Abstract
Prohibitin 1 (PHB1) er en svært konservert protein som sammen med sin homolog prohibitin 2 (PHB2) hovedsakelig lokaliserer til den indre mitokondrielle membranen. Selv om det opprinnelig ble identifisert ved sin evne til å inhibere G1 /S progresjon i humane fibroblaster, er dens rolle som tumor-suppressor diskutert. For å bestemme funksjonen til prohibitins i å opprettholde celle homeostase, genererte vi kreftcellelinjer som uttrykker prohibitin styrt shRNAs. Vi viser at prohibitin proteiner som er nødvendige for spredning av kreftceller. Nedregulering av ekspresjon prohibitin drastisk reduserte frekvensen av celledeling. Videre mitokondrielle morfologi ble ikke påvirket, men tap av prohibitins førte til nedbrytning av fusjonsproteinet OPA1 og, i visse kreftcellelinjer, til en redusert evne til å oppvise forankrings-uavhengig vekst. Disse kreftcellene også oppviste redusert adhesjon til ekstracellulær matriks. Samlet utgjør disse observasjonene tyder prohibitins spille en avgjørende rolle i heft prosesser i cellen, og dermed opprettholdelse av kreftcelle forplantning og overlevelse
Citation. Sievers C, Billig G, Gottschalk K, Rudel T (2010) Prohibitins Er kreves for kreftcelle spredning og adhesjon. PLoS ONE 5 (9): e12735. doi: 10,1371 /journal.pone.0012735
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 15 juli 2010; Godkjent: 06.08.2010; Publisert: 14. september 2010
Copyright: © 2010 Sievers et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den ved å finansiere under sjette rammeprogram for forskning i EU, Prosjekt HØYRE (LSHB-CT-2004-005276) til TR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prohibitins (PHB1 og PHB2) er svært homologe proteiner som er konservert gjennom evolusjonen og allestedsnærværende uttrykt [1] – [3]. Prohibitins hovedsakelig lokalisere til mitokondriene, men er også funnet i kjernen og i lipid flåter av den cytoplasmiske membranen [1], [4] – [7]. Lokalisering til lipid flåter er også en funksjon av andre medlemmer av stomatin /prohibitin /flotilin /HflK /C-domene (SPFH) familie av proteiner [8].
Studier hittil har forbundet PHB1 med ulike roller i opprettholdelse av cellulær homeostase. Innledende arbeidet antydet at det fungerer som en inhibitor for DNA-syntese, en rolle som senere ble tilordnet til sin 3’UTR [9], [10]. En T-allelisk ekspresjon form av PHB1 var forbundet med en øket risiko for brystkreft [11]; men dette foreningen ble ikke bekreftet i et klinisk miljø [12], [13]. PHB1 ko-lokaliserer med transkripsjonsfaktorene av E2F-familien i kjernen av bryst karsinom celler [14], og samvirker med Rb tumor suppressor protein pRB i kjernen resulterer i hemming av cellesyklusen [15]. Tilsvarende ble siRNA-mediert stanse av PHB1 uttrykk funnet å øke brystcancer celleproliferasjon [16]. Til tross for disse indikasjoner på en tumor suppressor aktivitet, har nyere studier også vist redusert celleproliferasjon ved tap av PHB1 uttrykk i mus embryonale fibroblaster og andre primære celler; . Og redningen av celleproliferasjon ved overekspresjon av mitokondrie-målrettet PHB2 [17]
Våre siste arbeidet indikerer PHB1 spiller også en rolle i celle migrasjon: Forbigående stanse av PHB1 av siRNA-mediert knockdown førte til en klumping fenotype i HeLa-celler, kan sammenlignes med en HER2 /ErbB2 eller Rac defekt, dvs. klumpet seg celler viste markert membranfarging for pan-cadherin og β-catenin. Forfatterne foreslåtte kontakt mellom celler ble ødelagt ved tumorceller på grunn av tapet av PHB1 [6]. Studier i gjær har konsekvent vist at PHB1 og PHB2 fungere som mitokondrielle anstand i den indre mitokondrie-membran [3], [18] – [20]. PHB1 og PHB2 er avhengige av hverandre på proteinnivået og tap av en fører samtidig til tapet av den andre [21]. De kommuniserer med mitokondrielle proteaser, spesielt mAAA, som er nødvendig i monteringen av luftveiskjedekomplekser [22], [23]. En knock-out av prohibitins i gjær førte til en redusert replicative levetid og en defekt i mitokondrienes membranpotensiale [18], [24]. Flere nyere studier har også adressert mitokondrienes funksjon av prohibitins i humane cellelinjer: Overuttrykte PHB1 ble funnet å beskytte mot oksidativt stress [25]; i tillegg, siRNA-mediert knockdown av PHB2 førte til nedbrytning av mitokondriell fusjonsproteinet OPA1 [17] og fragmentering av den mitokondrielle nettverk [21]. Men det er fortsatt ikke klart om prohibitin uttrykk stabiliserer mitokondriemembranen potensial (MMP) [17], [26], [27].
Her viser vi prohibitins spille en rolle i å opprettholde cellulære likevekttilstand og spredning i kreftceller og primære celler. Nedbryting av prohibitins hadde ingen stor effekt på mitokondriefunksjon, men gjorde påvirke adhesjon av celler til den ekstracellulære matrise.
Materialer og metoder
Cell kultur
HEK293 og HeLa-celler ble oppnådd fra tysk samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ). HT1080wt, Jurkat og Capani celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). IF6 celler var en gave fra U. Rapp, Würzburg. HeLa-celler ble testet og godkjent av DSMZ via STR-fingerprinting. HEK293-celler og HT1080wt-celler ble dyrket i DMEM med 10% FCS, 1% penicillin /streptomycin, 10 mM HEPES pH 7,4, og 4 mM L-glutamin. HeLa-celler, IF6 celler og Jurkat-celler ble dyrket i RPMI med 10% FCS, 1% penicillin /streptomycin. HT29-celler ble dyrket i McCoys medium, supplert med 10% FCS og 1% penicillin /streptomycin. CAPAN I-celler ble dyrket i RPMI med 20% FCS og 1% penicillin /streptomycin. Alle celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO2.
Generering av shRNA knockdown cellelinjer
shRNA-uttrykkende vektorer ble konstruert ved å klone forskjellige shRNAs inn i pLL3.7 eller pLVTHM vektor. For å generere en induserbar vektor-system, ble shRNAs fra konstitutiv ekspresjon system pLVTHM subklonet inn i den induserbare vektorsystem pLVPT, ved å overføre kassetten som inneholder shRNA og H1 promoter via Xhol /Xbal-restriksjonssetene. Alle konstruksjoner ble verifisert ved sekvensering. Nukleotidsekvensene shRNA mål som benyttes er som følger: shLuci, 5′-AACTTACGCTGAGTACTTCGA-3 «; PHB1-0, 5’GCGGAGAGAGCCAGATTTG-3 «; PHB1-3, 5»-GACACATCTGACCTTCGGGAA-3 «; og PHB2-0, 5»-GACAGAGAGGGCCAAGGAC-3 «. Stabilt transdusert, konstitutive eller induserbare knockdown cellelinjer ble konstruert som beskrevet tidligere [28]; se også https://tronolab.epfl.ch/). Kort sagt ble HeLa-celler transdusert med det respektive lentiviral vektor i nærvær av polybrene (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). For transduksjon av pLVPT lentivirale vektorer, ble shRNA ekspresjon indusert ved behandling med 1 ug /ml doksycyklin (Sigma) i 3 dager og celler ble sortert for EGFP uttrykket med MoFlo® Flowcytometer (Dako Denmark A /S, Glostrup, Danmark) . For validering av knockdown nivåer, ble RNA isolert med RNAeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Kvantitativ real-time PCR ble utført med QuantiTect SYBR Grønn real-time PCR Kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. Alle vektorer ble hentet fra D. Trono, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Frankrike.
Soft agar assay
Cells (2 × 10
3) ble inokulert i 0,3% lav smeltetemperatur agarose (Sigma) i DMEM supplert med 10% FCS, og koloniene ble tellet etter 2-4 ukers inkubering ved 37 ° C og 5% CO
2.
celleproliferasjon og cellesyklusanalyse
for CFSE farging ble cellene høstet og vasket to ganger i PBS, deretter farget med 5 uM CFSE i 5 minutter ved romtemperatur (RT). Residual CFSE ble fjernet ved vasking to ganger med PBS, og cellene ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i cellekulturmedium. Den CFSE fluorescensintensitet ble målt ved FACS-analyse hver 24. time i 5 dager. BrdU ble utført ved hjelp av
Cell Proliferation ELISA, BrdU (kjemiluminescens)
kit (Roche) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut på 3,5 x 10
3 i en hvit omkranset 96-brønns plate. BrdU ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 uM i 1 time. Peroksidasekonjugert anti-BrdU-antistoff ble tilsatt til cellene i 30 til 60 min ved RT og luminescens ble målt etter en inkubasjon på 3 til 10 min ved hjelp av en Monolight 3096 mikro luminometer (BD Bioscience).
TMRE farging
for å analysere mitokondriemembranen potensial, ble 100 nM TMRE lagt til kultur medium og cellene ble videre inkubert i 30 minutter under normale kultur forhold. Inkorporering ble målt ved FACS. For å kontrollere for fullstendig tap av membranpotensialet, ble en pM CCCP tilsatt i 5 minutter.
ATP-nivåer
Cellular ATP-syntese ble målt ved anvendelse av en ATP-
Bioluminesens Assay Kit HSII
(Roche), i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 10
5 til 10
7 celler /25 ul per brønn av en 96-brønners plate ble lysert i det samme volum av cellelysering reagens ved inkubering i 5 min ved RT. Femti mikroliter av den rekonstituerte luciferase-reagens ble tilsatt til brønnen ved hjelp av automatiske injeksjon (BD Bioscience, Monolight luminometer). Målinger (varighet av 2 sekunder) ble tatt etter en ett sekunds forsinkelse.
Western blotting
Cellene ble lysert i 2 x prøvebuffer inneholdende 200 mM DTT, og proteinene ble separert ved anvendelse av 10% SDS- SIDE. Etter elektroforese ble proteinene elektrooverført til en polyvinylidenfluorid mikroporøs membran og immunpåvist ved hjelp av antistoffer mot OPA1 (BD Biosciences), PHB1 og PHB2 (NeoMarkers) og Actin (Sigma). OPA1 fragmentering ble kvantifisert ved anvendelse av AIDA-programvare.
Immunofluorescence farving
Celler dyrket på dekkglassene ble fiksert med 4% paraformadehyde i 30 minutter ved RT, og deretter permeabilisert i 0,5% Triton X-100. Deretter ble cellene immunostained ved hjelp av følgende antistoffer: mus anti-Tom20 (BD Biosciences) (1:100 fortynning, 2 h RT), mus anti-Paxillin-en (BD Transduksjon) (1:100), phalloidin-Alexa 488 ( Mobitec) (1:200) og esel anti-mus, Cy ™ 3 (1:100). Kvantifisering av mitokondrie nettverket ble gjort ved hjelp ImageJ programvare.
Transmisjonselektronmikros
Celler tømt for prohibitins ved å fremkalle shRNA uttrykk i 10 dager ble fiksert med 2,5% glutaraldehyd, postfiks med 0,5% osmiumtetroksid og kontrastert ved hjelp av garvesyre og uranylacetat. Prøvene ble dehydrert i en gradert etanol serien og innebygd i Polybed. Ultratynne snitt ble analysert i en Leo 906E transmisjonselektronmikroskop (Leo GmbH).
Heft analysen
For å måle adhesjon av celler, mikro ble belagt med 1 mg /ml fibronektin, 2 mg /ml kollagen eller 3 mg /ml BSA, respektivt. GFP-ekspresjon ble under følsomheten for fluorometer (ved 488 nm), derfor farget celler med CFSE før såing. Celler ble inkubert på belagte brønner i 30 minutter ved 37 ° C.
For å analysere cellulær migrering og adhesjon, celler indusert med doksycyklin i 8 dager, ble sådd i henhold subsammenflytende betingelser, i cellekulturplater eller dekkglass, i 20 timer etterfulgt av 4 timer i serum sult. Cellene ble behandlet med 50 uM Forskolin i 20 minutter for å indusere cAMP /PKA aktivering og derved lamellipodia og fokal adhesjonsdannelse. Aktin filamenter og fokale sammenvoksninger ble visualisert via immunocytokjemi og fokale sammenvoksninger ble talt manuelt.
Resultater
Selektiv tap av PHB1 utarmet celler
Til dags dato ingen enighet om funksjonen til PHB1 er nådd; brystkreftceller, er PHB1 blitt rapportert å virke som en tumor suppressor [15], [16], mens i primære endotelceller uttømming av PHB1 resulterte i nedsatt celleformering [26]. Å definere rollen PHB1 i HeLa-celler, en adenokarsinom cellelinje, generert vi stabile cellelinjer som uttrykker PHB1 styrt shRNAs bruker det konstituerende pLL3.7 lentiviral shRNA uttrykk system [29]. Ekspresjon av tre forskjellige shRNAs, shPHB1-2, shPHB1-3 og shPHB1-0, målrettet mot den kodende regionen av PHB1 indusert uttømming av PHB1 av RNA interferens (RNAi) på mRNA (fig. 1A) og protein (fig. 1B) nivå. Uttømming av PHB1 korrelert med samtidig ekspresjon av markørproteinet EGFP (fig. 1C), som indikerer en vellykket lentiviral transduksjon av disse cellene. Deretter ble de forskjellige cellelinjer og overvåket sammensetningen av cellepopulasjonen ved hjelp av mikroskopi og FACS-analyse. En selektiv reduksjon av shPHB-uttrykkende celler fra celle pool ble observert, som er synlig ved en reduksjon i den EGFP-positive cellepopulasjon (Fig. 1D). Dette tapet var ikke på grunn av økt apoptose av de shRNA-uttrykkende celler (data ikke vist), men raskere vekst av ikke-transdusert, PHB1 protein-uttrykkende celler, og derfor EGFP-negative celler, som viste normal proliferasjon.
(A, B) PHB1 mRNA og proteinnivåer ble effektivt redusert i celler som uttrykker shPHB1-0, shPHB1-2 og shPHB1-3 ved hjelp av den konstitutive lentiviral ekspresjonssystemet pLL3.7 som ble vist ved QRT-PCR og Western avsetninger, respektivt. (C) Ved lentiviral transduksjon stabil integrering indikeres av GFP uttrykk. (D) Ved ekspresjon av positivt validerte shRNAs som målretter PHB1 mRNA brøkdel av GFP uttrykkende celler ble redusert i løpet av ti dager etter transduksjon fra en pool av transduserte celler i løpet, som vist ved FACS-analyse. (E) omsatte HeLa-celler som uttrykker kontroll vektor eller PHB1 målretting shRNAs ble sådd i myk agar. Bare kontrollceller vokste under forankringsuavhengig forhold og dannet kolonier.
For å teste om denne observasjonen var spesifikk for HeLa-celler, en rekke ulike kreftcellelinjer, inkludert Capan1 celler, HT1080wt, Jurkat T-celler , IF6 og HT29-celler ble transdusert med den samme lentiviral shRNA konstruere og deres vekst overvåket som tidligere. Western blot analyse viste ekspresjon av shPHB1-0 resulterte i uttømming av PHB1 i alle cellelinjene som ble testet (fig. S1A). I tillegg, i likhet med HeLa-celler, langvarig dyrking resulterte i et tap av EGFP-positive celler (Fig. S1B), utelukker en cellelinje-spesifikk effekt. Interessant nok var et lignende fenomen ble observert i prolifererende primære humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) etter overførende shPHB1-0 (data ikke vist), noe som tyder på at tapet av PHB1 forstyrrer spredning.
Siden forankrings-uavhengig vekst er et kjennetegn på kreftceller [30], vi også vurdert dette fenotype i våre cellelinjer konstitutivt uttrykker shRNAs målretting PHB1. Celler ble sådd ut i myk agar og veksten følges som før. Kontroll og ikke-transduserte celler utviste normale vekstegenskaper, som danner kolonier og prolifererende, mens PHB1-knockdown-celler forble som enkeltceller (fig. 1E), noe som indikerer PHB1 spiller en rolle i forankrings-uavhengig vekst.
PHB1 /PHB2 kreves for spredning av kreftceller
Siden betinget stanse av PHB1 uttrykk ført til tap av spredning og dermed en overvekst av untransduced celler, langsiktige studier på effekten av redusert PHB1 uttrykk på molekylnivå ikke var mulig. Derfor, uttrykte vi den samme validert shRNAs for den funksjonelle knockdown av PHB1 i en lentiviral vektor under kontroll av en doksycyklin-induserbar promoter [28]. Å analysere rollen PHB2 og dets interaksjon med PHB1, har vi designet en ekstra shRNA spesielt rettet mot PHB2 mRNA (for mer informasjon se Materialer og metoder).
Reduksjoner i PHB1 og PHB2 protein uttrykk ble observert 3 til 4 dager etter tilsetning av doksycyklin, blir markert redusert i 5-6 dager og deretter gjenværende stabilt redusert i opptil 10 dager (fig. 2A, B). Uttømming av en prohibitin protein førte til tap av den andre (fig. 2C). Denne effekten var sannsynligvis på grunn av protein destabilisering som mRNA-nivåer av ikke-Silenced gen forble konstant (data ikke vist). Som tidligere observert på konstituerende stanse av PHB1 (Fig. 1 D), induserbare stanse av prohibitins førte til redusert spredning av celler. BrdU inkorporering analyser avslørte redusert DNA-syntese 5 dager etter induksjon av PHB1 og PHB2 mangel (fig. 2D). For å vurdere raten proliferasjon ved en enkelt-celle-nivå, ble cellene farget med karboksy fluorescerende succinidylester (CFSE); denne flekk er jevnt fordelt i cytoplasma og støkiometrisk distribuert til dattercellene ved celledeling. Celleproliferasjon ble tydelig redusert i PHB1- eller PHB2-utarmet celler sammenlignet med kontrollceller (fig. 2E). Videre disse cellene viste redusert forankring uavhengighet og klarte ikke å vokse på soft agar (Fig. 2F). Dermed demonstrerer vår data som prohibitins spille en rolle i celleproliferasjon.
(A, B) Transduksjon med pLVPT lentiviral systemet tillater doksycyklin induserbar shRNA uttrykk. Innenfor det angitte tidspunktet for induksjon PHB1 og PHB2 protein uttrykk ble effektivt redusert. (C) Den induserbare ekspresjon av enten PHB1 målrettet eller PHB2 rettet mRNA ført til en redusert ekspresjon av begge proteiner, slik som vist ved Western blot. (D) BrdU inkorporering Analysen viser HeLa celler som uttrykker shPHB1-0, shPHB1-3 eller shPHB2-0 i 10 dager utstillings en redusert spredning hastighet i forhold til celler som uttrykker kontroll shRNA (shLuci). (E) CFSE intensitet som målt ved FACS ved 0 h (1), 24 timer (2), 48 h (3), 72 h (4), og 96 t (5) er høyere i prohibitin knockdown-celler som indikerer redusert fortynning av CFSE å spole replikere datterceller. (F) CFSE intensitet ble avleses av FACS hver 24 timer i 5 dager og medianen av hver topp ble plottet mot hverandre. (G) induserbare uttrykk for shRNAs resulterte i samme fenotype av redusert /tap av forankringsuavhengig vekst i PHB1 (shPHB1-0, shPHB1-3) og PHB2 (shPHB2-0) knockdown celler som ble observert ved konstituerende uttrykk system.
Tap av prohibitins fører til fragmentering av mitokondriene
Siden prohibitins er hovedsakelig lokalisert til mitokondriene [1], besluttet vi å teste om uttømming av prohibitins påvirket integriteten til mitokondriene. Ved hjelp av immunfluorescens mikros vi observert en klar fragmentering av mitokondrie nettverket i celler uttrykker shPHB1-3, som økte over tid (figur 3A, B.); Ekspresjon av shPHB2-0 ikke klarte å indusere en signifikant økning i fragmenteringen av mitokondriell nettverk (fig. 3A, B). I tillegg uttrykk for shPHB1-3 resultert i en mer effektiv knockdown av begge prohibitins.
(A, B) Mitokondrier fra prohibitin knockdown celler ble farget med anti-Tom 20 og mitokondrie fragmentering ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare. En utvidet induksjon med doksycyklin ført til økt fragmentering i shPHB1-3 uttrykker celler. (C) Western blot viser at langvarig doksycyklin-indusert shPHB1-3 uttrykk ført til en sterkere prohibitin knockdown enn shPHB2-0 uttrykk, korrelere med en økende fragmentering av fusjons kompetente fragmenter a og b av OPA1. (D) Kvantifisering viste at fusjons kompetente skjemaene ble degradert til mindre fragmenter c og e. (E) Kvantifisering av OPA1 mønster i kontrollcellene (shLuci), for å PHB1-utarmet celler (shPHB1-3) og celler behandlet med 60 uM CCCP til 80 min (CCCP) indusere tap av ΔΨm. Den OPA1 mønster i CCCP-behandlede celler avvek fra shPHB1-3 uttrykkende celler, som de fragmenter A og B ble fullstendig tapt mens de mindre fragmentene D og E ble øket. (F) TEM-bilder av celler med en prohibitin knockdown indusert i 10 dager viste en mer tett utseende av mitokondrier enn shLuci-uttrykkende kontrollceller, men morfologien av cristae strukturen ble ikke endret.
Blant mange andre proteiner, spiller OPA1 en viktig rolle i kontrollen av mitokondriell fusjons [31] og cristae integritet [32]. Siden tidligere publikasjoner har vist at prohibitins er nødvendig for stabil ekspresjon av OPA1 [17], [21], analyserte vi effekten av PHB1 og PHB2 uttømming av nivåene av mitokondriell fusjonsprotein OPA1. OPA1 proteiner er uttrykt som syv spleisevarianter, synlig som fem bånd (a-e) på en Western blot, tilbakeføres delvis til fusjonsaktivitet av OPA1 [33]. Vi observerte nedbrytning av OPA1 i celler utarmet av prohibitins som korrelerte med effektiviteten til prohibitins uttømming. Spesielt ble det fusion kompetente fragmenter a og b tapt og små fragmenter c-e økt på PHB1 utarming for lengre tidsperioder (Fig. 3 C, D). Interessant, i celler som uttrykker shPHB2-0 band a og b forble intakt, og bare øker i bandet e ble observert (figur fig. 3C). Effekten var spesifikk for OPA1 siden degradering av andre mitokondrie protein, inkludert hsp60, ATP-syntase og Tims og Toms ble ikke observert (data ikke vist). Disse resultatene understøtter en selektiv aktivitet av shPHB1-3 i mitokondrie fragmentering og OPA1 degradering.
Fra tidligere studier ble det kjent at spredning av MMP induserer OPA1 nedbrytning og fragmentering mitokondriell [33]. Derfor har vi testet om mønsteret av OPA1 fragmentering indusert av PHB1 utarming og MMP var lignende. Cellene ble behandlet med frakopling reagent karbonyl cyanid
m
klorfenyl hydrazon (CCCP) og OPA1 båndene ble oppdaget av immunblot. OPA1 protein mønstrene var klart forskjellig i celler uten MMP i forhold til de som er utarmet på PHB1 (fig. 3E). Fusjons kompetente fragmenter av OPA1 ble degradert og ekspresjon av fragmenter c, d og e ble økt i fravær av MMP. I prohibitin fattige celler, uttrykk for bandet d uttrykk ble sterkt redusert, mens bandet b var bare litt redusert, noe som tyder på at ulike mekanismer står for de observerte effektene. I en tid-retters forsøket, observerte vi at CCCP forårsaker mitokondrier fragmentering før OPA1 nedbrytning (data ikke vist), noe som indikerer at OPA1 degradering kan være en konsekvens av mitokondriell fragmentering i dette tilfellet.
For å teste om lyddemping av PHB1 induserer tap av MMP, farget vi shPHB1-3 uttrykkende celler med tetramethylrhodamine etylester perklorat (TMRE), en celle-gjennomtrengelige fargestoff som er sekvestrert av aktive mitokondriene. TMRE fargeintensitet var lik i kontroll og PHB1-utarmet celler (Fig. S2A), noe som tyder på at det mitokondrielle membranen er intakt til tross for fragmentering av mitokondrier i disse cellene. I samsvar, ATP nivåer forble uendret i celler utarmet av prohibitins (Fig. S2B). Siden OPA1 nedbrytning har også vist seg å føre til endringer i cristae morfologi [32], undersøkte vi cristae strukturen i mitokondriene i celler utarmet av prohibitins ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). I PHB1-forstummet og kontrollceller, forble cristae struktur intakt (Fig. 3F), som indikerer en normal mitokondrie fysiologi.
Celle- til- celle kontakt hemmes i prohibitin utarmet celler
Under våre innledende studier på de prohibitin knockdown cellelinjer, observerte vi at tapet av prohibitin-utarmet celler var avhengig av densiteten ved hvilken celler ble sådd i cellekulturplater. Ved høy celletetthet, ble tapet av knockdown celler redusert, men ikke hindres (fig. 4A). Videre tap av prohibitins uttrykk forårsaket en forandring i cellemorfologi i visse kreftcellelinjer: HeLa-celler, spesielt når utsådd ved lav tetthet hadde tendens til å forbli som enkeltceller med en langstrakt morfologi som minner om fibroblaster (figur 4B.). En lignende fenotype ble observert når HeLa-celler ble holdt under henge forhold ved såing dem på agarose-dekket cellekultur retter: bare kontrollere celler dannet kolonier, mens prohibitin-forstummet cellene ikke klarte å danne celle- til-celle kontakter og kolonier (fig 4C. ).
(A, B) Dempe prohibitin ekspresjon i 10 dager resulterte i en strukket cellemorfologi med kjernen litt hevet. (A) Når utsådd ved lav tetthet prohibitin knockdown-celler forble som enkeltceller med minimal celle-celle-kontakt. (B) Ved høyere tetthet frø, prohibitin-knockdown-celler viste fortsatt et langstrakt morfologi, men enten dannes klynger (shPHB1-3) eller forble hovedsakelig som enkeltceller med redusert celle-celle-kontakt. Formeringshastigheten av prohibitin knockdown-celler ble også øket i forhold til cellene sådd ved lav til normal tetthet. (C) Forhindre forankring ved såing celler på agar-belagt vevskulturplater sterkt redusert spredning rate og kolonidannelse i prohibitin knockdown celler, mens kontrollceller (shLuci uttrykker celler) dannet store celleklumper. (D) Prohibitin-utarmet og kontrollceller ble behandlet med CFSE å øke fluorescensintensiteten og utsådd på ekstracellulære matriksproteiner eller kollagen fibronektin, eller på BSA i 30 minutter. Ikke-adherente celler ble vasket bort og fluorescensintensitet ble målt. Prohibitin knockdown betydelig redusert vedheft. (E) Doxycycline-induserte celler ble sådd på dekkglass i 20 timer fulgt av serum sult i 4 timer. Etter behandling med 50 uM Forskolin i 20 min, lysfelt bildene viste lamellipodia dannelse i kontrollceller, men ikke i prohibitin- ferdigproduserte celler. Videre prohibitin-utarmet celler viste nedsatt dannelse av fokal adhesjon, som vist ved hjelp av immunocytokjemi farging phalloidin og anti-paxillin antistoffer. (F) For kvantifisering av fokale sammenvoksninger i kontroll og prohibitin knockdown celler, α-paxillin 1 farget flekker ble talt i 30 celler per tilstand.
For å studere celle-matrise kontakt formasjon, celler ble sådd på plater belagt med det ekstracellulære matriksproteiner fibronektin eller kollagen. Adhesjon av PHB1- og PHB2-utarmet celler til disse matriksproteiner ble betydelig inhibert (fig. 4D). For ytterligere å kvantifisere celle-matrise vedlegg, ble samlings vedheft dannelse indusert av Forskolin etter serum sult. Immunfluorescens-mikroskopi avslørte redusert spredning og dannelsen av actin filamenter (fig. 4E), samt en reduksjon i antallet kontaktsammenvoksninger (fig. 4E, F). Disse dataene tyder på at prohibitins også spille en rolle i celle-matriks-interaksjon.
diskusjon
Siden oppdagelsen av deres anti-proliferativ aktivitet, prohibitins har vært implisert i mange cellefunksjoner [10] , [18], [34]. Men flere linjer av indirekte bevis, slik som deres overekspresjon i en rekke kreftceller [35], indikerte at prohibitins ikke fungerte som en klassisk tumor suppressor. Her viser vi prohibitins er en avgjørende forutsetning for kreftcellevekst og overlevelse. Vi brukte lentivirus-mediert shRNA uttrykk for å spesifikt redusere PHB1 og PHB2 mRNA og proteinnivåer, henholdsvis. Ved hjelp av det konstituerende uttrykk system pLL3.7, viste vi at i alle testede kreftcellelinjer, antall celler, uttrykker en PHB1 mRNA målretting shRNA ble redusert fra i en pool av omformet og ikke transduced celler. Videre PHB1-utarmet-celler var ikke i stand til å vokse under forankrings-uavhengig betingelser. Våre resultater er i samsvar med to nylige studier som viser at RNAi-mediert stanse av PHB1 eller PHB2, henholdsvis fører til redusert spredning i primære endotelceller og mus embryonale fibroblaster [17], [26]. Disse data er i sterk kontrast til en tidligere undersøkelse som viser økt proliferasjon i brystkreft melanoma-cellelinje MCF-7 ved siRNA-mediert stanse av PHB1 [16]. Det er mulig prohibitins spille en annen rolle i brystkreft celler i forhold til andre kreftcelletyper.
Etter avtale med den innledende funn at RNA fra 3’UTR av PHB1 utøver cytotoksiske effekter på kreftceller [9] [10], et uttrykk for en T-allel PHB1 3’UTR har vært knyttet til en økt mottakelighet for brystkreft [11]: imidlertid flere kliniske studier har motsagt disse funnene [12], [13]. I tillegg sekvensering av PHB1 3’UTR av forskjellige kreftcellelinjer, inkludert MCF-7, viste en høyere frekvens av generell sekvensvariasjon i forhold til primære ikke-cancerceller i stedet for en overveiende ekspresjon av en spesifikk T-allelet (CS og TR, upublisert). Disse funnene antyder at prohibitins spiller en rolle i karsinogenese, men det nivå ved hvilket den effekt oppnås, dvs. 3’UTR RNA eller protein, er fortsatt uklart: stanse av enten PHB1 eller PHB2 mRNA ved RNAi resulterte i reduksjon av den respektive 3 « UTR men også i en knockdown av begge prohibitin proteiner. Siden uttrykk for alt testet shRNAs førte til en bremset spredning rente, er dette fenotype mest sannsynlig en konsekvens av tapet av prohibitin proteiner.
For å vurdere den langsiktige effekten av prohibitin utarming, genererte vi HeLa cellelinjer med induserbar shRNA uttrykk. I disse cellene PHB1 og PHB2 mRNA var effektivt og selektivt nedregulert etter induksjon av genspesifikke og shRNA prohibitin proteiner ble reversibelt trykkes. Ligner på det konstituerende stanse av PHB1 eller PHB2, induksjon av shRNA uttrykk redusert spredning av celler og forhindret kolonidannelse på myke agarskåler, en indikasjon på en defekt i forankringsuavhengig vekst. Disse cellelinjer aktivert oss å finjustere PHB1 og PHB2 lyddemping under standardiserte forhold og for å undersøke mekanismen bak den sterke fenotype forbundet med prohibitin uttømming. Vi først analysert virkningen av prohibitin uttømming av nivåene av mitokondriell fusjonsprotein OPA1 som tidligere publikasjoner har vist at prohibitins er nødvendig for stabil ekspresjon av OPA1 [17], [21]. Vi kunne vise at OPA1 ekspresjon er avhengig av nivået av prohibitins. En liten reduksjon av prohibitins sett tidlig etter induksjon av shRNA produksjon, førte til en delvis fragmentering av fusjon kompetent OPA1 fragmenter a og b. Ved senere tidspunkter av induksjon og dermed sterkere uttømming av prohibitins, økt OPA1 fragmentering og mitokondrier dukket fragmentert. En ufullstendig reduksjon av prohibitin proteiner, sett med uttrykk for shRNAs shPHB1-0 og shPHB2-0, bare resultert i mild OPA1 fragmentering og ingen fragmentering av mitokondrie nettverket. Videre analyser viste at selv sterk og langvarig utarming av PHB1 f.eks i celler som produserer shPHB1-3, ikke føre til spredning av MMP
Til dags dato, effekter av prohibitin tap i pattedyrceller er fortsatt uklart. Schleicher et al. [26] og Ross et al.
