MDA-MB-231-celler med imatinib resulterte i RFP-positive /GFP-negativ puncta som representerer tilstedeværelsen av autolysosomes og således autophagic fluks (fig. 5B, siste raden). Lignende resultater ble oppnådd i U2OS kreftceller (Fig. S6). I tillegg COPB2 utarmet celler viste store LAMP2 positive organeller (fig. S4D).
