Abstract
adenovirus (ADS), spesielt HAdV-5, har blitt genetisk utstyrt med tumor-begrenset replikering potensial til å aktivere programmer i onkolytiske kreftbehandling. Slike onkolytiske adenoviruses har blitt godt tolerert hos kreftpasienter, men deres anti-tumor effekt må styrkes. I denne forbindelse bør det tas i betraktning at kreftcellene, avhengig av deres vev av opprinnelse, kan avvike betydelig fra de normale vertsceller til hvilke annonser som er innrettet med komplekse virus-vert interaksjoner. Følgelig viral replikasjon effektivitet, en viktig determinant for onkolytisk aktivitet, kan være suboptimal i kreftceller. Derfor har vi analysert både replikering kinetikk HAdV-5 og virus-indusert transkriptomet i humane bronkiale epitelceller (HBEC) i forhold til kreftceller. Dette er den første rapporten om genom-wide uttrykk profilering av annonser i hjemvertsceller. Vi fant ut at E1A uttrykk og utbruddet av viral genom replikering er raskest i HBEC og betydelig forsinket i melanomceller. I plateepitelkarsinom lunge carcinoma celler, observerte vi mellom HAdV-5 replikering kinetikk. Infeksiøs partikkel produksjon, viral spredning og lytisk aktivitet av HAdV-5 ble svekket i melanomceller kontra HBEC. Ekspresjon profilering ved begynnelsen av virusgenomet replikasjon viste at HAdV-5 induserte de sterkeste endringer i den cellulære transkriptomet i HBEC, etterfulgt av lungekreft og melanomceller. Vi identifiserte fremtredende regulering av gener som er involvert i cellesyklus og DNA-metabolisme, replikasjon og pakking i HBEC, som er i samsvar med nødvendigheten av å indusere S-fasen for viral replikasjon. Påfallende, i melanomceller HAdV-5 utløst motstående regulering av nevnte gener og, i motsetning til lungekreftceller, ble det ikke svak S-fase induksjons detektert ved bruk av E2F-promoteren som reporter. Våre resultater gir en begrunnelse for å forbedre onkolytiske adenoviruses enten ved tilpasning av virusinfeksjon å målrette kreftceller eller ved å modulere tumorcellefunksjoner for å bedre støtte virusreplikasjon
Citation. Dorer DE, Holtrup F, Fellenberg K, Kaufmann JK , Engelhardt S, Hoheisel JD, et al. (2011) Replication og virus-indusert transkriptomet av HAdV-5 i Normal vertsceller versus kreftceller – Forskjeller med relevans for Adenoviral Oncolysis. PLoS ONE 6 (11): e27934. doi: 10,1371 /journal.pone.0027934
Redaktør: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, USA
mottatt: 28 juni 2011; Godkjent: 28 oktober 2011; Publisert: 30.11.2011
Copyright: © 2011 Dorer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Helmholtz Association of National Research Centers (Helmholtz-universitetet Gruppe Grant), den egenutført Program for den tyske Cancer Research Center (DKFZ, Deutsches Krebsforschungszentrum) og av stipend fra Helmholtz International Graduate School for kreftforskning å ded, FH, og JKK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
adenovirus (annonser) dukker kreftbehandling basert på deres styrke til å infisere og lyse kreftceller, en prosess kalt viral oncolysis [1], [2]. Dette regimet har en unik forsterkning effekt som infiserte tumorceller produserer avkom virus som spres infeksjon i svulsten. En ytterligere fordel er at den virkningsmåte av onkolytiske Ads skiller seg fra konvensjonell behandling, til hvilken kreftceller ofte utvikle resistens. Begrensning av virusreplikasjon til kreftceller er i hovedsak kreves for bruk av annonser i kreftbehandling. I denne forbindelse, omfattende kunnskap om Ad struktur, genom organisasjon og replikasjonssyklus kombinert med teknologi for Ad teknikk muliggjør rasjonell utvikling av onkolytiske annonser [2], [3]. Faktisk har onkolytiske virus med enestående svulst selektivitet blitt utviklet basert på det nært beslektede HAdV-2 og HAdV-5. Dette ble oppnådd enten ved å mutere genet funksjoner som er supplert i kreftceller, men ikke i normale celler, eller ved å målrette ekspresjonen av essensielle virale gener til tumorceller [1], [2], [4]. Flere kliniske studier har vist at slike konstruerte annonser er godt tolerert av pasienter, men at deres terapeutiske styrken trenger forbedring [5], [6]. I denne sammenheng er det mulighet for rasjonell prosjektering av annonser igjen en viktig fordel som det forenkler utviklingen av avanserte onkolytiske agenter. Tilsvarende studier for å forbedre Ad innreise til kreftceller eller å sette terapeutiske gener inn onkolytiske annonser er rapportert [2], [7], [8].
Adenoviral oncolysis nødvendig effektiv Ad replikasjon i målrettede kreftceller. Tidligere arbeid på feltet har ikke tilstrekkelig vurdert at kreftceller, avhengig av vev av opprinnelse, kan variere betydelig fra normale Ad vertsceller. Dermed gjør viruset ikke kommer over mobilnettet miljø det er tilpasset etter omfattende virus-vert celle interaksjoner. I følge Ad replikering, kan cellelyse og spredningen være suboptimal. Spesifikt HAdV-2 og -5 er evolusjonære innrettet til å replikere i epitelceller i luftveiene [9], men det er under utvikling for behandling av et bredt spekter av tumor mål. Faktisk mutasjoner av HAdV-5 som øker virusreplikasjon og spredning i tumorceller er blitt rapportert [10] – [12]. Et eksempel er sletting av
E1B19K
, som har anti-apoptotiske aktivitet. Sletting av
E1B19K
har resultert i sterkt økte HAdV-5 replikering og oncolysis i lunge kreftceller. Imidlertid har redusert replikasjon blitt rapportert i kreftceller avledet fra andre vev inkludert melanomceller [11], [13] – [15]. Disse observasjonene igjen peker på celletype avhengighet av Ad-vertscelleinteraksjoner, og følgelig Ad replikasjon effektivitet: Forskjeller i apoptose programmeringen mellom normale celler og kreftceller, men også mellom ulike kreftceller mest sannsynlig føre til forskjellig permissivity til
E1B19K
-deleted HAdV-5.
Som obligatoriske intracellulære parasitter annonser er avhengig av mobilnettet energiproduksjon og biosyntetiske maskiner. Faktisk har annonser implementert varierte og intrikate molekylære mekanismer for å etablere forhold i vertscellen som sikrer effektiv virus reproduksjon. Disse er best undersøkt for HAdV-2 og -5 ([16], [17] og referanser deri). Tilsvarende produkter av tidlig viral genekspresjon – foruten å gi proteiner som er nødvendige for replikasjon av det virale genomet – manipulere cellemiljøet for virusreplikasjon ved flere mekanismer, særlig ved direkte eller indirekte modulering av cellulær transkripsjon ([17] – [19] og referanser deri). Den første virale genet uttrykt under Ad infeksjon er E1A, som koder for en familie av proteiner som følge av alternativ spleising. E1A proteiner indusere ekspresjon av ytterligere tidlig Ad-gener og manipulere transkripsjonen av cellulære gener som direkte eller indirekte [20], [21]. Den største E1A protein (13S) inneholder en potent trans domene som induserer transkripsjon når E1A samhandler med DNA-bindende proteiner. Begge 13S og 12S E1A proteiner binde til pRb, noe som resulterer i utslipp av E2F transkripsjonsfaktorer fra pRb-E2F komplekser. E2F-proteiner så aktivere transkripsjon av virale og cellulære gener via E2F-bindende seter ([17], [19], [22], [23] og referanser deri). E2Fs allment indusere cellulære gener som er involvert i S-fasen av cellesyklusen, som også er nødvendig for Ad genomreplikasjon. Ytterligere transkripsjonelle aktivitet av E1A proteiner medieres ved interaksjon med et panel av cellulære faktorer som hemmer eller aktiverer transkripsjon, for eksempel histon acetylaser ([17] og referanser deri). En annen annonse tidlig protein, E1B55K, inneholder en sterk transkripsjon undertrykkelse domene. Ved binding til p53 transaktivering domenet den funksjonelt p53 skifter fra en transkripsjonen aktivator i et repressor [24]. Videre E1B55K sammen med E4ORF6 trigger degradering av p53 [25]. Den resulterende avstenging av p53-responsive pro-apoptotiske gener motvirker induksjon av apoptose utløst av unormal stimulering av cellesyklus ved E1A.
Den enestående kunnskap om Ad-infeksjon har blitt vunnet av omfattende studier som var for det meste utføres med HAdV-2 eller -5 i HeLa og andre kreftceller og fokusert på enkeltannonse gener [17]. Således, Ad infeksjon i sitt normale miljø av naturlige vertsceller, f.eks primære epitelceller i luftveiene for HAdV-5, har vært sjelden studert (de fleste av disse studiene analyserte selektivitet onkolytiske annonser, se diskusjon). Legg merke til at HeLa-celler som skiller seg fra de normale Ad vertsceller, ettersom de er av livmorhalskreft sted har blitt omfattende passert. Dessuten inneholder de menneskelige papilloma virus gener som påvirker cellefunksjoner viktige for Ad replikering. Studier som undersøker hvordan enkelt Ad gener påvirker cellefunksjoner ikke anser det komplekse nettverket av virus-vert interaksjoner ved virusinfeksjoner. I denne forbindelse, representerer mikromatriser et kraftig verktøy for genome-wide overvåking av omprogrammeres mobil genuttrykk under Ad infeksjon. Faktisk har tidligere microarray studier viste at HAdV-2 og -5 infeksjoner målrette flere cellulære veier [26] – [30]. Disse studiene er utført med HeLa-celler og primære fibroblaster. Hvordan Ad infeksjoner modulere genom-wide genuttrykk av sine opprinnelige vertsceller er ikke undersøkt hittil. Følgelig en komparativ analyse av Ad-induserte genuttrykk profiler av tumorceller kontra innfødte Ad vertsceller, som er av interesse for utvikling av onkolytiske annonser, er ikke tilgjengelig ennå.
I denne studien har vi derfor utforsket hvordan Ad infeksjon av kreftceller skiller seg fra Ad infeksjon av sine vanlige vertsceller. For å oppnå dette, utførte vi en komparativ analyse av HAdV-5 replikering kinetikk og lytisk aktivitet i grunnskolen bronkial epitelceller, lunge plateepitelkarsinom celler og melanomceller. Vi valgte dette settet av celler, som de representerer normale HAdV-5 vertsceller, celler av tumorer avledet fra HAdV-5 vertsceller og tumorceller avledet fra en ikke-relatert celletype, respektivt. Vi utførte deretter genom-wide ekspresjonsanalyse av HAdV-5-infeksjon hos normale bronkiale epitel-celler og tumorceller. Celletype-avhengige forskjeller i HAdV-5-induserte cellulære transcriptomes ble vurdert av bioinformatiske analyse.
Resultater
Lytisk potens og replikering effektiviteten av HAdV-5 i normale humane bronkiale epitelceller og kreft celler
Vi først vurdert om effektiviteten av HAdV-5 spread-avhengig cellelyse og replikering variere mellom innfødte HAdV-5 vertsceller og kreftceller. Primære humane bronkiale epitelceller (HBECs) ble anvendt i vårt studium som de representerer de native HAdV-5 vertsceller av respiratorisk epitel tettest. De ble sammenlignet med lungekreft celler SK-MES-1, SW900 (både plateepitelkarsinom) og A549 (adenokarsinom), til melanom celler SK-MEL-28 og Mel624, og for ytterligere humane primære normale celler, nemlig fibroblaster og keratinocytter . I en cytotoksisitet assay, observerte vi at spredningen-avhengig cellelysering ved HAdV-5 var tilsvarende effektiv i HBECs, SW900 og A549-celler, men dempes i SK-MES-1-celler, og enda mer i de to melanomcellelinjer (Fig. 1A ). Cytotoksisiteten av HAdV-5 for keratinocytter var lik HBECs, mens ingen celle-dreping ble observert for primære fibroblaster ved måletidspunktet. Disse resultatene viser klart at lytiske potens av HAdV-5 er celletype-avhengige og kan bli sterkt redusert hos kreftceller, sammenlignet med HBECs. Av notatet, redusert lytisk styrken av HAdV-5 i SK-MEL-28 og Mel624 celler kan ikke tilskrives ineffektiv viral cellebinding og oppføring, fordi disse cellene viste sterkt uttrykk av HAdV-5 reseptor CAR (Fig. S1) og var enda mer mottagelig for transduksjon av et replikasjonsdefekt HAdV-5 vektor enn HBECs, A549 og SW900-celler (Tabell S1). Dette er klare bevis for at redusert lytisk aktivitet av HAdV-5 i melanomceller blir bestemt på et post-stigtrinn av virusreplikasjon. I motsetning til dette, manglet fibroblaster CAR ekspresjon og var vanskelige å transdusere. Som cellene ble farget 8 dager etter infeksjonen, som gjør det mulig for flere runder med virusreplikasjon, resultatene av cytotoksisiteten analysen indikerer forskjeller i effekt av HAdV-5 replikasjon og fordelt mellom melanomceller og HBEC. Derfor vi neste forhold HAdV-5 replikering i HBECs, SW900 og SK-MEL-28 mer direkte ved kvantifisering av smittsomme viruspartikkel produksjon i løpet av en runde med replikering (Fig. 1B). Infeksiøs virus partikkel produksjon av HBECs var 100 ganger høyere enn for SK-MEL-28 på 36 timer og 48 timer etter infeksjon. Virustitere toppet for HBEC etter 48 timer, mens de fortsetter å øke helt til 72 timer for SK-MEL-28, når de nådde en titer likevel lavere enn for HBECs. Smittsomme partikkel produksjon av SW900 celler viste lignende kinetikk til HBECs, men forble ca 10 ganger lavere. Vi konkluderer med at HAdV-5 replikasjon forsinkes i SK-Mel-28-celler, sammenlignet med HBECs og SW900-celler, noe som er i samsvar med de cytotoksiske data
(A) Cytotoksisitet:. Forskjellige celletyper ble infisert med enten villtype HAdV-5 (
wt
) eller replikering-mangelfull kontroll virus HAdV-5 CMV-GFP (
GFP
) på mois av 10
1 til 10
-4 TCID
50 /celle. Celler ble primære humane bronkiale epitelceller (HBEC, celler fra en av to givere som gir tilsvarende resultater er vist) plateepitelkarsinom i lungene (SK-MES-1, SW900), lunge adenokarsinom (A549), melanom (SK-MEL -28, Mel624) primære humane forhud fibroblaster (HFF) og primære humane keratinocytter (PHK). Etter inkubering i åtte dager, ble overlevende celler fiksert og farget med krystallfiolett. Lungeceller (
venstre paneler
) viste samlet sterkere cytotoksisitet mot melanomceller (
midterste panelene
). (B) Replication: HBEC, SW900 eller SK-MEL-28 celler ble infisert med en TCID
50 /celle av HAdV-5. Etter en time inkubering ble Inokulant fjernet og cellene ble vasket tre ganger. Celler og supernatanter ble høstet ved angitte tidspunkter og infeksiøse viruspartikler ble kvantifisert ved bestemmelse av TCID
50. Barer utsendte av tredoble infeksjoner og feilfelt standardavvik. Stjerner indikerer statistisk signifikans (
p≤0.05
) av forskjeller mellom SK-MEL-28 og HBEC samt SK-MEL-28 og SW900 (*), eller mellom SW900 og HBEC (**). Økning av viral titere var signifikant (
p≤0.05
) for HBEC inntil 48 timer og for SK-MEL-28 til 72 timer etter infeksjon. For SW900 virustiter viste ingen signifikant økning etter 36 h (
p = 0,056 for 48 timer versus 36 h
).
Kinetics av viral genekspresjon og genom replikering av HAdV-5 i HBECs og kreftceller
neste undersøkt kinetikken av HAdV-5 replikasjon i HBECs og kreftceller i mer detalj ved kvantifisering av viral genekspresjon og genomreplikasjon (fig. 2). Ettersom disse forsøk ble anvendt for å definere tidspunktet for etterfølgende genekspresjon profilering, de ble utført med de tilsvarende standardiserte prosedyrer, det vil si celler som ble dyrket i microarray vekstmedier og infisert med virus titer som resulterer i 80% infeksjonseffektivitet for hver celletype (tabell S1). Utbruddet av viral DNA replikasjon ble forsinket i melanomceller (SK-MEL-28, 20 t, Mel624, 24 h) og SK-MES-1 celler (20 h) sammenlignet med SW900 celler (16 h) og HBEC (16 timer eller 12 timer, avhengig av donor) (fig. 2B). Primære fibroblaster viste en sen (24 h), men primær keratinocytter en tidlig (16 h) inntreden av viral DNA replikasjon. Disse forskjellene i HAdV-5 replikasjonskinetikken mellom celletypene korrelerte godt med forskjeller på viral lysering og infeksiøs partikkel-produksjon (se fig. 1). Analyse av E1A mRNA uttrykk kinetikk viste at forskjellene i utbruddet av DNA replikering mellom celletypene gjenspeile tilsvarende forskjeller i tidlig genekspresjon: HBEC, SW900 og keratinocytter viste en hurtig innsettende E1A mRNA uttrykk nådde nesten maksimalt nivå på åtte timer etter infeksjon . I motsetning, for melanomceller, SK-MES-1 og fibroblaster en mer langsomt og kontinuerlig økning i E1A mRNA-ekspresjon ble observert (fig. 2A). Årsaken til forskjellene i E1A uttrykk mellom cellelinjer er uklare. Forbigående transfeksjon eksperimenter med en reporter plasmid som inneholder den første 557 bp av HAdV-fem genom avdekket ikke store forskjeller i E1A enhancer /promoter aktivitet mellom celletyper (Fig. S2). Sen viral genekspresjon speilet kinetikken til viral genom replikasjon, som forventet (fig. 2C). Vi konkluderer med at HAdV-5 replikering og lyse er betydelig raskere i HBECs enn i melanomceller. Replikasjon og lysis i lungekreftceller er avhengig av den cellelinjen, hurtig eller mellomprodukt. For andre primære celler, replikering kinetikk var avhengig av celletype: epiteliale keratinocytter viste raske og mesenchymale fibroblaster, som rapportert før [27], [30], viste langsomme replikering kinetikk
Menneskelige primære celler (
venstre paneler
) og tumorcellelinjer (
høyre panel
) ble infisert med HAdV-5 på titers resulterer i 80% infeksjon effektivitet (
se
fig. 1
for navn på celletyper, HBEC d1, HBEC d2 er HBEC fra forskjellige givere
). Inokulant ble fjernet etter en times inkubasjon. Totalt RNA og DNA ble høstet for hver angitte tidspunkt og ble analysert for E1A (A) og fiber (C) mRNA-nivåer og for virale genomet kopier (B), henholdsvis, etter qPCR. Resultater av representative eksperimenter er vist; repetisjon eksperimenter ga identiske tidspunkter for utbruddet av E1A og fiber mRNA uttrykk og virusgenom replikering. For HBEC d2, ble genom kopiantall ikke bestemt 20 timer og 24 timer, på grunn av begrenset antall celler fra donor.
Komparativ analyse av HAdV-5-indusert endringer i mobilnettet genuttrykk i kreftceller kontra HBECs
Vi neste undersøkt om mobil genuttrykk er ulikt påvirket av Ad infeksjon i kreft versus normale celler. Derfor utførte vi en komparativ analyse av HAdV-5 infeksjonsutløst endringer i transcriptomes av HBECs (2 forskjellige donorer), squamous celle lungekreftceller (SK-MES-1, SW900) og melanomceller (SK-MEL-28, Mel624 ). Cellene ble dyrket ved hjelp av standardiserte forhold og media (se Materialer og metoder for detaljer) og ble infisert med HAdV-5 på titere som resulterer i 80% transduksjon effektivitet for hver celletype eller var mock-smittet. Cellene ble høstet på tidspunktet for start av viralt genom replikasjon, fordi på den tiden viktige endringer i den cellulære transkriptomet i fremstillingen av viral DNA replikasjon var forventet. Videre har tidligere undersøkelser vist seg mindre forandringer på tidligere tidspunkter for andre celler [27], [28], [30]. Ved å velge dette tidspunkt for hver celletype individuelt, i samsvar med kinetikken er vist i fig. 2, vi kunne justere for forskjeller i virusreplikasjon kinetikk mellom celletyper. Totalt RNA ble renset og anvendt for ekspresjon profilering. Microarray data er tilgjengelig online på ArrayExpress databasen (tiltredelse antall E-MEXP-3125). Under bioinformatiske analyse gen-ekspresjon i ikke-infiserte prøvene ble definert som stabil tilstand og i forhold til genekspresjon nivåer i infiserte prøver. Dermed bestemte vi den virusinduserte celle transkriptomet, dvs. infeksjon spesifikke genuttrykk endringer for hver celletype individuelt uten å skape en skjevhet gjennom inter-celletype variasjoner av ulike genetiske bakgrunn (se Materialer og metoder for detaljer).
Vi fant de sterkeste endringer i genekspresjon etter HAdV-5-infeksjon i HBECs, etterfulgt av lungekreftceller, mens genekspresjon var mye mindre påvirket av HAdV-5-infeksjon hos melanomceller (se også korrespondanseanalyse i fig. S3). Både antall cellulære gener i betydelig grad reguleres av HAdV-5-infeksjon (tabell 1) og brette endringer i genekspresjon (ArrayExpress, E-MEXP-3125) var høyest for HBECs og var lavest for melanomceller. Disse resultatene korrelerer med replikering effektiviteten av HAdV-5 for disse cellene: HBECs viste både mest effektive HAdV-5 replikering og sterkeste virus-indusert genekspresjon, mens for melanom celler både replikasjon effektivitet og virusinduserte endringer i genuttrykk var lavest.
Som uttrykk profilering av Ad infeksjon av normale puste epitelceller ikke har blitt rapportert før, må vi først vurderte HAdV-5-indusert celle transkriptomet i HBEC. Våre resultater viser induksjon av gener involvert i DNA-replikasjon og cellesyklus, kromatin organisasjon, og nukleotid-metabolisme, mens gener involvert i differensiering, regulering (mest negative) av proliferasjon, og celledød regulering ble undertrykt (Tabell 2 og Tabell S2).
Deretter sammenlignet vi genekspresjonssignaturer av HAdV-fem infeksjon i HBECs og kreftceller ved ulike bioinformatiske analyser. Hierarkisk gruppering av differensielt regulerte gener av de fem analyserte celletypene fremhevet to klynger av gener som viser motstående regulering i melanomceller versus HBECs, dvs. gener som er indusert i HBECs, men undertrykket i en eller begge av melanomcellelinjer (innrammet i figur . 3A, forstørret i fig. S4). Interessant, viser større klynge en svært signifikant akkumulering av gener involvert i DNA-replikasjon, nukleotid-metabolisme, cellesyklusregulering og DNA-skade respons (fig. 3B), som også ble funnet i mindre klyngen (her betydningen av akkumulering ble ikke nådd, fordi av det lille antallet gener). Utvalgte gener er oppført i tabell 3. Disse cellulære funksjoner har vært mye rapportert å bli indusert av Ad-infeksjon [17], og disse klyngene inneholder flere av genene sterkest indusert i HBECs (se tabell 2). Dermed er det slående at HAdV-5 klarer å indusere eller ofte undertrykker selv disse genene /cellulære funksjoner i melanomceller. De genuttrykk data innhentet av microarray analyse ble validert av kvantitativ PCR (Fig. S5). Som en ytterligere bioinformatikk tilnærming til å identifisere cellulære veier mest ulikt regulert av HAdV-fem infeksjon av melanomceller kontra HBECs utførte vi Oppfinnsomhet pathway analyse av genuttrykk data. Vi identifiserte G1 /S overgang regulatoriske nettverk med viktige pro-S fase gener (
E2F
,
CCNE
,
CDK2
,
Cdc25A
) Induced i HBECs, men undertrykt eller ikke regulert i melanomceller (fig. S6). Vi konkluderer med at HAdV-fem infeksjon av melanom celler ikke klarer å indusere et panel av S-fase gener involvert i cellesyklusregulering, nucleotide metabolisme og DNA replikasjon og reparasjon, noe som er indusert i de innfødte HAdV-5 celler, HBEC.
(A) Hierarkisk clustering av gener ved hjelp av Multi-Experiment Viewer (
MeV 4.5.1
) basert på ca. 1000 mest betydelig regulerte gener (
se
Materialer og metoder
for datafiltreringskriterier
). Klynger av gener som viser motstridende regulering av HAdV-fem infeksjon i HBEC versus melanomceller er innrammet. Forstørrelser av disse klyngene er presentert i fig. S4. (B) Lister over gener innenfor klyngen to ble utsatt for genet ontologi analyse ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (
DAVID;
david.abcc.ncifcrf.gov). P-verdier på GO termer ble korrigert for multippel testing med Benjamini-Hochberg algoritme.
Analyse av S fase induksjon av HAdV-fem infeksjon med E2F-en promoter som reporter
som genuttrykk profilering indikerte at HAdV-5 klarer å indusere gener kritisk involvert i S-fasen prosesser i melanomceller, neste utførte vi en selvstendig biologisk analyse for å undersøke S fase induksjon HAdV-fem infeksjon. E2F-1-promoteren, som er sterkt indusert i løpet av S-fasen, ble brukt som en reporter for Ad-induserte S-fasen oppføring [31]. HBEC, SW900, SK-MES-1, A549, SK-MEL-28 og Mel624 celler ble transfektert med luciferase reporter plasmider som inneholder enten E2F-en promoter eller det konstituerende SV40 promoter som kontroll. Transfekterte celler ble deretter superinfeksjon med enten HAdV-5 eller med HAdV-5 CMV-GFP som E1-slettet, replikasjon-manglende kontrollvirus. Kvantifisering av reportergenekspresjon (fig. 4) viste at i lungekreftceller, infeksjon med HAdV-5 induserer E2F-1-promotoren, men ikke SV40 promoteren, mye sterkere enn replikasjon-manglende viruskontroll. I motsetning til dette, E2F-1-promoteren induksjon ved HAdV-5-infeksjon var minimal eller mangler i melanomceller. Disse resultatene er i samsvar med vår genuttrykk profilering data og viser at S fase induksjon HAdV-5 er effektiv i HBEC, men dårlig i melanomceller.
(A) luciferasereportergenet plasmider som inneholder E2F-1 eller SV40 promoter-fragmentene ble transfektert inn i de angitte cellelinjer. Etter 24 timer ble cellene infisert med HAdV-5 (
wt
) eller replikasjonsdefekt HAdV-5 CMV-GFP (
GFP
) ved titere som resulterer i 80% infeksjon. Luciferase aktivitet ble kvantifisert tjue timer etter infeksjon. Kolonner representerer gjennomsnittsverdier av tre eksemplarer transfections /infeksjoner og feil barer reflektere standardavvik. Stjerner indikerer statistisk signifikans for sammenligninger av HAdV-5 med HAdV-5 CMV-GFP (
* p≤0.05, ** p≤0.01, *** p≤0.001
). (B) Ulik representasjon av data som er vist i panel A:. Fold endring i promoter aktivitet ved HAdV-5 sammenlignet med HAdV-5 CMV-GFP
Diskusjoner
Produktiv Ad infeksjon er avhengig av et cellulært miljø som støtter de forskjellige stadier av den virale replikasjonssyklus. Derfor Ads har utviklet seg strategier for å manipulere den cellulære miljø i vertsceller. Umiddelbart tidlige og begynnelsen av virusproteiner opprette et komplekst nettverk av interaksjoner med vertscellefunksjoner for å motvirke vertens forsvar og indusere cellulære veier er nødvendige for replikasjon av det virale genom. Dette inkluderer omprogrammering av celle genekspresjon. Her beskriver vi for første gang HAdV-5 smitte-indusert transkriptomet for HBECs, representerer deres opprinnelige vertsceller. Vi først bestemt kinetikken av HAdV-5 replikasjon i HBECs, som er som følger: E1A uttrykk starter før 4 timer etter infeksjon (h.p.i.) og når et platå på 8 h.p.i .; den første økning i virusgenomet og fiber mRNA-kopier opptrer ved 8 eller 12 HPI, avhengig av donoren, og infeksiøs partikkel produksjon når et platå ved 48 hpi. Dette etterfølges av en effektiv virusspredning i cellemonolaget, som observert av cytotoksisitet analysen etter lav titer infeksjon. Genom-omfattende ekspresjon profilering av HAdV-5-infiserte HBECs ved begynnelsen av virusgenomet replikasjon, da store modifikasjoner til vertscellen ved begynnelsen av virale gener er forventet, viste en betydelig økning i ekspresjon for 424 og en reduksjon til 519 av 18631 vurderes gener. Således genet undertrykkelse var fremtredende ved dette tidspunkt, og med tanke på at det er vanskeligere å oppdage enn geninduksjon grunn av halveringstiden for mRNA til stede før infeksjon. Gener som er involvert i cellesyklus, DNA-replikasjon, kromatin organisasjon og nukleotid-metabolisme ble akkumulert i oppregulert genet befolkningen. Dette inkluderte
E2F-2
, som viser den sterkeste økningen i mRNA uttrykket (11,5 ganger),
CCNE1 Hotell og
CCNE2 plakater (cyclin E1 og E2, 7.9- og 6.2 fold),
RRM2 plakater (ribonukleotidreduktase M2, 5,2 ganger),
CDC25A plakater (3,5 ganger),
MCM2
,
7 Hotell og
10 plakater (3, 3.3- og 3.3-fold),
EXO1 plakater (eksonuklease 1; 3,1 ganger),
RFC3 Hotell og
4
(replikering faktor C3 og 4, 2,8 og 2,1 ganger),
PCNA plakater (prolifererende cell nuclear antigen, 2,2 ganger) og flere histon, kromatin montering faktor og cent gener. Disse resultatene er i overensstemmelse med tidligere studier som har etablert, skjønt i andre celletyper, at S fase induksjon i Ad-infiserte celler er nødvendig for viral replikasjon for å fortsette. Antallet av gener og induksjon satser som vi rapporterer kan være til og med undervurdert, som vi ikke synkronisere HBECs før infeksjon for å tillate en gyldig sammenligning med kreftceller. Gener med aktivitet i differensiering, negativ regulering av spredning (inkludert
CDKN1A
, -2.9 og
CDKN2B
, -2,73), og celledød regulering ble akkumulert i trykt genet befolkningen (sterkest undertrykkelse var for parathyreoideahormon lignende hormon, 16,1 ganger). Av notatet, hadde vi ikke identifisere opphopning av gener involvert i immunitet i oppregulert genet pool.
HAdV-5-infeksjon er sjelden undersøkt i normale puste epitelceller før. Flere studier av onkolytiske Ads har sammenlignet med hovedsaklig av respiratorisk epitel-celler med tumorceller i cytotoksisitet og infeksiøse partikler produksjonsanalyser for å evaluere selektiviteten og effektiviteten av virus mutanter [32] – [39]. Disse studiene har vist at produksjon av infeksiøse HAdV-5 partiklene i primær respiratoriske epitelceller er effektiv og topper rundt 48 timer p.i. [37], [39], som er i samsvar med våre resultater.
Tidligere studier på uttrykk profilering av Ad-infeksjon har blitt utført med HeLa-celler og humane fibroblaster. For HeLa-celler, ble HAdV-2-infeksjon ved MOI 100 rapportert å regulere 76, 60, eller 382 gener mer enn 1,5 ganger på 6 timer, 10 timer eller 20 hpi henholdsvis (12000 ble analysert ved 6 timer, 7500 gener ved 10 h og 20 h) [26], [28]. En annen studie fant 75 av 4600 gener reguleres mer enn dobbelt av HAdV-5 på 24 h.p.i. av HeLa-celler [40]. Hvorvidt det lavere antall av regulerte gener i forhold til HBECs i vår undersøkelse er på grunn av transformasjon av HeLa-celler som er vanskelig å bedømme på grunn av forskjeller i metodikk. I denne forbindelse, vår studie viste en nedre rekke av regulerte gener for både lungekreft og melanomcellelinjer i direkte sammenligning med HBECs (se nedenfor). S fase gener ble rapportert å være indusert av Ad infeksjon i HeLa-celler, inkludert
CDC25A plakater (1,8 ved 10 h),
UNG product: (1.6) og histpngenene [28], som vi fant også i HBECs. Overlappinger er også funnet i downregulated gener:
MYC plakater (-1,9 versus -2,4 i HBEC);
THBS1 plakater (thrombospondin-1; -2,6 versus -9,4 i HBEC);
CAV2 plakater (caveolin-2, -1,4 versus -4,0 i HBEC).
