Abstract
In vitro
cellebaserte modeller for lungekreft er ofte ansatt for å studere invasjonen og mekanismene bak metastasering. Men disse modellene ofte studere bare en celletype med to-dimensjonale (2D) monolag cellekulturer, som ikke nøyaktig reflekterer kompleksiteten av inflammasjon
in vivo
. Her ble en tre-dimensjonal (3D) celle ko-kultur kollagen gel modell anvendes, inneholdende human lunge adenokarsinom celler (HCC), human lunge fibroblast celler (MRC-5) og makrofager. Cellekulturmedier og celle bilder ble oppsamlet, og matriks-metalloproteinase-1 (MMP-1) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) produksjonen ble overvåket under forskjellige cellekulturbetingelser. Vi fant ut at simulere hypoksi og /eller serum sult forhold indusert forhøyet sekresjon av VEGF i 3D co-kultur modell
in vitro
, men ikke MMP-1; morfologien av HCC i 2D versus 3D ko-kultursystem var ekstremt forskjellig. MMP-1, og VEGF ble utskilt ved høyere nivåer i blandede cellegrupper i stedet for mono-kulturgrupper. Derfor, som omfatter lungekreftceller, fibroblaster og makrofager kan bedre reflektere fysiologiske metastase mekanismer i forhold til monokultursystemer. Tumor stromale celler, makrofager, og fibroblast celler kan fremme invasjon og metastasering, noe som også gir en ny retning for utforming av behandlingsformer rettet mot å ødelegge stroma av tumorvev
Citation. Liu Xq, Kiefl R, Roskopf C, Tian F, Huber RM (2016) Interaksjoner mellom lungekreft celler, fibroblaster og makrofager i 3D Co-kulturer og virkningen på MMP-1 og VEGF-uttrykk. PLoS ONE 11 (5): e0156268. doi: 10,1371 /journal.pone.0156268
Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES
mottatt: 27 september 2015; Godkjent: 11 mai 2016; Publisert: May 27, 2016
Copyright: © 2016 Liu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
rapporter om lunge maligniteter dateres så langt tilbake som antikken, og ved midten av det tjuende århundre, lungekreft hadde blitt en epidemi og ble godt etablert som den ledende årsaken til kreft-relaterte dødsfall i Nord-Amerika og Europa, som følge innføring av billige, masseproduserte sigaretter [1]. I dag er lungekreft den vanligste typen kreft på verdensbasis, og står for mer enn 1.35 million tilfeller per år [2]. Til tross for betydelige fremskritt i behandlingen av de tidlige stadier av sykdommen, overlevelse for avanserte stadier av lungekreft forbli lav; de fleste sent stadium lungekreftpasienter dør innen 18 måneder etter diagnose [3]. Oppsamling av bevis viser at mens de fleste kreftforskere fokusere utelukkende på lungekreftceller, er det en økende erkjennelse av at svulsten mikromiljøet (TME) og tumor-stromal interaksjoner spiller en viktig rolle i prosessen for lungekreft etablering, invasjon og metastase. Svulsten stroma består både ekstracellulær matriks (ECM) og cellulære komponenter. ECM inkluderer utskilte proteoglykaner som spiller både en strukturell og celle-signale rolle. Cellulære komponenter inkluderer immunceller, kreft-assosiert fibroblaster (kafeer), endotelceller, adipocytter, benmarg-avledede celler, myofibroblasts, og fibroblaster [4]. Funksjonelle genomiske studier har identifisert gen signaturer som er prognostiske for ikke-liten lungecancer (NSCLC) overlevelse, blant gener som koder for ECM-proteiner [5], som fremhever den rollen av stroma i pasienten prognose og overlevelse.
i denne studien valgte vi å undersøke MMP-1 og VEGF som indikatorer på samspillet mellom kreft og stromale celler, fordi begge har blitt åpenbart knyttet til tumorinvasjon og metastasering. Tidligere studier viser at MMP spiller en fremtredende rolle i kreft [6]. MMP kan degradere ulike proteiner knyttet til ECM. Som et resultat, kan tumorceller bevege seg lettere i løpet av prosesser av invasjon og metastasering. MMP-1 hører til MMP-familien og er kjent som kollagenase eller gelatinase, noe som forringer kollagen IV og økes i høyt metastatiske kreftceller [7]. VEGF ble identifisert og isolert som et endotelcelle-spesifikt mitogen, som har kapasitet til å indusere fysiologisk og patologisk angiogenese nødvendig for å etablere nye blodkar [8, 9]. I en fast tumor, under ekspansjonsprosessen, de sentrale delene av tumoren blir hypoksiske, som fremmer VEGF produksjon og følgelig spredning av tumoren [10]. I tillegg har nyere studier vist at VEGF-indusert aktiviteter i kreftceller inkludere tumorinvasjon og metastase [11].
De fleste forskergrupper har brukt cellemono dyrket på vev kultur plast, som er mindre kompleks, mindre tilpasningsdyktig og ikke meget representativ for den fysiologiske ekstracellulære mikromiljøet til stede hos mennesker [12]. Når celler dyrkes på de stive plastoverflatene kulturflasker, at de bare kan vokse bort fra plasten i en to-dimensjonal (2D) måte. I tillegg har mange studier indikerer at 2D-cellekulturer ikke kan reflektere tilstrekkelig fysiologiske kompleksiteten av fast vev, og deres anvendelse i cellebaserte analyser til en viss grad kan føre til feil i å forutsi vevs-spesifikke responser. Celler dyrket i 2D formater gjennomgå spredning og deretter de-differensiering, og dermed miste sine viktige funksjoner [13]. I kontrast, celler dyrket i et 3D-matrise er dramatisk forskjellig med hensyn til proliferasjon, differensiering, morfologi, og cellulær funksjon [14, 15]. I denne studien ble det etablert en organotypiske ko-kulturmodell bestående av lunge adenokarsinomceller (HCC), lungefibroblaster (MRC-5), og immunceller (makrofager), som ikke bare gjør det mulig for utforskning av interaksjoner mellom tumorceller og stromal celler, men også representerer en modell som er mer reflektert av vilkårene er tilstede
in vivo
.
Materialer og metoder
Cell kultur
Alle celle linjer ble levert av Medical Clinic V Laboratory av Ludwig-Maximilians-universitetet. MRC-5 celler ble dyrket i Eagle er Minimum Essential Medium (LGC Standards GmbH, Wesel, Tyskland). For å gjøre det hele vekstmedium, tilsatt vi bovint serum (FBS) føtalt ved en sluttkonsentrasjon på 10%. HCC celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% FBS (Biochrom AG, Berlin, Tyskland). Makrofager ble dyrket i Hams F-12 K-medium (LGC Standards GmbH, Wesel, Tyskland) supplert med 100 U /ml penicillin, 100 mg /ml streptomycin-løsning, og 2 mM L-glutamin (PAA).
3D kollagen gel co-kultur modell
Før utarbeidelsen av kollagen gel, ble cellene tint og fortynnet til 2 x 10
5 celler per brønn. Forholdet mellom celler ble etablert som følger: 5: 5: 1 HCC: MRC-5: makrofag. For Western blot analyser ble cellene plassert i 2 x 10
5 og 1 x 10
6 celler per gruppe. For å fremstille geler, kollagen (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), sterile 10X fosfat-bufret saltvann (PBS), sterilt, destillert vann (DDH
2o), og sterilt 1 N NaOH ble blandet med is. Det totale volumet av kollagen gel ble beregnet som følger:.
I et sterilt rør blande dH
2O, 1 N NaOH, og 10X PBS
Sluttkonsentrasjonen av kollagen var 1 mg /ml, og 0,5 ml ble dispensert i hver kulturskål kammer og umiddelbart plassert på is. Cellene ble deretter sådd ut i kollagen gel, som ble pipettert flere ganger for å blande godt. Gelene ble fjernet til romtemperatur hvor de størkner raskt. Kulturene ble deretter inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator i 30-40 minutter, eller inntil en fast gel ble dannet. Hver tallerken kammer deretter fikk et totalvolum på 1,0 ml kulturmedium.
Western blotting
Cell kultursupernatanter ble samlet opp ved 48 timer. Vivaspin rør (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Tyskland) ble brukt for å samle proteiner fra supernatanten som hadde en høyere molekylvekt enn 30 kDa. Proteinkonsentrasjoner ble målt ved hjelp av en ikke-interfererende proteinanalysesett (Calbiochem, EMD Bioscience Inc., Darmstadt, Tyskland) ved anvendelse av et bovint serumalbumin (BSA) standardkurve (Bio-Rad Laboratories, Munchen, Tyskland)
et anti-MMP-1-antistoff produsert i mus ble anvendt (Sigma-Aldrich Saint Louis, USA) med et geit anti-mus IgG sekundært-HRP-antistoff (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Tyskland). 40 ug protein fra hver prøve ble fortynnet med prøvebuffer, mens DDH
2o ble tilsatt til et endelig volum på 35 ul. Membranene ble blokkert i blokkeringsbuffer ved romtemperatur i minst 1 time, og derefter inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C. De primære antistoffer ble fortynnet 1: 200 i blokkeringsbuffer. Membranene ble inkubert med fortynnet 1: 5000-HRP-konjugerte sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur, den neste dag. Bilder ble analysert ved hjelp av bildeleser LAS-R programvare (Leica Microsystems, Tyskland). IOD (integrert optisk tetthet) verdier ble generert /analysert med Gel-pro analysator programvare (Media Cybernetics USA).
HCC og makrofagceller
Celler ble vasket to ganger ved hjelp av forvarmet (37 ° C) PBS for å fjerne eventuelt gjenværende cellekulturmedium. Vi så tilsatt 10 ml forvarmet (37 ° C) CFDA SE Cell Tracer arbeidsløsning (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). Cellene ble deretter inkubert i 15 minutter ved 37 ° C. Vi deretter erstattet lasteløsning med frisk, forvarmet medium og inkuberes kulturene i ytterligere 30 minutter ved 37 ° C. Denne teknikken farget HCC, makrofagceller, og MRC-5-celler i 3D-kollagen-gel modellen beskrevet tidligere. Etter 48 timer av co-kultur, ble celle morfologi observert av konfokalmikroskopi.
Frysesnitt av kollagen gels farget med Phallotoxins og DAPI
Frosne seksjoner ble utarbeidet etter 48 h av 3D kollagen gel co-kulturen, og prøvene ble montert på dekkglass ved romtemperatur i 30 min. Prøvene ble så vasket tre ganger med PBS i 3 minutter hver gang. Prøvene ble deretter fiksert i 3,7% formaldehyd i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble så vasket ytterligere tre ganger med PBS. Hver dekkglass ble deretter plassert i en glasspetriskål og ekstrahert med en oppløsning av 0,1% Triton X-100 i PBS i 3 til 5 minutter og vasket igjen tre ganger med PBS. Når farging med fluorescerende phallotoxins (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland), fortynnet vi 5 pl metanol lager løsningen i 200 mL PBS for hver dekk å være farget. For å redusere ikke-spesifikk bakgrunnsfarging med disse konjugater, la vi til 1% BSA til flekken løsning. Dekk hvor deretter plassert i fargeløsning i 20 minutter ved romtemperatur. Etter farging ble objektglassene vasket tre ganger med PBS. Kontra ble utført med DAPI (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland). DAPI stamoppløsning ble fortynnet til 300 nM i PBS, og ca 300 ul av denne DAPI fargeløsning ble tilsatt til dekk fremstillingen, helt dekker Dekkglass. Objektglassene ble inkubert i 1-5 minutter og skylt tre ganger i PBS i 10 min. Prøvene ble deretter avbildes ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Prøvene ble lufttørket, montert og lagret i mørke ved 2-6 ° C.
Elisa
Cell kultursupernatanter ble samlet opp ved forskjellige tidspunkter, og lagret ved -20 ° C . En human MMP-1 ELISA-kit (Sigma-Aldrich Saint Louis, USA) og human VEGF DuoSet ELISA-sett (R 0,05 betegner en statistisk forskjell.
Resultater
Uttrykk av MMP-1 i 3D mono- eller co-kultur lungekreft modeller
HCC, MRC-5, og makrofag co -Kultur grupper, sammen med MRC-5, HCC, og makrofag mono-kulturgrupper ble dyrket i 10% FBS og O
2, slik som beskrevet i fremgangsmåtene. Hver gruppe hadde 2 x10
5-celler sådd, og forholdet mellom HCC, MRC-5, og makrofager i ko-kulturen gruppe var 5: 5: 1, og den HCC og MRC-5 ko-kultur gruppe var 1 .: 1
var høyere enn i HCC og MRC-5 co- Etter 48 timer, uttrykket av MMP-1 i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe (1337,00 ± 42.43) kultur gruppe (1166,25 ± 56,21), som var også høyere enn den MRC-5 monokultur gruppe (991,50 ± 19,09) og var signifikant høyere enn den HCC (284,00 ± 18,38) og makrofag (98,50 ± 7,12) mono-kulturgrupper. HCC og makromonokulturgrupper viste nesten ingen MMP-1 uttrykk. MMP-1 var signifikant høyere i co-kultur grupper enn monokulturgrupper (n = 3,
P
0,05, tabell 1 og figur 1A, oppdages av ELISA).
(A) uttrykk for MMP-1 i 3D mono- og co-kultur lungekreft modeller på 48 h oppdages av ELISA. Uttrykket av MMP1 i HCC MRC-5 makrofag ko-kultur gruppe var høyere enn i HCC MRC-5 co-kultur gruppe, eller MRC-5 /HCC /makromonokulturgrupper. Det var nesten ingen uttrykk for MMP1 i HCC /makrofag monokultur gruppe. (B) Uttrykk for MMP-1 i 3D mono- og co-kultur lungekreft modell på 48 h oppdaget av Western blotting. I figur 1B, en er molekylvekten av MMP-1 er 52 kD. Fra venstre til høyre, banene er: HCC monokultur gruppe (2 x 10
5 celler); MRC-5 monokultur gruppe (2 x 10
5 celler); MRC-5 og HCC co-kultur gruppe (2 x10
5 celler); HCC mono-kultur gruppe (1 x 10
6 celler); MRC-5 og HCC co-kultur gruppe (1 x 10
6 celler); MRC-5 monokultur gruppe (1 x 10
6 celler). Uttrykk av MMP-1 i co-kultur gruppene var høyere enn i mono-kultur grupper (begge 2 x 10
5 celler og 1 x 10
6 celler). Ekspresjon av MMP-1 i en x 10
6 cellegruppe var høyere enn 2 x 10
5 cellegruppe, uavhengig av mono-kultur eller ko-kultur gruppebetegnelser. I figur 1B, b, er de gjennomsnittlige IOD verdiene av Western blot er vist. (C) Uttrykk for MMP-1 under ulike co-kultur forhold. Ekspresjon av MMP1 underkant av 10% FBS og O
2 (10% FBS cellekulturmedium med O
2) var høyere enn det i henhold til w /o FBS og w /o O
2 (uten FBS og uten O
2) på 7 ulike tidspunkter. Videre til uttrykket trenden MMP1 under forutsetning av w /o FBS og w /o O
2 fortsatte nedgangen fra 120 h.
uttrykk for MMP-1 ble ytterligere undersøkt av Western blot. HCC og MRC-5 monokulturgrupper og HCC og MRC-5 ko-kultur grupper ble delt i 2 x 10
5-celler og 1 x 10
6 cellegrupper, som beskrevet i fremgangsmåtene. Forholdet av HCC og MRC-5 ko-kultur gruppe var 1: 1. Vi fant at uttrykket av MMP-1 i co-kultur gruppene var høyere enn i mono-kulturgrupper, både i 2 x 10
5 cellegrupper og 1 x 10
6 cellegrupper. Videre er ekspresjon av MMP-1 i 1 x 10
6 cellegrupper var høyere enn 2 x 10
5 cellegrupper, uten hensyn til mono-kultur eller ko-kultur gruppe (n = 5, P 0.05, tabell 2 og figur 1B).
uttrykket av MMP-1 i en 3D co-kulturen lungekreft modellen under forskjellige co-kultur forhold
uttrykk for MMP- 1 i HCC og MRC-5 ko-kulturmodell ble analysert under forskjellige dyrkningsbetingelser: 10% FBS og O
2 (10% FBS cellekulturmedium med O
2), og med ingen (uten FBS og O
2) for å utforske effekten av å simulere hypoksi og sultet føtalt bovint serum tilstand på MMP-1 sekresjon. Cellekultursupernatanter ble samlet separat fra 3D co-kultur kollagen modeller på syv forskjellige tidspunkter fra 48 til 192 timer. Hver gruppe hadde et likt antall celler (2 x 10
5) med et forhold på 1: 1. Vi har funnet at ekspresjonen av MMP-1Med 10% FBS og O
2 var høyere enn ekspresjon uten FBS og O
2 for alle sju tidspunkter. Videre MMP-1 uttrykk uten FBS og O
2 falt 120-192 h (n = 3, P 0,05, tabell 3 og figur 1C).
Uttrykk av VEGF i 3D mono eller co-kultur lungekreft modeller
HCC, MRC-5, og makrofag co-kulturgrupper, sammen med MRC-5, HCC, og makromonokulturgrupper ble dyrket i 10% FBS og O
2, slik som beskrevet i fremgangsmåtene. Hver gruppe hadde 2 x10
5-celler podet og forholdet av HCC, MRC-5, og makrofager; ko-kulturen gruppe var 5: 5: 1, og HCC og MRC-5 ko-kultur gruppe var 1:. 1
HCC, MRC-5, og makrofag mono-kulturgrupper ble dyrket hver for seg, og cellekultursupernatanter ble samlet opp etter 48 timer. Vi fant at uttrykket av VEGF i HCC mono-kultur gruppe (241,97 ± 78,56) var betydelig høyere enn i MRC-5 monokultur (12.69 ± 5.46) og makrofag mono-kultur (13.65 ± 7.44) grupper (n = 3,
P
0,05, tabell 4 og figur 2A)
(A) uttrykk for VEGF i HCC, MRC-5, og makromonokulturer grupper.. Ekspresjon av VEGF i HCC mono-kulturgruppe var signifikant høyere enn ekspresjon i MRC-5 /makrofag-mono-kultur gruppe under 10% FBS og O
2 dyrkningsbetingelser. (B) Uttrykk for VEGF i HCC, MRC-5, og makro co-kultur gruppene sammenlignet med HCC monokultur gruppe. Uttrykk av VEGF i HCC MRC-5 Makrofag co-kulturen var høyere enn i HCC MRC-5 ko-kulturgruppe og den HCC mono-kultur gruppe dyrket med 10% FBS og O
2 i 48 timer. (C) Uttrykk for VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur grupper under ulike co-kultur forhold. Uttrykket av VEGF i celler dyrket w /o FBS (sultet av FBS, men med O
2), w /o FBS og w /o O (uten FBS og uten O
2)
2 var høyere enn det i 10% FBS eller O
2 (10% FBS cellekulturmedium med O
2), mens ekspresjonen av VEGF i de tre ulike tilstander først økes og deretter reduseres.
HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe, HCC og MRC-5 co-kultur gruppe, og HCC mono-kultur gruppe (som kontroll) ble dyrket separat, og cellekultursupernatanter var samlet på 48 timer. Uttrykket av VEGF i både HCC, MRC-5, og makrofag (492,84 ± 51,43) og HCC og MRC-5 (429,63 ± 54,13) co-kultur gruppene var høyere enn i HCC mono-kultur gruppe (208,31 ± 46,45). Ekspresjon av VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag samkultur gruppen var også høyere enn den HCC og MRC-5 ko-kultur gruppe (n = 3,
P
0.05, tabell 5 og figur 2B).
uttrykket av VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag 3D co-kulturen lungekreft modellen under forskjellige co-kultur forhold
HCC, MRC -5, og makro co-kultur grupper ble dyrket under tre ulike forhold: 10% FBS med O
2 (10% FBS cellekulturmedium med O
2), 0% FBS med O
2 ( sultet av FBS, men med O
2), og uten at begge (uten FBS og uten o
2). Cellekultursupernatanter ble samlet opp ved ti forskjellige tidspunkter. Vi fant at uttrykket av VEGF under forhold med 0% FBS og O
2 og uten både var høyere enn uttrykket i 10% FBS med O
2-gruppen, mens trenden med VEGF uttrykk i alle de tre forhold første økt, deretter redusert (n = 3,
P
0,05, tabell 6 og figur 2C).
2D og 3D co-kultur modell
En 3D kollagen gel co-kultur modellen ble etablert (fig 3A). Cellekulturmedium yret inn i kollagen gel, og de dyrkede celler ble suspendert i 3D-rom.
(A) 3D kollagen ko-kulturmodell. Fig 3A, en: 1,0 ml cellekulturmedium yret inn i kollagen-gel fra toppen, og de dyrkede celler ble suspendert i 3D-kollagen gel plass innenfor. Fig 3A, b: 0,5 ml kollagen gel ble bekreftet i enhver kultur tallerken rommet uavhengig. (B) Cell morfologi i 2D og 3D co-kultur modeller på 48 t. Fig 3B, en: Bilde av HCC celler og makrofager i 2D co-kultur modell. Pilspiss betegner en HCC cellen, som er flat og ikke-sfæriske. Arrowhead betegner makrofager rundt et HCC celle på 40X forstørrelse. Fig 3B, b: Bilde av HCC celler og makrofager i vår 3D co-kultur modell. Arrowhead betegner en HCC celle, som er subglobose og stikkende. Arrowhead betegner en makrofag. Dette bildet viser at disse celler er i kontakt med hverandre, som sett ved hjelp av cfda SE Tracker på et konfokalt mikroskop. (C) Bilder av HCC, MRC-5, og makro co-kulturer ved 48 og 168 timer på 40X forstørrelse. Fig 3C, a: makrofager kontakt og angrep HCC celler etter 48 h av co-kultur. Pilspisser betegne HCC, makrofag, og MRC-5 celler. Fig 3C, b: Co-kultur etter 7 dager. Som sett i dette bilde etter 7 dagers dyrking ble cellene begynte å løsne og flyte i mediet, etter å ha mistet sin vitalitet og normal cellemorfologi. De fleste HCC og makrofagceller var døde. (D) fluorescens mikroskop bilder av MRC-5, makrofag, og HCC i 3D-modellen. Fig 3D (øvre): Fluorescens-mikroskop-bilder av MRC-5, makrofag, og HCC kulturer (figur 3D, a). Celler ble farget med DAPI (figur 3D, c) og phallotoxins (figur 3D, b). Fig 3D (lavere): fluorescensmikroskop bilder av makrofager (figur 3D, d). Cellene ble farget med DAPI (Fig 3D, f) og phallotoxins (Fig 3D, e).
Cell morfologi i vår 2D og 3D-modeller ble sammenlignet (Fig 3B). I 2D ko-kulturmodell, formen av HCC celler var flat og ikke-sfærisk (fig 3Ba), mens i 3D-modellen, HCC celler ble subglobose og stikkende (Fig 3bb). Derfor, i form av HCC celler var dramatisk annerledes mellom 2D- og 3D-modeller.
I tillegg cellebilder samlet etter 48 h av co-kultur viste at makrofager hadde kontaktet og angrepet HCC celler (Fig 3ca), mens etter 7 dager med co-kultur vi kunne se celler som flyter i det mediet som mistet sin levedyktighet og hadde endret morfologi. Både HCC og makro populasjoner var stort sett døde (Fig 3CB). Fluorescens mikroskop bilder av frosne deler av MRC-5, makrofag, og HCC modell og 3D-makrofag-modellen ble også samlet inn (Fig 3D).
disscussion
Utfordringen i å utvikle nye målrettede terapier ligger i å etablere
in vitro
modeller som bedre gjenspeiler forholdene til stede
in vivo
. Tidlige 2D modeller tilgjengelig mekanistisk innsikt i grunnleggende NSCLC metastasering. Men disse modellsystemer ikke omfatter hele spekteret av signale redundans og /eller kompenserende mekanismer. 3D-celle co-kultur teknikker som bruker kreftceller i kombinasjon med stromale celler kan være en lovende vei til å bygge en mer representativ modell.
I vår studie har vi etablert en tredimensjonal co-kultur kollagen modell med lunge kreft adenokarcinomceller, lunge fibroblaster, og immunceller (makrofager). Denne modell ble utviklet for å utforske svulsten mikromiljøet og samspillet mellom lungekreft og stromale celler under prosessen for lungekreft invasjon og metastase. Roskelley et al. og Mitragotri et al. fant at celler dyrket i et 3D-matrise viste dramatisk forskjellige egenskaper med hensyn til proliferasjon, differensiering, morfologi, og cellulær funksjon [14, 15]. Tilsvarende fant vi at morfologi HCC lunge adenokarcinomceller var signifikant forskjellig mellom 2D- og 3D-co-kultur-modeller. I 2D co-kultur modell, ble formene til HCC celler flatet og plateliknende, liggende på bunnen av cellekultur fatet, mens i 3D-modellen, HCC celler var subglobose og stikkende. Denne 3D co-kulturen kreft modell lunge ikke bare gir en ekstracellulær matrise for lungekreft celler, noe som er avgjørende for deres form og funksjon, men det ser også ut til å bedre simulere bomiljø og cellulære interaksjoner som oppstår
in vivo
.
i vår studie fant vi at MMP-1 nivåene var nesten umulig å oppdage i HCC og makromonokultur grupper. VEGF-nivåer var også nesten umulig å oppdage i MRC-5 og makrofager monokultur gruppe, selv om både MMP-1, og VEGF ble rikelig uttrykt i ko-kulturer av disse celler. Disse funnene viser samspillet mellom lungekreft og stromale celler er viktig for ekspresjon av disse markører for metastasering. Videre er uttrykk for både MMP-1, og VEGF var høyest i modellen som kombinerte alle tre celletyper (HCC, MRC-5, og makrofager), til og med høyere enn nivåene i den doble kultursystem med HCC og MRC-5. Våre funn tyder også på at makrofager i 3D co-kultur modeller ikke bare øke uttrykket av MMP-1, men også forbedre evnen til lungekreft celler for å fremme angiogenese. Men i løpet av prosessen med co-kultur, fant vi at makrofagene også angrepet og drept HCC celler. Denne observasjonen antyder at funksjonen av makrofager i lungekreft, kan være en «tveegget sverd», hvor de utviser både anti-tumor og tumor-fremmende effekter som er relevante for invasjon, metastase, og lungeskader. Enkelte rapporter har knyttet en overflod av tumorassosierte makrofager (TAM) med en dårlig pasient prognose [16, 17]. Thomsen et al. rapporterte at sigarettrøyking forårsaker en inflammatorisk reaksjon i lungene som rekrutterer inflammatoriske celler, og følgelig endre cytokinsekresjon på en slik måte som fører til en predisposisjon for lungekreft [18]. Shaked et al. viste at benmarg-avledede celler, slik som lymfocytter, makrofager, neutrofiler, og mastceller (MCS) er ofte rekruttert til lungen i respons til lungeskade; sammen med fibroblaster, endotelceller og pericytes, immunceller ser ut til å bidra til å kondisjonere tumor mikromiljøet (TME) [19].
Tumor microenvironmental oksygenmangel (hypoksi) øker også den ondartede oppførselen til kreftceller, delvis via hypoksi-induserbar faktor (HIF) familie av transkripsjonsfaktorer. HIFs regulere ekspresjonen av EMT-genene, så vel som fremmer angiogenese, celleformering, og vev remodellering [20]. I denne studien, vi har oppdaget uttrykk for VEGF i HCC, MRC-5, og makrofag co-kultur gruppe under tre ulike forhold: 10% FBS med O
2 (normal tilstand), 0% FBS med O
2 (sultet av føtalt bovint serum, men med O
2), og 0% FBS uten O2 (simulere hypoksi og serum sult forhold). Vi har funnet at ekspresjonen av VEGF i henhold hypoksi eller serum sult var høyere enn under normale betingelser etter 72 timer med ko-kultur, mens utviklingen i VEGF-ekspresjon viste en innledende økning, etterfulgt av en tilsynelatende reduksjon. Dette kan være på grunn av HCC celledød over tid mediert av makrofagene, noe som forårsaket et latent reduksjon av VEGF-ekspresjon. Som også underforstått, i tillegg til hypoksi, kan sult forholdene fremme uttrykk for VEGF
in vitro
. Men i HCC og MRC-5 ko-kultur gruppe, som ble brukt for å sammenligne ekspresjon av MMP-1 i henhold til hypoksi eller serum sult med normale forhold, viste ingen signifikante forskjeller i ekspresjon. Vi tolket dette til å bety at verken hypoksi eller serum sult er faktorer som påvirker uttrykket av MMP-1. Videre er uttrykk for MMP-1 under disse forholdene kontinuerlig falt over 120 h eksperiment. En forklaring kan være at cellene oppbrukt de nødvendige næringsstoffene i kulturmediet og /eller lavt oksygen spenning forårsaket dem til å vokse dårlig og /eller stoppet celledeling.
Det er tid til å revurdere dagens 2D-modellene som brukes å teste lunge kreftbehandling som svulsten mikromiljøet, tilstedeværelse av stromale celler, ECM-komponenter, og signalmolekyler i stor grad påvirke utseende, helse og aktiviteter kreftceller. Vi foreslår at en bedre tilnærming ville være å ingeniør behandling som er også rettet mot tumor-mikromiljøet og stromale celler, som også er viktig for metastasering og angiogenese. Terapi rettet mot bare og arbeider direkte på lungekreft celler kan ikke være så effektive, fordi de ikke klarer å håndtere viktige faktorer involvert i tumorprogresjon. Lungekreftceller er heterogene, og de har forskjellige histologiske egenskaper, sammen med det faktum at de er genetisk ustabil under progresjon av sykdommen; alle disse er viktige årsaker til svikt i lunge kreft behandlinger som fokuserer på svært spesifikke mål på lungekreft celler. I tillegg er en høy grad av resistens følger vanligvis terapier rettet direkte til tumorceller. Oppsummert ser vi fordelene av behandling rettet mot svulsten mikromiljøet og stromale celler: 1) de ikke målrette en bestemt aspekt av svært variabel tumorceller, 2) de målet stromale celler, som besitter en stabil genetisk bakgrunn og arve stabilitet, og 3) stromale celler er mindre utsatt for genetiske mutasjoner og medikamentresistens, men de har en viktig innvirkning på tumorprogresjon og metastase, slik at inhibering av deres funksjon kan effektivt redusere eller stoppe tumorprogresjon /sprednings.
Konklusjoner
svulstens mikromiljø består av kreftceller, interstitiell celler, cytokiner og chemokiner. Vanligvis er de interstitielle celler, innbefattende fibroblaster, immunceller, endotelceller, og umodne celler som stammer fra benmargen. Med fokus på å forstå hvordan den interstitielle celler funksjon i svulsten mikromiljøet kan føre til forbedringer i anti-kreft terapi. Vårt arbeid har vist at morfologi HCC celler er signifikant forskjellig mellom 2D- og 3D-co-kultur-modeller. Ekspresjonen av MMP-1, og VEGF blir oppregulert i 3D co-kultur modeller sammenlignet med monokultur modeller, noe som viser at interaksjonen mellom lungekreftceller og stromale celler kan ha en viktig rolle i aktivering og fremmer metastase. I 3D-ko-kultur lungekreft modell, simulerte hypoksi og sult tilstander indusert sekresjon av VEGF, men ikke MMP-1. Makrofager i svulsten mikromiljøet kan tjene to roller i å angripe kreftceller, mens også upregulating signalveier som hjelpemiddel i tumorinvasjon og metastasering.
Outlook
Terapi rettet mot stromale tumorceller kan representere en mer effektiv tilnærming til bekjempelse av kreft. Men lite er foreløpig kjent om samspillet mellom stromale og tumorceller;
