Abstract
Bakgrunn og Mål
EGFR aktivering og PKM2 uttrykk er medvirkende i tumorigenesis. EGFR aktivering regulerer PKM2 funksjoner i et subcellulære rom-avhengig måte og fremmer gentranskripsjon og tumorvekst. I tillegg er PKM2 oppregulert i EGFR induserte veier i glioma kreftformer. Imidlertid har vi funnet at PKM2 kan også regulere aktiviteten av EGF /EGFR-signalveien i magekreftceller. Vi forsøkte å definere de biologiske mekanismer for PKM2 regulere cellemotilitet og invasjon.
Metoder
Vi ansatt stabil transfeksjon med kort hårnål RNA til stabilt dempe uttrykk for PKM2 i BGC823, SGC7901 og AGS mage kreft cellelinjer. Effektene av PKM2 in vitro ble bestemt ved å vurdere cellemigrering og invasjon. Immunhistokjemisk analyse ble benyttet for å utforske forholdet mellom PKM2 og andre proteiner.
Resultatene
Våre resultater tyder på at knockdown av PKM2 reduserte aktiviteten av E-cadherin og forbedret EGF /EGFR-signalveien i mage cellelinjer BGC823 og SGC7901 som var positive for E-cadherin uttrykk. Men i udifferensiert gastrisk karsinom cellelinje AGS, som mangler E-cadherin uttrykk, PKM2 fremmet cellemigrering og invasjon. Immunhistokjemiske analyser viste at nivåene av E-cadherin uttrykk, ERK1 /2 fosforylering, og cytoplasma PKM2 uttrykk var korrelert med hverandre
Konklusjon:.
PKM2 kan spille ulike roller i forskjellig differensiert mage kreftcelle-typer, og dette funn ville være i samsvar med de foregående klinisk forskning. Resultatene fra vår studie avslører et viktig bindeledd mellom PKM2 og E-cadherin i løpet av EGFR-stimulert magekreft cellemotilitet og invasjon
Citation. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) pyruvatkinasepåviser M2 har en dobbeltrolle på forordning av EGF /EGFR Signa via E-cadherin avhengig måte i Gastric kreftceller. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 07.02.2013; Godkjent: 20 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (No. 30971362, 81072013 91229201), grunnleggende forskning midler til sentrale universiteter i Kina (nr 2010111082) og Helsedepartementet Foundation for State Key klinisk avdeling. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
pyruvat-kinase (PK) medierer den endelige hastighetsbegrensende trinn i glykolysen ved katalysering av defosforylering av fosfoenolpyruvat (PEP) til pyruvat til dannelse av et molekyl av ATP. Pattedyrceller har fire pyruvat kinase-isoenzymer (M1, M2, L og R), som er selektivt uttrykt i forskjellige typer av celler og vev [1]. I pattedyr, er M1 isoform (PKM1) uttrykt i de fleste voksne vev. M2 isoform (PKM2), et alternativt spleiset variant av M1, er uttrykt under embryonal utvikling [2]. Studier har vist at kreftceller utelukkende uttrykker PKM2 [3], [4]. PKM2 har vist seg å være avgjørende for aerob glykolyse i tumorer (Warburg-effekten). I løpet av årene har betydelige fremskritt blitt gjort i å forstå funksjon og regulering av PKM2 som en pyruvat kinase og protein kinase i kreftceller [5]. En nylig undersøkelse bekreftet at PKM2 indusert av epidermal vekstfaktor (EGF) translocates inn i kjernen av glioblastom-celler, reagerer med β-catenin og fører til cyclinD1 uttrykk, som fremmer celle-proliferasjon og tumorigenesis [6]. Disse funnene viser en ny rolle for PKM2 som en transkripsjonen coactivator. Det er imidlertid enkelte stridsangående spesifisitet og potensialet for PKM2 som et anti-kreft-target i kreftterapi. En fersk funn viste at PKM2 uttrykket er sterkt korrelert med magekreft differensiering. Differensierte typer kreft uttrykke mer PKM2 protein enn de udifferensierte seg. PKM2 var en negativ prognostisk faktor i signetring celle magekreft [7]. Den biologiske rollen til PKM2 i forskjellige faser differensiering og utvikling av magekreft behov for å bli ytterligere belyst.
Tidligere studier angående PKM2 har fokusert på tumor metabolisme og tumorvekst. Det har vært bare noen få rapporter om metastase. E-cadherin spiller en avgjørende rolle i å opprettholde epitelial integritet, og tapet av E-cadherin påvirker klebe repertoaret av en celle [8]. Tidligere studier [9] in vitro har vist at tapet av E-cadherin i humane carcinom cellelinjer er assosiert med dårlig differensiering og en fibroblastoid morfologi. EGF-avhengig aktivering av EGFR har blitt rapportert å være hemmet i en E-cadherin adhesjon avhengig måte, som hemmer den ligand-avhengig aktivering av forskjellige reseptor-tyrosin-kinaser [10]. Vår forskning har vist at knockdown av PKM2 redusert aktivitet av E-cadherin og forbedret EGF /EGFR-signalveien i cellelinjer BGC823 og SGC7901 som var positive for E-cadherin uttrykk. Men i udifferensiert gastrisk karsinom cellelinje AGS, som mangler E-cadherin uttrykk, PKM2 fremmet cellemigrering og invasjon. Målet med denne studien var å belyse funksjon og mekanisme PKM2 med hensyn til cellemotilitet i ulikt differensierte cellelinjer.
Materialer og metoder
Cell Culture, betingelser og Transfeksjon
den menneskelige magekreft cellelinjer BGC823 (dårlig differensiert, ifølge leverandøren) og SGC7901 (moderat differensiert) ble dyrket i RPMI 1640 medium (HyClone, Logan, UT, USA). AGS-cellelinje (udifferensiert) ble dyrket i F12K-medium. Alle celler ble dyrket i medium inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) og 100 IU /ml penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktig atmosfære. Den humane magecancercellelinje AGS ble bestilt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA), og de humane magecancercellelinjer SGC7901 og BGC823 ble oppnådd fra Kina Centre for Type Culture Collection (Shanghai, Kina). SGC7901, BGC823 og AGS celler ble transfektert med siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) eller PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plasmid hjelp Fugene HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromycin (0,1 ug /ml) ble anvendt for å screene for stabilt transfekterte kloner. Ekspresjon av PKM2 protein ble undersøkt med Western blot-analyse ved anvendelse av et antistoff mot PKM2 å bekrefte evnen til konstruksjonene for å inhibere målgenet ekspresjon; Disse eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Cellekulturer ble gjort hvilende ved å dyrke dem til konfluens og mediet ble erstattet med friskt medium inneholdende 0,5% serum i 1 dag. EGF med 100 ng /ml sluttkonsentrasjon ble brukt for cellestimulering. EGF ble hentet fra Cell Signaling Technology.
Stall knockdown av PKM2 og Over-uttrykk for PKM2
Et plasmid som inneholder en RNA-interferens sekvens som målrettet PKM2 genet i BGC823, SGC7901 og AGS celler var konstruert. Følelsen oligo for siPKM2 sekvensen var 5′-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 «, og antisense-oligo- var 5′-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3». Den BGC-823, SGC-7901 og AGS celler ble transfektert med pcPUR + U6-siPKM2 eller pcPUR + U6-siRenilla (kontroll) og valgt som puromycin-resistente kloner. Western blot-analyse ble utført for å bekrefte den PKM2 undertrykkelse. Et plasmid inneholdende PKM2 cDNA-sekvens ble oppnådd fra Invitrogen. Den BGC-823, ble SGC-7901 og AGS celler transfektert med pcDNA6.0-PKM2 eller pcDNA6.0-mock (kontroll) og valgt som blasticidin-resistente kloner. Western blot-analyse ble utført for å bekrefte den PKM2 uttrykket.
Protein Extraction og Western blot-analyse
Celler ble resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende en protease inhibitor cocktail, og de ekstraherte proteiner ble separert ved anvendelse av 8-10% SDS-PAGE geler. p-Tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. Antistoffer mot E-cadherin og p-E-cadherin ble oppnådd fra Epitomics. Den fosfor-EGFR (Tyr1068), fosfo-PLCγ1 (Tyr783), fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfor-c-cbl (Tyr700), og fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) antistoffer ble hentet fra Cell Signaling Technology.
RNA Utvinning, Reverse Transcription og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen, CA, USA). Prøvene ble deretter behandlet med DNase i 15 minutter ved romtemperatur, og RNA ble ytterligere renset ved anvendelse av et RNA-rensesett (Qiagen, CA, USA). Revers transkripsjon (RT) reaksjon for den første-tråd cDNA-syntese ble utført ved bruk av revers transkriptase (Bio-Rad) med 2 pg av total RNA. Kvantitativ RT-PCR-analyse ble utført med ABI 7500 (Applied Biosystems), og genekspresjon nivåene for hver enkelt prøve ble normalisert til GAPDH. Den midlere relative genekspresjon ble bestemt og forskjellene ble beregnet ved bruk av to
-ΔΔCt fremgangsmåte for agarose gelelektroforese. RT-PCR-primer-sekvenser var som følger: 5′-følelse TGTGGGAATCCGACGAATG-3 «og 5′-antisense GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3» for N-cadherin; forstand 5’CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 «og antisense 5’AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3′ for E-cadherin; forstand 5»- TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 «og 5′-antisense GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3» for MMP7; forstand 5’CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 «og antisense 5′-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3» for GAPDH.
Cell Proliferation Assay
Celleproliferering ble målt ved hjelp av Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki gun, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i fire 96-brønners plater ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn. En plate ble tatt ut på samme tid hver dag etter at cellene hadde levd opp til brønnene. Absorbansen ble målt med en mikroplateavleser ved en bølgelengde på 450 nm. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer.
Transwell Invasion og sårtilheling Analyser
Den transwell invasjonen ble utført med 8,0-mikrometer-pore innstikk i en 24-brønns transwell plate. Basalmembranen ble hydratisert med 500 ul serumfritt RPMI 1640 medium eller F12K 30 min før bruk. For invasjonen analysen, ble magecancercellelinjer tilsatt til det øvre kammer av et transwell med 0,5 mg /ml kollagen type l (BD Bioscience, San Jose, CA) -belagt filtre. RPMI 1640 eller F12K-medium med 10% føtalt bovint serum og 1% av hvert antibiotikum ble tilsatt til det nedre kammer. Den BGC og 7901 celler ble inkubert i 36 timer. De AGS cellene ble inkubert i 24 timer. De invaderer celler ble kvantifisert etter Gentian fiolett farging. Hvert forsøk ble utført in triplo, og dataene ble uttrykt som middelverdier. Den sårhelende assay ble utført i 6-brønns plater. Tumorceller i medium inneholdende 10% FBS ble sådd ut på 6-brønners plater (Corning, CA). Cellekulturer ble gjort hvilende ved å dyrke dem til konfluens og mediet ble erstattet med friskt medium inneholdende 0,5% serum i 1 dag. Sår i monolaget ble gjort med sterile pipettespisser. Deretter EGF med 100 ng /ml sluttkonsentrasjon ble brukt for cellestimulering. Cellene ble deretter vasket med PBS og oppdateres med medium inneholdende 10% FBS. Fotografier ble tatt ved 0 og 24 timer. Alle forsøkene ble utført i tre eksemplarer
Etikk erklæringen
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen (No: 20081012). På Zhongshan Hospital tilknyttet Xiamen University, Xiamen, Fujian-provinsen i Kina, og vi innhentet skriftlig samtykke uttalelser fra alle deltakerne i denne studien.
Utarbeidelse av vevsprøver
Tumor vevsprøver ble samlet inn fra 15 forskjellige magekreftpasienter som gjennomgikk kurativ reseksjon ved Zhongshan Hospital, Xiamen University, Xiamen, Kina. En uavhengig serie av tilsvarende tilstøtende noncancerous vev fra 15 av de samme pasientene ble oppsamlet på samme tid. Alle vevsprøver ble samlet og delt i to deler med en gang etter tumor-reseksjon. En del ble samlet opp i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C til RNA og protein utvinning. Den andre delen ble fiksert i 4% formaldehyd og dyppet i parafin for histologisk analyse (Hematoxylin eosin og IHC flekker). Alle prøvene ble bekreftet ved patologisk diagnose (histopatologisk diagnose var basert på WHOs kriterier). Alle eksperimentelle saker ble gruppert Accord-ing til International Union Against Cancer Tumor-Node-metastaser (TNM) staging system (revidert i 2002).
Immunohistochemistry
Fire-mikron tykke parafinsnitt ble enten farget med hematoxylin og eosin (H E) eller analysert for PKM2, p-ERK1 /2 og E-cadherin uttrykk ved immunhistokjemi. Immunhistokjemi ble utført i henhold til prosedyrene som ble anbefalt av produsenten. Reaksjonene ble visualisert ved anvendelse av diaminobenzidin som et kromogent substrat. Seksjonene ble kontra hjelp hematoxylin og deretter ryddet og montert. Gjennomsnittlig tetthet (IOD /område) ble påvist i ulike positive områder av de 15 menneskelige magekreft prøver ved hjelp av Image-pro Plus-programvare.
Statistiske analyser
statistiske analysene ble utført ved hjelp av SPSS versjon 13. 0 (SPSS Inc.) programvare. The Independent-Samples T Test og korrelasjonsanalyse ble brukt for å sammenligne data. Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Forskjellene ble vurdert som statistisk signifikant på
P
. 0,05
Resultater
Nedbryting av PKM2 Forfremmet Cell migrasjon og invasjon i BGC823 og SGC7901 Celler med EGF Stimulering
uttrykk for PKM2 protein i magekreftcellelinjer BGC823 ble SGC7901 og AGS evaluert med Western blot analyse. Disse cellelinjene viste et høyt nivå av ekspresjon PKM2. Deretter ble stabile magekreft cellelinjer med en endret PKM2 uttrykk etablert ved hjelp av RNA-interferens (PKM2 knockdown) i BGC823, SGC7901 og AGS celler. Som vist på fig. 1A ble BGC823, SGC7901 og AGS cellelinjer med PKM2 knockdown etablert. Vi har observert at proliferasjonen ble redusert i BGC823 og AGS celler etter PKM2 ble tømt (fig. 1B). Disse resultatene er i samsvar med tidligere studier.
(A) BGC823, SGC7901 og AGS celler ble stabilt transfektert med shRNA rettet mot PKM2. Den spesifikke knockdown av PKM2 ble overvåket ved immunoblot (nederst). Celler som stabilt transfektert med pcPUR + U6-siPKM2 er referert til som siPK, og de som er transfektert med pcPUR + U6-siRenilla er referert til som pu6. (B) Spredning av stabilt transfekterte celler. Celletallet ble bestemt ved CCK-8-analyse, og det relative antall celler er vist. (C, D) et kryssformet sår ble skapt i den monolaget, og den BGC823 og SGC7901 stabilt transfekterte celler ble dyrket i ytterligere 24 timer med EGF (100 ng /ml). Representative bilder av sårede regionen vises. Resultatene av migrasjonsanalysen er også vist som kurver (* p 0,05). (E, F) invasjonen potensialet av BGC823 og SGC7901 stabile celler ble vurdert ved hjelp av BD transwellkammeret analysen med 100 ng /ml EGF i det nedre kammer i 36 timer. Cellene som migrerte til den undre side av filteret var farget, fotografert, og telles. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk (* p 0,05).
For å undersøke effekten av PKM2 på celle migrasjon og invasjon, vi ansatt veletablert sårhelende og Transwell analyser for å karakterisere cellemotilitet respons i BGC823 og SGC7901 celler. En konfluent lag av celler ble først inkubert over natten i medium, en ripe sår ble innført, medium inneholdende den mest egnede dose av EGF (100 ng /ml) ble tilsatt for å stimulere vandring, og prosentandelen av såret forsegling ble observert etter 24 timer ( Figur S1). Invaderende celler ble kvantifisert 36 timer etter EGF (100 ng /ml) ble tilsatt til det nedre kammer. Resultatene tyder på at behandling av BGC823-sipk og SGC7901-sipk celler med EGF etter en ripe sår og i transwell betydelig økt hastighet på sårheling (fig. 1 C, D) og invasjon (fig. 1 E, F) sammenlignet med den til kontrollcellene.
Nedbryting av PKM2 Redusert E-cadherin Expression og Enhanced aktivitetene til EGF /EGFR Nedstrøms signalveier PLC-γ1 og ERK1 /2
for å undersøke mekanismen for forandringer i cellemigrering og invasjon etter knockdown av PKM2, analyserte vi ekspresjonen av medlemmer av Ca
2 + -avhengig celleadhesjonsmolekyler familie og metalloproteinaser. Vi fant ut at E-cadherin protein expression nivåer ble redusert i BGC823 og SGC7901 cellene når PKM2 uttrykk ble redusert (Fig. 2A).
(A) E-cadherin, fosfor-E-cadherin og N-cadherin uttrykk -nivåene ble analysert ved immunblotanalyse i BGC823 og SGC7901 stabile celler. (B) E-cadherin og N-cadherin uttrykk nivåer ble analysert ved kvantitativ real-time PCR i BGC823 og SGC7901 stabile celler. (C) BGC823 og SGC7901 stabile celler ble utsatt for EGF (100 ng /ml) i forskjellige tidsrom. The Western blot av cellelysater vises. Den fosfor-EGFR (Tyr1068), er fosfor-PLCγ1 (Tyr783), fosfor-AKT (ser473), og fosfor-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) protein nivåer vist som angitt. (D) MMP7 uttrykk nivåer ble analysert ved kvantitativ real-time PCR i BGC823 og SGC7901 stabile celler. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD av tredoble eksperimenter (* p 0,05).
Nivået av E-cadherin mRNA og fosforylering av E-cadherin ble bestemt i BGC823 og SGC7901 celler med PKM2 utarming å vurdere om den observerte forskjellen i E-cadherin uttrykk skjedde før eller etter translatorisk. Vi har observert at nedregulering av E-cadherin og mRNA øket fosforylering, som induserer endocytose av E-cadherin, i PKM2-utarmet celler (Fig. 2A, B). Vi fant også at uttrykket nivået av N-cadherin protein ble økt i BGC823 og SGC7901 cellelinjer når PKM2 ble tømt (fig. 2A).
Cell migrasjon og invasjon er i stor grad regulert av EGFR aktivitet. For å analysere hvorvidt den EGFR er involvert i migrering og invasjon av BGC823 og SGC7901 celler, ble disse celler behandlet med EGF, som binder til EGFR og aktiverer nedstrøms signalveier. EGF-behandling resulterte i fosforyleringen av EGFR og den påfølgende aktivering av PLCγ1, AKT og ERK1 /2 trasé (Fig. 2C). Vi fant ut at PLC γ1 hadde et høyere aktivitetsnivå i PKM2-utarmet celler enn i un-utarmet celler etter enten en kort eller lang (24 h) inkubasjon med EGF. Imidlertid var det ingen merkbar forskjell i AKT aktivitet mellom de PKM2-utarmet celler og un-ferdigproduserte celler. PLCγ er en viktig regulator av cellemigrering på nedstrømssiden av RTK signale [11]. Fosforylering av tyrosin residie 783 av PLCγ1 er kritisk for dens aktivering [12]. PLCγ1 aktivering forbedret cellemotilitet, og denne effekten ble observert i såret skrape og Transwell analyser, som observert i fig. 1C.
ved siden undersøkte effekten av en EGFR-ligand på ekspresjon av MMP’er ved hjelp av RT-PCR i BGC823-sipk og SGC7901-sipk-celler sammenlignet med de respektive kontrollceller. Behandling med EGFR-liganden, EGF, forbedret ekspresjon av MMP’er på nivået av transkripsjon i BGC823 og SGC7901 celler. Men det var ingen åpenbare forskjeller i uttrykket nivåer av MMP2 og MMP9 mellom PKM2 fattige celler og deres kontrollceller (data ikke vist). MMP7 ekspresjon ble oppregulert i PKM2-utarmet celler med EGF behandling (fig. 2D). De ERK /MAPK trasé spiller avgjørende roller i EGFR ligand-induserte MMP7 uttrykk. Videre ble det observert en tydelig økning i ERK1 /2 aktivitet etter 0 timer og 24 timer etter behandling med EGF i PKM2-utarmet celler.
Nedbryting av PKM2 svekkede bevegeligheten av AGS Cells og funksjonelle endringer etter å ha reddet PKM2 i magekreft cellelinjer
uttrykk for E-cadherin protein i magekreftcellelinjer BGC823, SGC7901 og AGS ble evaluert med Western blot analyse. De BGC823 og SGC7901 cellelinjer uttrykke E-cadherin. I kontrast, AGS cellene mangler E-cadherin uttrykk (Fig. 3A).
ble oppdaget (A) E-cadherin uttrykk nivåer av immunoblot analyse BGC823, SGC7901 og AGS celler. (B) En kryssformet sår ble laget i monolaget, og AGS stabile celler ble dyrket i ytterligere 24 timer med EGF (100 ng /ml). Representative bilder av sårede regionen vises. Resultatene av migrasjonsanalysen er også vist som kurver (* p 0,05). (C) Et invasjon potensialet av AGS stabile celler ble vurdert ved hjelp av BD transwellkammeret analysen med 100 ng /ml EGF i det nedre kammer i 24 timer. Cellene som migrerte til den undre side av filteret var farget, fotografert, og telles. (D) uttrykk for p-EGFR, E-cadherin i PKM2 redde eksperimenter med stabilt transfektert metode ved hjelp av over-uttrykk plasmid vektor pcDNA6.0-mock og pcDNA6.0-PKM2 i BGC823 og AGS celler som stabilt knockdown PKM2. (E) De funksjonelle endringer i celle migrasjon og invasjon etter PKM2 redning. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige forsøk (* p 0,05).
For å undersøke effekten av PKM2 knockdown på celle migrasjon og invasjon i AGS celler, vi ansatt veletablert sårhelende og Transwell analyser for å karakterisere cellemotilitet. En konfluent lag av celler ble først inkubert over natten i medium, et sår ripe ble innført, medium inneholdende EGF (100 ng /ml) ble tilsatt for å stimulere vandring, og prosentandelen av såret forsegling ble observert etter 24 timer. Invaderende celler i transwell-analyse ble kvantifisert 24 timer etter EGF (100 ng /ml) ble tilsatt til det nedre kammer. Til vår overraskelse har vi funnet at behandling av AGS-sipk celler med EGF følgende såret bunnen av og i transwell betydelig redusert hastighet på såret forsegling og invasjon, sammenlignet med den av (fig. 3B, C) kontrollcellene. Det var påfallende forskjeller mellom BGC823 /SGC7901 og AGS celler.
For å illustrere hvilken rolle PKM2 i cellemotilitet videre, vi gjorde PKM2 redde eksperimenter. Vi også ved stabilt transfektert metode ved hjelp av over-uttrykk plasmid vektor pcDNA6.0-mock og pcDNA6.0-PKM2 å håndtere BGC823 og AGS celler som stabilt knockdown PKM2. Ekspresjonen av p-EGFR, E-cadherin er vist i de PKM2 redning av eksperimenter (fig. 3D). Vi har observert at når PKM2 uttrykket gjenvinnes, har fosforyleringen av EGFR betydelig redusert i BGC823 celler og økt i AGS-celler. Videre ble cellemotilitet av BGC823 celler redusert og AGS celler ble redusert etter PKM2 redde (Fig. 3E). For å klargjøre mekanismen av disse forskjellene, deretter analysert vi aktiviteten av EGF /EGFR signalveien.
PKM2 Forbedret aktivitetene til EGF /EGFR Nedstrøms signalveier i AGS Cells og ble korrelert med ERK aktivitet i Gastric kreft Prøver
for å analysere om EGFR kan være involvert i migrasjon og invasjon av AGS celler, ble disse cellene behandlet med EGF, som binder seg til EGFR og aktiverer nedstrøms signalveier. EGF behandling resulterte i fosforyleringen av EGFR og den påfølgende aktivering av nedstrøms EGFR-reaksjonsveier, inkludert den PLCγ1 og ERK1 /2 trasé (Fig. 4A). Vi fant at virksomheten til PLCγ1 og ERK1 /2 var større i cellene der PKM2 ikke ble utarmet enn i de PKM2-utarmet celler etter enten en kort eller lang (24 h) inkubasjon med EGF. Dette resultatet er det motsatte av hva som ble observert med BGC823 og SGC7901 celler; i AGS celler, PKM2 kom inn i bildet som en stimulans og fremmet celle migrasjon og invasjon. Vi neste undersøkt MMP7 uttrykk ved hjelp av RT-PCR i AGS-sipk celler og kontrollceller. Behandling med EGF forbedret MMP7 ekspresjon på nivået av transkripsjon i AGS-pu6 celler, men ikke i AGS-sipk celler (Fig. 4B). Aktiviteten av ERK1 /2 var åpenbart mer i AGS-pu6-celler sammenlignet med AGS-sipk celler etter 0 timer og 24 timers behandling med EGF (Fig. 4A).
(A) AGS stabile celler ble eksponert for EGF (100 ng /ml) i forskjellige tidsrom. Western blot av cellelysater ble utført. Den fosfor-EGFR (Tyr1068), fosfor-PLCγ1 (Tyr783), fosfor-Gab1 (Tyr627), fosfor-c-cbl (Tyr700), og fosfor-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) protein nivåer er vist som angitt. (B) MMP7 ekspresjonsnivåer ble analysert ved hjelp av kvantitativ real-time PCR i AGS stabile celler. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter (* p & 0,05). (C) IHC-farging med de angitte antistoffer ble utført på 15 humane magekreft prøver. Representative bilder av svulsten, som ble tatt i den samme delen av samme stykke vev, blir vist. (D) korrelasjonsanalyse mellom PKM2, E-cadherin og P-ERK1 /2 ble gjennomført ved hjelp av Image-pro Plus programvare. Den midlere tetthet (IOD /område) ble detektert i forskjellige positive områder av 15 humane magecancerprøver. Den korrelasjonsanalyse mellom PKM2 og E-cadherin ble bestemt i en E-cadherin positiv område. Den korrelasjonsanalyse mellom PKM2 og p-ERK1 /2 ble bestemt i en E-cadherin negative området.
neste utført immunhistokjemisk (IHC) analyser for å undersøke E-cadherin uttrykk, PKM2 lokalisering og ERK1 /2 fosforylering i seriesnitt på 15 menneskelige magekreft prøver ved hjelp av antistoffer med validerte spesifisiteter. Figur 4C viser at nivåene av E-cadherin ekspresjon, ERK1 /2 fosforylering, og cytoplasmisk PKM2 ekspresjon var korrelert med hverandre. I tillegg observerte vi en høy grad av ERK1 /2 fosforylering i kjernen av kreftceller uten E-cadherin uttrykk. I områder med ERK1 /2 fosforylering, vi også funnet høyere nivåer av PKM2 uttrykk. Men vi fant ikke fosforylering av ERK1 /2 i områder positive for E-cadherin uttrykk (Fig. 4C). En korrelasjonsanalyse blant PKM2, E-cadherin og P-ERK1 /2 ble utført ved hjelp av Image-pro Plus-programvare (fig. 4D). Den midlere tetthet (IOD /område) ble tatt opp i forskjellige positive områder av 15 humane magecancerprøver. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom PKM2 og E-cadherin i E-cadherin-positive områder. Dessuten var det en signifikant sammenheng mellom PKM2 og p-ERK1 /2 i E-cadherin-negative områder.
Diskusjoner
invasiv og metastatisk stadium av kreft progresjon korrelerer med dårlig klinisk prognose og representerer den mest formidabel barriere for vellykket behandling. Cellemotilitet og invasivitet er de definerende karakteristikkene av ondartede svulster, som gjør kreftceller til å migrere inn i tilstøtende vev eller gjennom å begrense basalmembraner og ekstracellulære matriser. Cellemotilitet er nødvendig for de fysiologiske prosesser av sår reparasjon og organogenese og for den patologiske prosess av tumorinvasjon [13]. Invasiv tumorceller er kjennetegnet ved feilregulert cellemotilitet som respons på ekstracellulære signaler fra vekstfaktorer og cytokiner. Humane tumorer uttrykker høye nivåer av vekstfaktorer og deres reseptorer, og mange typer av maligne celler ser ut til å oppvise autocrine- eller parakrin-stimulert vekst. Blant de mest studerte vekstfaktor reseptor systemer er EGF reseptor familien [14]. Signaler fra ekstracellulære miljø diktere cellemotilitet. Mange vekstfaktorer, inkludert de ligander som virker gjennom den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR), forbedre celle motilitet [15]. I det minste to forskjellige intracellulære signalreaksjonsveier er nødvendig for EGFR-mediert celle motilitet: trasé som benytter PLC γ og MAP kinase pathway. PLC γ aktivitet er blitt foreslått for å forbedre celle motilitet ved mobilisering av actin-modifiserende proteiner fra en inaktiv membran-assosiert lokalisering til en aktiv sub-membran cytoskeletal lokalitet [16]. ERK MAP-kinaser overføre signaler til kjernen så vel som signaler som regulerer celle-matriks-forbindelser.
Cadherins omfatter en stor familie av celle-celle adhesjon molekyler som omfatter den klassiske, desmosomal, og atypiske cadherins. E-cadherin, som uttrykkes primært i epitel-celler, er en adhesjon protein som kodes for av den CDH1 genet og virker i flere prosesser, inkludert utvikling, vev integritet, cellemigrering, morfologi, og polaritet [17], [18], [19]. E-cadherin er også en tumor suppressor som uttrykk er ofte redusert eller stille og sin re-uttrykk kan indusere morfologiske hjemfall [20], [21]. EGF-avhengig aktivering av EGFR har blitt rapportert å være hemmet i en E-cadherin adhesjon avhengig måte, som hemmer den ligand-avhengig aktivering av forskjellige reseptor-tyrosinkinaser. N-cadherin, som en invasjon promoter, ofte oppregulert. Uttrykket av N-cadherin i epitelceller induserer endringer i morfologi til en fibroblastisk fenotype, rende cellene mer bevegelige og invasiv. Nylige studier indikerer at kreftcellene har oppregulert N-cadherin i tillegg til tap av E-cadherin. Denne endringen i cadherin ekspresjon kalles «cadherin switch».
Vi observerte en nedregulering av E-cadherin og mRNA øket fosforylering, som induserer endocytose av E-cadherin, i PKM2-utarmet celler. Vi fant også at N-cadherin protein uttrykk nivå ble økt i BGC823 cellelinjen når PKM2 ble oppbrukt. Knockdown av PKM2 fremmet celle migrasjon og invasjon i BGC823 og SGC7901 celler med EGF stimulering. En økt aktivitet av EGFR er den kritiske faktoren i å bestemme cellemotilitet og invasivitet av BGC823 og SGC7901 celler. Vi antok at nedregulering av E-cadherin ekspresjon forbedret fosforyleringen av EGFR og aktivert nedstrøms signalveier, som omfatter PLCγ1 og ERK1 /2. PLC γ aktivering forbedrer cellemotilitet, og ERK1 /2 aktivitet spiller en avgjørende rolle i MMP7 uttrykk.
Matrix metalloproteinaser (MMP) har vært innblandet i kreft invasjon og metastasering på grunn av sin ekstracellulære matriks (ECM) -proteolytic aktivitet [22]. MMP-7 er blitt rapportert å bli produsert av gastrisk karsinom celler og er signifikant assosiert med den aggressive patologiske fenotypene av magekreft [23].
