Abstract
quercetin og 2-Methoxyestradiol (2-ME) er lovende anti-kreft stoffer. Vår forrige
in vitro
studie viste at quercetin synergized med 2-Methoxyestradiol stiller økt antiproliferativ og proapoptotiske aktivitet både androgen-avhengige LNCaP og androgen-uavhengig PC-3 human prostata kreft cellelinjer. I denne studien, bestemt vi om deres kombinasjon kunne hemme LNCaP og PC-tre xenograft tumorvekst
in vivo Hotell og utforsket den underliggende mekanismen. Human prostatacancer LNCaP og PC-3-celler ble inokulert subkutant i BALB /c nakne mus. Når xenografttumorer nådd ca 100 mm
3, mus ble tilfeldig fordelt til kjøretøy kontroll, quercetin eller to-Methoxyestradiol enkeltvis behandlet og kombinasjonsbehandlingsgruppene. Etter terapeutisk intervensjon i 4 uker, kombinasjonsbehandling av quercetin og 2-ME i) betydelig hemmet prostatakreft xenograft tumorvekst med 46,8% for LNCaP og 51,3% for PC-3 i forhold til kjøretøykontroll gruppe, mer effektivt enn quercetin (28,4% for LNCaP, 24,8% for PC3) eller 2-ME (32,1% av LNCaP, 28,9% for PC3) alene; ii) ble godt tolerert av BALB /c-mus, og ingen åpenbare toksiske bivirkninger ble observert; iii) førte til høyere Bax /BCL-2-forhold, kløyvde caspase-3 protein uttrykk og apoptose rate; og iv) resulterte i lavere fosforylert AKT (pakt) proteinnivå, vaskulær endotelial vekstfaktor-protein og mRNA-ekspresjon, mikrovaskulær tetthet og formeringshastigheten enn enkeltmedikamentbehandling. Disse effektene var mer bemerkelsesverdig i forhold til kjøretøygruppe. Derfor er kombinasjonen av quercetin og 2-ME kan tjene som en ny klinisk behandlingsregime eie potensiale til å forbedre antitumor effekt på prostatakreft
in vivo
og minske dose og bivirkninger av enten quercetin eller 2-ME alene . Disse
in vivo
resultatene vil legge et ytterligere solid grunnlag for senere forskere på denne romanen terapeutiske behandlingen hos menneske prostatakreft
Citation. Yang F, Song L, Wang H, Wang J, Xu Z, Xing N (2015) kombinasjon av quercetin og 2-Methoxyestradiol Forbedrer Hemming av menneskelig Prostate Cancer LNCaP og PC-3 celler Xenotransplantat tumorvekst. PLoS ONE 10 (5): e0128277. doi: 10,1371 /journal.pone.0128277
Academic Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, ITALIA
mottatt: 9 desember 2014; Godkjent: 23 april 2015; Publisert: May 26, 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:.. arbeidet ble støttet av Beijing Natural Science Foundation (. no 7122075)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den nest største årsaken til kreft dødelighet hos menn, med anslagsvis 233.000 nye tilfeller og 29,480 dødsfall i USA i 2014 [1]. Selv om det kan kureres ved radikal prostatektomi eller strålebehandling på et tidlig stadium, vil de fleste pasienter lider av lokalt tilbakefall og fjernmetastaser senere [2]. Etter effektiv behandling av androgen ablasjon i de første 1-3 årene, det vanligvis utvikler seg til kastrering resistent prostatakreft (CRPC) kjennetegnes med forhøyet prostataspesifikt antigen (PSA), høyere metastase rente, mer aggressivitet, etc [3]. Kombinasjon av docetaxel og prednison, standard førstelinje systemisk kjemoterapi for CRPC, er ikke kurativ og bare forlenger total overlevelse tid for en kort periode. Videre gjør det pasienter som lider av alvorlige bivirkninger [4]. Derfor er det av presserende behov for å utvikle nye medisinsk behandling som kan overvinne disse svakhetene arbeider alene eller i kombinasjon for CRPC.
quercetin (3, 3 «, 4», 5, 7-Pentahydroxyflavone, Que), et bioaktivt flavonoid rik på grønnsaker og frukt, spesielt i løk, epler, te og rødvin, har vist lovende antitumor egenskap i mange humane kreftceller inkludert prostata kreft både in vitro og in vivo [5,6]. Men på grunn av lav biotilgjengelighet, sin anti-tumor virkning blitt begrenset til en stor grad. For å overvinne denne mangel, har quercetin vært kombinert med andre anti-kreft medikamenter for å forbedre inhiberingen av forskjellige tumorer, inkludert prostata kreft [6,7,8].
2-Methoxyestradiol (2-ME), en naturlige endogene derivat av 17β-østradiol (E2) sjelden oppviser østrogenaktivitet, er blitt rapportert å demonstrere anti-kreft-handling i et bredt spekter av tumorer [9]. Når det gjelder prostatakreft, 2-ME kan hemme både androgen-avhengige og androgen-uavhengig kreftceller in vitro og in vivo [10,11]. Ikke desto mindre, 2-ME har den ulempe at den er begrenset biologisk tilgjengelighet og rask degradering [12]. For derved å løse problemet, har medikamentkombinasjon blitt foreslått og opphisset økt anti-kreft effekt med mindre bivirkninger sammenlignet med enkeltmedikamentbehandling [10,13].
Derfor, til tross for den felles ulempe ved lav biotilgjengelighet etter både quercetin og 2-ME, synes det optimistiske når de ble kombinert med andre stoffer på grunn kreft behandles effekt. Tidligere gjennomførte vi en kombinert bruk av quercetin og 2-ME i begge androgen-avhengige LNCaP og androgen-uavhengig PC-3 menneskelige prostata kreft cellelinjer og fant en synergistisk antiproliferativ og proapoptotiske effekt sammenlignet med quercetin eller 2-ME alene [14] . Denne studien var å undersøke den kombinerte effekten av quercetin og 2-ME på LNCaP og PC-tre xenograft tumor in vivo og studere mekanismen for første gang.
Materialer og metoder
Chemical reagensene
quercetin, 2-Methoxyestradiol, hydroksypropyl-β-cyklodekstrin (HPpCD) og karboksymetylcellulose (CMC) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). RPMI-1640 medium, ble 0,25% trypsin-EDTA og fosterets bovint serum fikk fra Hyclone (Logan, UT, USA), og Matrigel var fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).
Cellelinjer og celle~~POS=TRUNC
human prostatacancer LNCaP androgen-avhengige og androgen-uavhengig PC-3 cellelinjer (to brukte cellelinjer som har vært brukt av mange andre forskere [15,16,17]), erholdt fra Peking Union Medical College, ble dyrket i RPMI-1640 medium (Hyclone, Logan, UT) supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) og anbragt i inkubator inneholdende 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
Animal studie
Alle forsøks prosedyrer knyttet til dyr ble godkjent av komiteen for forsøk med dyr og etikk komité Capital Medical University (Permit Number: 2013-X-83). Mann BALB /c naken mus 4-6 uker gamle ble gitt av departementet for forsøksdyr av Capital Medical University og holdt i patogen fritt miljø med 12-timers lys /mørke syklus, kontrollert luftfuktighet og temperatur. Mus fikk lov til å venne seg til nye omgivelser for en uke før oppstart av forsøket.
Før den formelle in vivo eksperiment, vurderte vi toksisitet av to kombinerte narkotika og kjøretøy som vil bli administrert samtidig ved hjelp av to grupper av mannlige BALB /c nakne mus (n = 5 hver). Væske til quercetin var 25% hydroksypropylcellulose-β-syklodekstrin (HPpCD, vekt /volum i DDH
2o) og for to-Methoxyestradiol var 25% HPpCD inneholder 0,5% karboksymetylcellulose (CMC, vekt /volum i DDH
2o ) [10,18]. Drug gruppe fikk de to stoffene, nemlig oppløst quercetin og 2-ME og kjøretøy kontrollgruppen fikk to medikamentfrie kjøretøy, nemlig 25% HPpCD inneholder eller ikke inneholder 0,5% CMC. Etter operasjonen ble toksisk reaksjon observert hos musene i begge gruppene representert som dårlig mental tilstand, lett vridning av kroppen, kramper og leilighetsvis moderat hematuri som var i overensstemmelse med beskrivelsen av Ehteda A og kan være knyttet til høy konsentrasjon av HPpCD [10 ]. Av denne grunn, i det etterfølgende eksperiment, kombinasjon av quercetin og 2-ME ble utført på følgende måte: quercetin ble gitt på dag 1, fulgt av 2-ME gitt på dag 2.
Mus ble inokulert subkutant med 5 x 10
5 PC-3-celler suspendert i 100 ul PBS og 2 x 10
8 LNCaP-celler suspendert i 100 ul av Matrigel og PBS-blanding (1: 1) til høyre tilbake. Når xenograft tumorer nådde et volum på ca. 100 mm
3, ble mus randomisert til fire grupper (n = 8 i hver gruppe) og behandlet intraperitonealt. Terapeutisk plan basert på våre in vitro-resultater, foreløpige eksperimenter og mange andre forskeres studier var som følger: (1) Kjøretøy kontrollgruppe: kjøretøy av quercetin på dag 1, kjøretøy av 2-ME på dag 2, (2) quercetin behandlede gruppen : quercetin 75mg /kg på dag 1, kjøretøy av 2-ME på dag 2, (3) 2-ME behandlede gruppen: kjøretøy av quercetin på dag 1, 2-ME 150 mg /kg på dag 2, (4) Kombinasjonsbehandling behandling~~POS=HEADCOMP gruppe : quercetin 75mg /kg på dag 1, 2-ME 150mg /kg på dag 2. To dager var en behandlingssyklus og hele behandlingsprosessen varte i 4 uker [13,19,20,21,22,23]. Tumorstørrelsene ble målt etter 2 dager ved hjelp av målepunktet, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen: L x S
2 x 0,5, hvor L representerer den lengste diameter og S representerer den korteste diameter på tumor [10]. Musene ble veid i tillegg. Ved slutten av behandlingsprosedyre, på dag 29 ble musene bedøvd med kloralhydrat og avlivet ved cervikal dislokasjon. Xenografttumorer ble tatt ut raskt og veies. En del av den ble satt inn i flytende nitrogen umiddelbart for fremtidig biomarkør analyse og den andre delen ble fiksert i 10% nøytral buffret formalin for immunhistokjemisk analyse. Serum biokjemiske parametere som ALAT, ASAT, kreatinin og urea nitrogen som reflekterte legemiddeltoksisitet ble også påvist.
Western blot analyse
tumorvev ble blandet med RIPA lysebuffer (Applygen Inc., Beijing , Kina) inneholdende protease inhibitor cocktail (Roche, Sveits). Lysates ble sentrifugert og supernatanten ble samlet inn. Etter kvantifisert ved anvendelse av BCA proteinanalysesett (Pierce, Rockford, USA), 80 ug protein ble separert ved 6% -12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Pall, NY, USA) ble deretter blokkert av 5% ikke-fett melk og inkubert med primære antistoffer: BCL-2 (1: 1000, Cell Signaling, Beverly, MA), Bax (1: 1000, Cell Signaling), Caspase-3 (1: 1000, Cell Signaling), AKT og pakt (1: 1000, Cell Signaling), VEGF (1: 500, Abcam) ved 4 ° C over natten, GAPDH (1: 10000, sigma) ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av pepperrotperoksydase konjugert sekundært antistoff (1: 2000, Cell Signaling) inkubering i ytterligere 1 time ved romtemperatur. Antigen-antistoff-kompleks båndene ble detektert ved forsterket kjemiluminescens kit (ECL-Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). GAPDH ble anvendt som kontroll lasting.
Revers transkripsjon-kvantitativ sanntid polymerase-kjedereaksjon (RT-qPCR)
Total RNA fra tumorvev ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen, USA) og først -Strand cDNA ble syntetisert ved anvendelse av Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Tyskland) med oligo- (dT) primere. Sekvenser av VEGF og p-aktin-primere var som følger: Human VEGF: Spiss: 5′-TCTACCTCCACCATGCCAAGT-3 «, omvendt: 5′-GATGATTCTGCCC TCCTCCTT-3». β-actin: Spiss: 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3 «, omvendt: 5′- GTGGCCAT CTCTTGCTCGAA-3». Nøyaktighet av PCR-produkter ble verifisert ved DNA-sekvensering.
Totalt 20 mL reaksjonsblanding besto av 10 mL SYBR grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems), 8 mL DDH
2o, 1 ul cDNA mal og 1 ul primere reagerte følge termiske sykluser betingelser: en syklus ved 50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 95 ° C i 10 minutter, 40 sykluser av 95 ° C i 20 sekunder og 60 ° C i 1 minutt, hver prøve var i triplikat (VIIA 7 real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). VEGF-mRNA-nivået ble beregnet i henhold til den 2
-. (ΔΔCt) -metoden og deretter normalisert til p-aktin ekspresjon
Immunhistokjemi
tumorvev ble først løst i 10% nøytral bufret formalin . Etter at parafin ble fjernet ved anvendelse av xylen-serien, ble objektglassene rehydrert med etanol serie og inkubert med 3% H
2o
2, for å eliminere den endogene peroksidaseaktivitet. Etter antigen gjenfinning, ble objektglass inkubert med primært antistoff CD31 (01:50, Abcam), CD34 (1: 100, Abcam), caspase-3 (1: 500, Cell Signaling) og Ki67 (1: 500, Abcam) ved 4 ° C over natten. Snittene ble vasket med PBS, 3 ganger og inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1: 100, Cell Signaling) i 30 minutter ved romtemperatur. Signaler ble visualisert ved reaksjon diaminobenzidin og motfarget med hematoksylin. Antall CD31, CD34 farget fartøy og caspase-3, ble Ki67 positive celler analysert fra 3 tilfeldige høy effekt felt av hvert lysbilde. Seksjoner med primær antistoff fraværende og samme konsentrasjon av sekundær antistoff tjente som negativ kontroll.
Statistisk analyse
Experiment data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. SPSS 17.0 og Sigma Plot 10,0 ble brukt til statistisk analyse og plot. Sammenligninger mellom behandlede grupper og kjøretøy kontroll ble utført ved hjelp Uavhengige-Samples T Test. P-verdi 0,05 ble ansett å være vesentlig annerledes.
Resultater
Kombinasjon av quercetin og 2-ME økt hemming av prostatakreft xenograft tumorvekst
Mann BALB /c nakne mus med PC -3 og LNCaP-celler xenograft tumorer ble behandlet med bærer, Que eller 2-ME og deres kombinasjon og fremgangsmåten varte i 4 uker. Når svulster ble tatt ut, var det tydelig at både PC-3 og LNCaP xenografttumorer i Que eller 2-ME behandlingsgruppen var mindre enn kontroll, og hemming var mer bemerkelsesverdig i Que og 2-ME co-behandlingsgruppen (figur 1A og 2A). PC-3-xenograft tumorer i Que, ble 2-ME og kombinasjonsterapigrupper hemmet med 24,8%, 28,9% og 51,3% sammenlignet med vehikkel-kontroll (figur 1B og 1C), og for LNCaP, inhibering satsen var 28,4%, 32,1 % og 46,8%, respektivt (figur 2B og 2C). Under hele intervensjonsprosessen, Que, 2-ME og deres kombinasjoner ble godt tolerert av mus ved den valgte dosen, vekttap i de tre behandlingsgruppene var ikke signifikant forskjellig fra kontroll (figurene 1D og 2D). Det var ingen forskjell i daglig mat og vannforbruk mellom grupper i tillegg. Andre giftig reaksjon beslektet med narkotika og kjøretøy som dårlig metall tilstand, ble hematuri ikke observert. Signifikante forskjeller ble ikke funnet i serum biokjemiske parametere som ALAT, ASAT, kreatinin og urea nitrogen som reflekterer legemiddeltoksisitet på lever og nyre mellom før og etter behandling.
(A) PC-3 xenografttumorer var mindre i que eller 2-ME behandling gruppen enn bærerkontroll, og inhiberingen var mer bemerkelsesverdig i que og 2-ME ko-behandlingsgruppen. Tumorvekt (B) og tumorvolum (C) ble redusert betydelig ved kombinasjonsterapi, mer tydelig enn Que eller 2-ME alene. Det var ingen signifikant forskjell i musevekt mellom gruppene (D). Data er representert som betyr ± SD. * P 0,05 sammenlignet med kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
.
(A) LNCaP xenografttumorer var mindre i Que eller 2-ME behandlingsgruppen enn kjøretøy kontroll, og hemming var mer merkbar i kombinasjon behandlingsgruppen. Que og 2-ME kombinasjonsterapi redusert tumorvekt (B) og tumorvolum (C) sterkt, mer effektiv enn que eller 2-ME alene. Ingen signifikant effekt på mus vekt ble observert mellom gruppene (D). Data er representert som betyr ± SD. * P 0,05 sammenlignet med kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
.
Effekt av quercetin med 2-ME kombinasjonsbehandling på Bax og BCL-2 protein uttrykk
Western blot viste at kombinasjonen av Que og 2-ME forbedret induksjon av apoptose ved å regulere proapoptotiske protein Bax og anti-apoptotiske protein Bcl-2 uttrykk. Som figur 3a viser, øket Bax og Bcl-2 ble redusert i enkelte eller kombinerte legemiddelbehandlede grupper av både PC-3 og LNCaP xenograft tumorvev. Effekt av apoptose ble bestemt av forholdet mellom Bax /BCL-2 som ble økt i Que eller 2-ME behandlede gruppen i forhold til kontroll, og kombinert terapi førte til en ytterligere økning (Fig 3B og 3C).
(A) Western blot oppdaget Bax og BCL-2 protein uttrykk. (B, C) Bax /Bcl-2-forholdet var representert som gjennomsnitt ± SD (gjennomsnitt i tre eksemplarer). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
Effekt av quercetin med 2-ME kombinasjonsbehandling på forholdet mellom spaltede caspase-3 /caspase-3
Effekt av quercetin og 2-ME på spaltede caspase-3 /caspase-3-forholdet ble bestemt av western blot. Som vist på fig 4A og 4B, spaltet caspase-3 /caspase-3-forhold forhøyet i quercetin eller 2-ME behandlede PC-3-tumorvev, og denne effekt var mer tydelig i co-behandlingsgruppen. Det samme fenomen ble observert i LNCaP tumorvevet (figur 4A og 4C).
(A) Western blot detektert spaltet kaspase-3 og kaspase-3 proteinekspresjon. (B, C) spaltet caspase-3 /caspase-3-forholdet var representert som middel ± SD (gjennomsnitt i tre eksemplarer). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
Effekt av quercetin med 2-ME kombinasjonsbehandling på tumor spredning (Ki67) og apoptose (caspase-3)
Immunhistokjemisk analyse viste at spredning rate på PC-3 og LNCaP svulstvev ble redusert med 36,2 % og 44,5% henholdsvis ko-behandlingsgruppene sammenlignet med kontrollen (p 0,05 og 0,01 henholdsvis), mer tydelig enn quercetin (22,6% for PC-3, 27,3% for LNCaP) og 2-ME (26,7% for PC-3 , 32% for LNCaP) alene (figur 5A-5C). Mens quercetin eller 2-ME enkelt behandling i stor grad økt caspase-3-positive celler (quercetin: 1,35 fold for PC-3, 1,77 brette for LNCaP 2-ME:. 1,8 fold for PC-3, 1,95 fold for LNCaP, sammenlignet med kontroll) , co-behandling resulterte i flere caspase-3 positive celler (2,43 fold for PC-3, 2,56 fold for LNCaP, sammenlignet med kontrollgruppen) (p 0,01) (figur 5D-5F). Disse resultatene indikerte at quercetin kombinert med 2-ME inhiberte proliferasjon og apoptose fremmet av både PC-3 og LNCaP tumorvevet i større grad.
(A, D) Immunohistokjemisk påvisning viste Ki67 og kaspase-3-positive celler i både PC-3 og LNCaP xenograft tumor. Antall Ki67 (B, C) og caspase-3 (E, F) positive celler ble representert som middel ± SD, antall var fra tre tilfeldige høy drevet felt per sleiden (lysmikroskopi, HPF, 400 x). * P 0,05 sammenlignet med kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppen, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
.
Effekt av quercetin med 2-ME kombinasjonsbehandling med fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT signalvei
Western blot viste at det var ingen signifikant forskjell i AKT proteinekspresjon mellom grupper i både PC-3 og LNCaP xenograft tumor vev (figur 6A, 6D og 6E). Mens Pakt protein ble sterkt redusert i monoterapi i forhold til kjøretøy behandlede gruppen og hemming var mye mer bemerkelsesverdig i quercetin og 2-ME kombinasjon behandlede gruppen (fig 6A-6C).
(A) Pakt og AKT protein uttrykk ble undersøkt ved western blot. Verdier på pakt (B, C) og AKT (D, E) ble fremstilt som middelverdier ± SD (verdier fra tre uavhengige eksperimenter). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
Effekt av quercetin og 2-ME kombinert behandling på VEGF-protein og mRNA-ekspresjon
fra figur 7A-7C, kan det ses at kombinasjonen av quercetin og 2-ME betydelig redusert VEGF-protein ekspresjon sammenlignet individuell behandling, som i sin tur oppviste sterkere inhibisjon enn bærerkontroll. Som for VEGF mRNA, Q-PCR viste et lavere nivå i individuell terapi grupper enn kontroll, og undertrykkelse effekten ble ytterligere forsterket i co-behandlingsgruppen hva i PC-3 eller LNCaP tumorvev (p 0,01) (figur 7D og 7E ).
VEGF-protein (A) og mRNA (D, E) ekspresjon ble undersøkt ved western blot og kvantitativ sanntid PCR. Verdier av VEGF protein (B, C) og mRNA (D, E) ble fremstilt som gjennomsnitt ± SD (verdier fra tre uavhengige eksperimenter). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppe, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
effekt av quercetin med 2-ME kombinasjonsbehandling på microvessel tetthet
Hemming effekt på microvessel tetthet representert av CD31 og CD34 i PC-3 og LNCaP xenograft tumor vev av quercetin og 2-ME ble videre undersøkt ved immunhistokjemi. I PC-3 tumorvev, kombinert behandling resulterte i en bemerkelsesverdig reduksjon av CD31 og CD34 (60,87% og 56,1%, respektivt) ekspresjon i sammenligning med bærer-behandlede gruppe (P 0,01), mens den reduserer frekvensen var 26,09% for CD31, 39,02 % for CD34 i quercetin søkt gruppen og 43,38% for CD31, 36,59% for CD34 i 2-ME brukes gruppen (fig 8A, 8B, 8D og 8E). I LNCaP tumor vev, ble CD31 og CD34 ble redusert med 50% og 49,09% henholdsvis i kombinasjon behandlingsgruppe sammenlignes med bærerkontrollgruppen (P 0,01), og på samme tid, quercetin eller 2-ME alene også ført til nedregulering av CD31 og CD34 (quercetin: 27,45% for CD31, 30% for CD34 2-ME. 29.41% for CD31, 32,73% for CD34). (fig 8A, 8C, 8D og 8F)
(A, D) immunhistokjemisk undersøkelse viste CD31 og CD34 positive fartøy i både PC-3 og LNCaP xenograft tumor vev. Antall CD31 (B, C) og CD34 (E, F) positive fartøyene ble representert som betyr ± SD, var tallet fra tre tilfeldige høy drevet felt per lysbilde (lysmikroskopi, HPF, 400 ×). * P 0,05 sammenlignet med kontroll, # P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og quercetin behandlede gruppen, ※ P 0,05 angir en signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingsgruppe og 2-ME behandlede gruppen
.
diskusjon og konklusjoner
med økt forekomst og dødelighet av prostatakreft og basert på dagens ugunstig behandling situasjon for kastrering resistent prostatakreft (CRPC) [1,4], har legemiddelkombinasjonen vakte stor oppmerksomhet på grunn av den fordel av økt anti-kreft effekt, mindre medikamentdose, reduserte bivirkninger, etc. Heri følgende vår tidligere in vitro-undersøkelser [14], gjennomførte vi en studie for å kombinere quercetin med 2-ME til å virke på human prostatacancer LNCaP og PC-tre xenograft tumor i BALB /c naken mus og funnet ut at kombinert bruk forbedret hemming av xenograft tumorvekst som ble tilskrevet induksjon av apoptose, hemming av phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt signalveien og angiogenese.
quercetin og 2-ME er lovende anti-prostata kreft stoffer. Som et enkelt middel, har quercetin blitt verifisert for å hemme kreftvekst prostata både in vitro og in vivo [5,6]. Vår tidligere studie fant også at quercetin hemmet LNCaP celler vekst gjennom nedregulering av androgen reseptor og dens induserbare gener [24]. Hva mer er, er quercetin av meget lav toksisitet og sjelden gi noen bivirkninger selv ved høy dose på 200 mg /kg ble gitt til rotter og SCID-mus [19,20], og kliniske stier viste at det totale forbruket av 1000mg quercetin per dag kunne være godt tolerert hos mennesker ikke forbundet med noen bivirkninger [25,26]. 2-ME også hemmet veksten av prostata kreft celler og xenograft tumor ikke produsere hematologisk toksisitet som andre MTAer [10,11,13]. Høy dose på 150 mg /kg for dyr i prekliniske stier [13] og 1000 mg eller 1500 mg peroralt fire ganger daglig for menneske i fase I og II-studier kan være godt tolerert uten noen åpenbare toksiske effekter [27,28].
Men til tross for disse inspirerende resultater for prostatakreft, quercetin og 2-ME har begge den ulempe at de lave biotilgjengelighet som rabatter deres anti-prostata cancer effekt. Derfor har de blitt kombinert med andre midler, for eksempel quercetin med grønn te, kosttilskudd fytoøstrogener og tamoxifen [6,20,29,30], 2-ME med albendazole, docetaxel og eugenol [10,13,31], og alle viste økt anti-prostatakreft effekt selv ved lav dose, som i stor grad gal opp utilstrekkelig biotilgjengelighet. Chang et al rapporterte at kombinasjonen av quercetin og 2-ME øket cytotoksisk virkning på leverkreft (HCC) celler sammenlignet med quercetin eller 2-ME alene [32]. Det er spekulert i at samtidig bruk av quercetin og 2-ME vil skape større anti-prostata cancer effekt med mer sikkerhet og mindre toksisitet. Våre tidligere in vitro-forsøk viste at kombinert anvendelse av quercetin og 2-ME viste synergistisk inhibering av proliferasjon og induksjon av apoptose i begge androgen-avhengige LnCap og androgen-uavhengig PC-3 human prostatacancer cellelinjer sammenlignet med enkelt medikament, og den ble tilskrevet arrestere cellesyklus og nedad Bcl-2 /Bax forholdet [14]. Men det er ikke kjent om in vivo-effekt på prostatakreft og in vitro-resultater kan ikke direkte brukes til klinisk. Derfor kombinerte vi quercetin med 2-ME til å handle på LNCaP og PC3 xenograft tumor og fant at kombinasjonsbehandling hemmet xenograft tumorvekst med 46,8% for LNCaP og 51,3% for PC3 i forhold til kjøretøykontroll, mer effektivt enn quercetin (28,4% for LNCaP, 24,8% for PC3) eller 2-ME (32,1% av LNCaP, 28,9% for PC3) alene. Videre må de ble godt tolerert og ingen åpenbare toksiske reaksjon ble observert i det hele behandlingsprosessen. Det er bekreftet at kombinasjonen av quercetin og 2-ME kan hemme prostata kreft vekst in vivo i større grad med mer effektivitet og sikkerhet.
Målrettet terapi har vært ansett avgjørende for kjemoterapeutiske effekten av naturlige produkter og fytokjemikalier [33 ]. Quercetin og 2-ME kan fungere på noen signalveier som fører til effektivt å hemme veksten av prostatakreft spesielt når de kombineres.
BCL-2 familie proteiner, inkludert antiapoptotic Bcl-2 og proapoptotiske Bax, er viktig formidler av mitokondrie apoptose veien. Aktivert Bax hjelper andre mitokondrier avledet aktivator av caspase (Smac) og cytokrom-c utgivelse som dermed aktivere caspase-3 i kløyvet caspase-3 som fører til celle apoptose, mens antiapoptotic protein Bcl-2 forhindrer Bax aktivering ved å binde og avsette det la kreftceller flykte fra apoptose [30,34]. Således Bax /Bcl-2-forhold, og nivået av spaltet caspase-3 angir den terapeutiske respons og er svært viktige i apoptoseinduksjon [33]. Quercetin økt Bax /BCL-2 ratio med 1,3 ganger av androgen-sensitive LAPC-4 prostatakreft celle xenograft tumor [6]. Kumar et al rapporterte at quercetin terapi betydelig økt Bax /BCL-2-forhold og caspase-3-aktivitet i PC-3 celler [30]. 2-ME inhiberte proliferasjon og apoptose av LNCaP og PC3-celler in vitro og in vivo ved fosforylering av Bcl-2 [35,36]. Vår foreliggende undersøkelse viste at quercetin og 2-ME anvendes alene økte proapoptotiske protein Bax, redusert antiapoptotic protein Bcl-2 og forhøyet Bax /Bcl-2-forholdet og dermed fører til kaspase-3 aktivering, noe som i sin tur indusert apoptose og hemmet xenograft tumorvekst. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved immunohistokjemisk analyse av kaspase-3 og Ki67-positive celler. Videre ble alle disse effekter forsterkes ved kombinasjon av quercetin og 2-ME som resulterer i tumorinhibering i større grad.
AKT, er en serin /treonin proteinkinase som hører til PI3K /AKT overlevelsesreaksjonsveien, spiller en viktig rolle i celle overlevelse og apoptose når den er aktivert i fosforylert AKT (Pakt). pakt oppreguleres og spiller en viktig rolle i overlevelse og proliferasjon av humane prostatacancerceller [37]. Høyt nivå av Pakt er i slekt med høyverdig og høy Gleason score på prostatakreft og fungerer som en uavhengig prediktor for biokjemisk tilbakefall [38]. Derfor AKT har vært ansett som en lovende terapeutisk mål for prostatakreft. Kim et al viste at quercetin redusert Pakt protein tilrettelegge Trail-indusert apoptose i LNCaP og DU145 cellelinjer [39]. Lee et al viste at quercetin redusert Pakt nivå som resulterer i undertrykkelse av fosforylert Bad og påvirke forholdet mellom BCL-XL og Bax, som deretter økt aktivitet av Bax og til slutt førte til LNCaP celle apoptose [40]. 2-ME sensibilisert PC-3 celler til FAS mediert apoptose via hemming av Pakt [41]. I vårt eksperiment, quercetin og 2-ME kan henholdsvis redusert Pakt protein uttrykk i både LNCaP og PC-tre xenograft tumor vev, men Pakt redusert mye mer åpenbart når kombinasjonsbehandling ble brukt. Gjennom hemming av pakt signalveien, ble tumorvekst trykkes mer effektivt.
Angiogenese refererer til dannelse av nye blodkar fra forhåndseksisterende vaskulære system som sikrer tumorer for å oppnå nok oksygen og næringsstoffer, og er regulert av flere angiogene faktorer, blant hvilke vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) er den mest avgjørende on [42]. Anti-kreft medikamenter kan inhibere angiogenese ved downregulating VEGF gjennom hvilken tumorvekst blir hemmet. Pratheeshkumar et al fant at quercetin redusert VEGF-nivåer i PC-3-celler og inhiberte blodkardannelse både in vitro og in vivo. På denne måte ble PC-3-celler og inhiberte xenografttumorer [43]. Quercetin også betydelig redusert VEGF-sekresjon i LNCaP-celler [44]. Mabjeesh et al opplyst at 2-ME bemerkelsesverdig redusert VEGF nivå på en doseavhengig måte i PC-3 celler, og deretter angiogenese og tumorvekst ble inhibert [45].
