Abstract
Den beste måten å øke overlevelsesfrekvens er å identifisere pasienter som sannsynligvis vil utvikle seg til muskel- invasiv eller metastatisk sykdom på forhånd, og behandle dem mer aggressivt. Den menneskelige cellelinjer HCV29 (normal blære epitel), KK47 (lav karakter nonmuscle invasiv blærekreft, NMIBC), og YTS1 (metastatisk blærekreft) har vært mye brukt i studier av molekylære mekanismer og cellesignalisering i løpet av blærekreft (BC) progresjon. Imidlertid har vært lite fokus på global kvantitativ proteom analyse av disse tre cellelinjer. Vi merket HCV29, KK47, og YTS1 celler ved SILAC metode med tre stabile isotoper hver av arginin og lysin. Merkede proteiner ble analysert ved hjelp av 2D ultra-oppløsning væskekromatografi LTQ Orbitrap massespektrometri. Blant 3721 unike identifisert og kommenterte proteiner i KK47 og YTS1 celler, ble 36 signifikant oppregulert og 74 var signifikant nedregulert med 95% sikkerhet. Differensiell ekspresjon av disse proteiner ble bekreftet ved Western-blotting, kvantitativ RT-PCR og cellefarging med spesifikke antistoffer. Gene ontologi (GO) sikt og sti analyse indikerte at de differensielt regulerte proteiner involvert i DNA replikasjon og molekylær transport, cellevekst og spredning, cellulær bevegelse, immuncelletrafikken, og celledød og overlevelse. Disse proteinene og de avanserte proteomet teknikkene som er beskrevet her vil være nyttig for videre belysning av molekylære mekanismer i BC og andre typer kreft
Citation. Yang G, Xu Z, Lu W, Li X, Sun C, Guo J, et al. (2015) Kvantitativ analyse av differensial Proteome Expression i blærekreft vs. Normal Blære Cells Bruke SILAC Method. PLoS ONE 10 (7): e0134727. doi: 10,1371 /journal.pone.0134727
Redaktør: Jon M. Jacobs, Pacific Northwest National Laboratory, UNITED STATES
mottatt: 20 januar 2015; Godkjent: 13 juli 2015; Publisert: 31.07.2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir filer og dets støtteinformasjon filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation for Unge Forskere i Kina (No. 81402115, 81201572), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen, Kina (No. BK20140172) og 111 Prosjekt of China (No.111-2-06). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft (BC) er den femte vanligste typen kreft hos mennesker. Det var anslagsvis 74,690 nydiagnostiserte tilfeller og 15,580 dødsfall fra denne sykdommen i USA i 2013 [1]. Av totale BC pasienter, 70% har nonmuscle-invasiv sykdom og ~ 25% liggende først med muskel invasjon. Pasienter med muskel-invasiv skjema har en 50% risiko for fjernmetastaser og en dårlig prognose [2]. Gjentakelse av overfladiske blære svulster er en viktig årsak til den globale utbredelsen av BC [3]. Hoveddelen (90%) av BCs klassifiseres histologisk som urothelial karsinomer (UCS), avledet fra blæren urothelium [4]. Blære epitelvev har en klar hierarkisk organisasjon bestående av tre morfologisk forskjellige celletyper: basal, middels, og paraply celler, tilsvarende henholdsvis tidlig, midt og sent differensiering tilstander [5]. Ondartet transformasjon kan forekomme i hver av disse celletyper, noe som resulterer i et mangfold av tumor-fenotyper [6]. Ifølge den siste rapporten fra American Cancer Society, er den relative 5-års overlevelse for BC med tidlig deteksjon (stadium I, (T1, N0, M0)) ~ 88% [7]. Derfor er identifisering av nye tidlig stadium molekylære markører ønskelig for økt risiko stratifisering.
Kandidat biomarkører for BC deteksjon evaluert oppdatert inkludere telomerase, blære tumor antigen (BTA), kjerne matrix protein 22 (NMP-22) og fibrin nedbrytningsprodukt (FDP). Påliteligheten av tester basert på disse biomarkørene er dårlig på grunn av lav sensitivitet og høy falske positive priser [8-11]. Proteiner kan potensielt bli identifisert spesifikke for aggressive eller nonaggressive typer kreft. Proteom analyse er vanskelig på grunn av den begrensede mengden av tilgjengelig klinisk prøve [12]. Overvåking av proteomet av BC celler kan gi tilleggsinformasjon for kliniske diagnostiske formål.
Nylige fremskritt innen massespektrometri (MS) for protein identifikasjon og kvantifisering rette for grundig analyse av et stort antall proteiner, og er blitt brukt for undersøkelse av hele proteomet i flere systemer. Slike metoder inkluderer 2D forskjell gelelektroforese (2D DIGE), tilsvarende iTRAQ (isobar tag for relativ og absolutt kvantifisering), isotop-kodet affinitet merking (ICAT), og stabile isotoper merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) [13- 15]. I sammenligning med peptid-baserte absolutte kvantiteringsstandarder metoder, har SILAC fordelene ved å blande prøver ved begynnelsen, og redusert sample-til-sample variabilitet. Metabolsk merking med stabile isotoper har blitt beskrevet som «gullstandarden» i protein kvantifisering [16]. Arginin (Arg) og lysin (Lys) er de stabile isotop-merkede aminosyrer mest brukte i SILAC baserte undersøkelser, fordi påfølgende trypsin-spaltning av isolerte proteiner (som spalter ved basiske rester) for MS-analyse genererer peptider med en enkelt-merket aminosyre syre, forenkle analyse og kvantifisering [17]. I denne studien, tre stabile isotoper hvert av Arg (R0, R6, R10) og Lys (K0, K4, K8) i tre separate kulturer ( «lys» (L), «medium» (M), og «tunge» (H)) ble brukt til å analysere proteom forskjeller på ulike stadier av BC. Karakteristiske L, M, H og former av hvert peptid som detekteres av MS reflekterte relative mengder av det tilsvarende protein i tre isotopisk kodede BC celle stadier
Tre humane cellelinjer ble studert.: Normal blære epitelial HCV29, lav karakter nonmuscle blærekreft (NMIBC) KK47, og metastatisk muskel invasiv blærekreft YTS1. Hver av de tre cellelinjene ble dyrket i medium tilsatt tre kombinasjoner av umerket Lys og Arg ( «lett»), D
4-Lys og
13C
6-Arg ( «medium»), og
13C
6
15N
2-Lys og
13C
6
15N
4-Arg ( «tunge»). Proteiner med 98% etiketten innlemmelse ble analysert og kvantifisert ved 2D-HPLC-LTQ Orbitrap MS (fig 1). Differential uttrykk for de identifiserte proteiner, som er antagelig knyttet til BC utvikling, ble bekreftet av western blotting, kvantitativ RT-PCR, og cellefarging med spesifikke antistoffer.
Materiale og metode
Cell kultur
HCV29, KK47, og YTS1 celler ble etablert som beskrevet tidligere [18-20] og vennlig donert av Dr. Sen-itiroh Hakomori (The biomembranen Institute, Seattle, WA, USA). Celler ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære. For SILAC merking ble cellene dyrket i SILAC-merket RPMI 1640 med 10% dialysert FBS og 1% penicillin /streptomycin inneholdende «lys» (K0R0), «middels» (K4R6), eller «tunge» (K8R10) Lys og Arg. For å forhindre Arg-til-Pro-konvertering, ble L-Pro (200 mg /l) tilsatt til mediet som beskrevet tidligere [21]. Celler ble dyrket i minst 5 passeringer for å eliminere nonlabeled Lys og Arg.
Cellelyse og proteinekstraksjon
Totale proteiner av de tre cellelinjer ble lysert og ekstrahert med T-PER-reagens (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) i henhold til produsentens anvisninger. I korte trekk-celler (~ 1 x 10
7) ble løsnet med trypsin, vasket to ganger med iskald 1 x PBS (0,01 M fosfatbuffer inneholdende 0,15 M NaCl, pH 7,4), lysert med 1 ml t-PER-reagens inneholdende proteaseinhibitorer (1 mM PMSF og 0,1% aprotinin), inkubert i 30 minutter på is, homogenisert og sentrifugert ved 12.000 rpm i 15 min. Supernatanten ble høstet og lagret ved -80 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-analyse. (Beyotime; Haimen, Kina)
SDS-PAGE og
i-gel
fordøyelsen
Proteiner ble separert med 10% SDS-PAGE , visualisert ved Coomassie-farging i 2 timer, og avfarget over natten. Skåret gel skiver ble vasket med 25 mM ammonium bikarbonat /50% acetonitril (ACN). Tørkede stykker ble inkubert med 20 ul 10 mM ditiotreitol (DTT) ved 56 ° C i 1 time og deretter med et likt volum av 20 mM jodacetamid (IAM) ved værelsestemperatur i mørket. Gel Skivene ble vasket og trypsinisert med 20 ul (10 ng /ul) trypsin (Promega, Madison, WI, USA) i 30 minutter ved 4 ° C. Overskudd av trypsinoppløsning ble fjernet 20 ul av 25 mM NH
4HCO
3 ble tilsatt, og blandingen ble inkubert over natten ved 37 ° C. Hentet produkter ble tørket med en speedvac konsentrator (CentriVap Cold Trap, Labconco, Kansas, Missouri, USA). [22]
MALDI-TOF /TOF-MS
Tørkede prøver ble oppløst med 0,1 % trifluoreddiksyre (TFA), flekket på en MTP AnchorChip prøve målet, og lufttørket. Peptidene ble rekrystallisert med matrise α-cyanohydroxycinnamic syre (CHCA; 1 pl av 10 mg /ml), og karakterisert ved MALDI-TOF /TOF-MS (UltrafleXtreme, Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland). Ionisering ble oppnådd ved bestråling med en laser nitrogen (λ = 337 nm) som arbeider ved 20 Hz. Massespektra ble anskaffet ved hjelp av Flexcontrol og FlexAnalysis programmer
I-løsning fordøyelsen
Proteiner fra tre typer stabile isotop-merkede celler ble blandet på. 1: 1: 1, redusert, og alkylert ved inkubasjon med like mengder av 10 mM DTT og 20 mM IAM. Alkylerte proteiner ble fordøyd med trypsin tilsettes i et forhold på 1:50 (w /w) og inkubert over natten ved 37 ° C [23]. Totalt peptider ble konsentrert og avsaltet ved hjelp av en 10KD størrelse-eksklusjon spin ultrafiltreringsenhet og tørkes ved hjelp av en speedvac konsentrator.
LC-MS /MS-analyse
2D-LC-MS ble utført ved hjelp LTQ Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) som tidligere beskrevet [24]. Spaltet peptider (100 ug) ble injisert inn i en bifasisk kapillærkolonne (id 200 um), pakket med C
18 harpiks (ReproSil-Pur, 5 um, Dr. Maisch GmbH) og sterk kationbytterharpiks (Luna 5 um SCX 100A, Phenomenex). Peptid effluenter fra tofase-kolonnen i hvert trinn ble ledet inn i en 15-cm C
18 analytisk kolonne (i.d. 75 um, ReproSil-Pur, 3 um) ved en strømningshastighet 500 nl /min. Nano-ESI ble utført med spray spenning 2,0 kV og oppvarmet kapillær temperatur 200 ° C. En hel MS scan (300-1800) i Orbitrap ble etterfulgt av fem MS /MS skanninger av de fem mest intense ioner valgt fra MS spekteret i LTQ. Ladetilstand screening ble aktivert for 2, 3, 4, og over [25].
Dataanalyse
Raw MS-data ble analysert ved bruk av MaxQuant program (V. 1.2. 2.5) [26,27]. En falsk oppdagelse hastighet (FDR) på 0,01 for proteiner og peptider og et minimum peptid lengde på 6 aminosyrer som var nødvendige. MS /MS spektra ble søkt etter Andromeda [28] mot IPI menneskelig database (V. 3,85). Den MaxQuant program bestemt SILAC tilstand av peptider fra masse forskjeller mellom SILAC peptid parene, og denne informasjonen ble brukt til å utføre søk med faste Arg6 og Lys4 eller Arg10 og Lys8 modifikasjoner, som passer. Kvantifisering i MaxQuant ble utført som beskrevet tidligere [26].
Differensial regulering innen hver forsøks M /L ( «medium /light») forhold og H /L ( «tung /lett»), forholdet mellom de identifiserte proteiner ble normalisert ved hjelp av z-poeng analyse, som beskrevet tidligere [29,30]. I korte trekk, ble M /L og H /L-forhold omdannet til log2 plass, og gjennomsnittsforhold og SD (standardavvik) ble beregnet for hvert datasett. Den log2 M /L og H /L-forhold av hvert protein ble omdannet til et z-stillingen, ved hjelp av følgende formel: hvor b ble ansett som et enkelt protein i et datasett populasjon (a … .N). Z-poeng var et mål på hvor mange SD-enheter (standardavvik) av log2 M /L eller H /L forhold av proteinet var borte fra befolkningen mener. En z-poeng ≥1.960σ representert som differensial uttrykk av proteinet løy utenfor 95% konfidensintervall, en poengsum ≥2.576σ representert uttrykk utenfor 99% konfidensintervall, og en poengsum ≥3.291σ representerte 99,9% sikkerhet. Z-score ≥1.960σ ble ansett for å være av betydning [29].
Funksjonell merknader og oppfinnsomhet Pathways analyse
Identifiserte proteiner ble analysert videre med SWISS-PROT database for å klassifisere biologisk prosess, cellulær komponent, og molekylær funksjon [31]. Vesentlige overrepresentert genet ontologi (GO) termer ble identifisert ved hjelp av Database for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID) genet bioinformatiske ressurser [32, 33]. Proteiner fast bestemt på å bli forskjellig regulert som beskrevet i forrige avsnitt ble ordnet i Excel og deres internasjonale Protein Index (IPI) tall ble lastet inn DAVID (https://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) for funksjonell annotering analyse . Datasett som inneholder genet og de tilsvarende uttrykk verdier ble deretter lastet inn i Ingenuity Systems programmet. Hver IPI nummer ble kartlagt til den tilsvarende genet objekt i oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base. Nettverk av proteinene ble generert algoritmisk basert på deres tilkobling. Fishers eksakte test ble brukt til å beregne en p-verdi som angir sannsynligheten for at en bestemt biologisk funksjon og /eller sykdom tildelt til dette nettverket skyldes tilfeldigheter alene.
Western blotting
Western blotting var utført som tidligere beskrevet [34]. I korte trekk, ble proteinene separert på 10% SDS-PAGE-gel, overført til en PVDF-membran, og membranen ble blokkert ved anvendelse av 5% fettfri melk i TBST og probet ved bruk av spesifikke antistoffer. De primære antistoffene var kanin anti-insulin-lignende vekstfaktor 2 mRNA-bindende protein 1 (IGF2BP1) (# AP10466b, Abgent, San Diego, CA, USA), kanin-anti-melanom-assosiert antigen 4 (MAGEA4) (# AP6166a, Abgent), kanin anti-Thy-en membran glykoprotein (THY1) (# AP2050a, Abgent), 14-3-3 protein sigma (SFN) (# sc-365539, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), kanin anti -fibronectin (FN1) (# F3648, Sigma-Aldrich), mus anti-vimentin (VIM) (# V5255, Sigma-Aldrich), CD70 antigen (CD70) (# sc-7681, Santa Cruz Biotechnology), og mus anti- P-catenin (CTNNB1) (# 610153, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). De sekundære antistoffer var riktig pepperrot-peroksidase (HRP) -konjugert kanin-anti-mus eller geite-anti-kanin (# A0216 og # A0208, Beyotime). Bånd ble visualisert ved hjelp av en forbedret chemiluminescence deteksjon kit (Westar Nova, Cyanagen, Bologna, Italia).
kvantitativ real-time PCR
Cells (1 × 10
5 per brønn i et 6-brønns plate) ble dyrket og behandlet som beskrevet ovenfor. Total RNA ble isolert ved hjelp av en RNApure Tissue Kit (CWBiotech, Beijing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere ble utviklet ved hjelp av DNAMAN program (V. 6.0.3, Lynnon Biosoft, Canada). Første tråd cDNA ble syntetisert fra total RNA ved hjelp ReverTra Ace-α (Toyobo, Osaka, Japan). Kvantitativ real-time PCR ble utført av LightCycler baserte SYBR Grønn jeg farge gjenkjenning med UltraSYBR Blanding (CWBiotech). Genekspresjon ble kvantifisert ved 2
-ΔΔCT metoden [35].
Cell-farging
Cellene ble dyrket på sterilisert dekkglass i 24-brønners plater inntil 70-80% konfluens, vaskes , immobilisert, permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i 10 minutter ved romtemperatur, og blokkert med 5% fettfri melk over natten ved 4 ° C. Fikserte celler ble inkubert med fortynnet primære antistoffer i 12 timer, inkubert med FITC-merkede sekundære antistoff ved 4 ° C i 6 timer i mørke, ble vasket, farget med 4 ug /ml DAPI ved romtemperatur i 10 minutter, vasket med 1 x PBS, og fotografert med en fluorescens mikroskop (Eclipse E600, Nikon, Tokyo, Japan).
Resultater
Fastsettelse av isotopen inkorporasjonseffektivitet
for å analysere dynamiske endringer i BC onkogenese på proteomet nivå, ble SILAC metoden brukes på tre blære cellelinjer for å få merket celle populasjoner. Tilstrekkelig merking er en forutsetning for pålitelig kvantifisering ved hjelp av denne metoden. I tilfelle av ufullstendig merking av proteiner, spesielt for merking av effektivitet 95%, kvantifisering av lav-overflod proteinene ville bli maskert av forurensede «lys» peptider. For å bestemme inkorporasjonseffektivitet av merket Lys og Arg, «lys» (HCV29), «middels» (KK47), og «tunge» (YTS1) proteiner ble separert, og den høy-overflod protein var
i-gel
fordøyd. MALDI-TOF /TOF-MS resultater for peptid GVVDSEDLPLNISR i varmesjokkprotein 90 (P08238) indikerte at fullstendig inkorporering av isotopisk merket Arg og Lys ble oppnådd i KK47 og YTS1, og ingen Arg-til-Pro konverteringen (figur 2A). LC-ESI-MS /MS analyse av dobbelt belastet peptid VNQIGSVTESLQACK av alfa-enolase (P06733) og GGPEVQQVPAGER av fettsyre syntase (P49327) viste at disse dubletter av selve peak klynger var fra HCV29, KK47, og YTS1 celler, henholdsvis ( fig 2B).
(A) Fastsettelse av inkorporering effektiviteten ved MALDI-TOF /TOF-MS. Peaks kommenterte som R0 (til venstre), R6 (i midten), og R10 (til høyre) er peptid GVVDSEDLPLNISR av heat shock protein 90 fra HCV29, KK47, og YTS1 celler. (B) Identifisering og kvantifisering av proteomet i BC celler ved 2D-HPLC LTQ Orbitrap MS. Peaks kommenterte som K0, K4, og K8 (til venstre) og R0, R6 og R10 (til høyre) er dobbelt belastet peptid VNQIGSVTESLQACK av alfa enolase og GGPEVQQVPAGER fettsyre syntase.
SILAC cellemodell for kvantifisering av proteom i BC progresjon
proteiner isolert fra de tre cellelinjer ble blandet (1: 1: 1) og spaltet ved anvendelse av en 10 KD filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Peptidene ble analysert ved hjelp av ultra-oppløsning væskekromatografitandem MS (NLC-ESI-MS /MS) på en hybrid-lineær ionefelle LTQ Orbitrap instrument. Totalt 3721 unike proteiner ble identifisert i to uavhengige replikere eksperimenter (Fig 3A og S1 Table). Av disse ble 1766 proteiner (47,5% av det totale) som ble identifisert i begge forsøk og tilfredsstilte kriteriene fastsatt for proteinkvantifisering utsatt for ytterligere bioinformatiske analyse. Fordelings histogrammer av logg forhold for både M /L og H /L passe en gaussisk fordeling. De fleste av de identifiserte proteiner var innenfor ± 1 utvalget av log-forhold (fig 3C og 3D). Bruke en som terskelen log forholdet, uttrykk av 255 proteiner var høyere i både KK47 og HCV29 og uttrykk av 434 proteiner var lavere i både KK47 og HCV29 (Fig 3B). Befolknings distribusjon-basert z-score tillatt direkte sammenligning av proteiner fra ulike eksperimenter. Ulike sikkerhetsnivå cutoffs ble brukt på data ved z-poengsum analyse for å finne ut hvilke proteiner ble betydelig forskjellig regulert. De cutoffs benyttet var 95%, 99% og 99,9%, tilsvarende z-score til ± 1.960, ± 2,576, og ± 3,291, henholdsvis. Ved hjelp av en 95% cutoff, ble betydelig differensial regulering observert for 110 proteiner i KK47 vs. HCV29 (36 oppregulert, 74 nedregulert) og for 87 proteiner i YTS1 vs. HCV29 (17 opp, 70 ned). Differensialregulering ble observert for 35 proteiner i de to linjene BC vs. HCV29 ved hjelp av en 99% cutoff (to opp, ned 33), men for bare fem av disse proteiner ved bruk av en 99,9% cutoff (to opp, 3 ned) (tabell 1 ). Tabell 2 og 3 liste de oppregulert og downregulated proteiner fastsatt i de to forsøkene, med deres gjennomsnittlige SILAC forholdstall og z-skårer. Alle proteiner forskjellig regulert med 95% konfidensintervall hadde en 5-ganger endring av SILAC forholdstall, og de fleste proteiner forskjellig regulert med 99% konfidensintervall hadde en . 10 ganger endring av SILAC forholdstall
(A) Venn diagrammer av antall identifiserte proteiner fra individuelle eksperimenter. (B) prosenter av KK47 /HCV29 (M /L) og YTS1 /HCV29 (H /L) for settet av 1766 proteiner. log2 av SILAC ratio for hvert protein (n = 2) gjenspeiler forskjeller i relative uttrykk blant KK47, YTS1 og HCV29 celler. (C) Fordeling av SILAC M /L forhold. (D) Fordeling av SILAC H /L-forhold. (E) Cluster graf ( «heat map») generert av hierarkisk clustering av betydelige regulerte proteiner etter gjennomsnittlig z-score ved hjelp av en 95% cutoff.
hierarkisk clustering analyse av prøver ble utført for å undersøke korrelasjonen av proteom mønstre mellom de tre cellelinjer. Cluster grafen ( «heat map») viser at prøver av samme cellelinje klynge sammen (figur 3E). Noen proteom var karakteristiske blant de tre cellelinjer basert på betydelige endringer i metastatisk vs. lav karakter nonmuscle invasiv, mens andre proteom var konsekvent moderat og. Proteiner i førstnevnte gruppe kan være involvert i BC utvikling.
Funksjonell klassifisering og sti analyse av identifiserte proteiner
Funksjonell tolkning er et viktig skritt i dataanalyse når omfattende funksjonell annotering av datasettene er ikke tilgjengelig. Tar hensyn til deres ikke-eksklusiv lokalisering i GO, ble de identifiserte proteiner knyttet til minst ett annotering sikt hver i løpet av GO molekylær funksjon, biologisk prosess, og molekylære komponent kategorier. De mest vanlige molekylære funksjoner ble binding (47,2%), og katalytisk aktivitet (30,9%) (figur 4A). De viktigste biologiske prosesskategorier var celle (16,3%), enkelt-organisme (14,2%), og metabolske (13,8%) (figur 4B). De viktigste cellulære komponent kategorier var celle (17,6%), celle del (17,6%), og organell (15,8%) (figur 4C).
Proteiner viste knyttet til minst ett annotering sikt innenfor GO molekyl funksjon (A), biologisk prosess (B), og cellulær komponent (C) kategorier.
for å identifisere berikelse vilkår knyttet til oppregulert og downregulated grupper av proteiner etter gjennomsnitt av z-score med 95 % cutoff, lister over proteinene ble lastet opp til DAVID nettsiden ved hjelp av helt menneske proteomet som bakgrunn. For å bidra til å avklare hvilke molekylære funksjoner og biologiske prosesser ble hardest rammet under BC modning, ble over-representert GO vilkår identifisert basert på terskelen teller ≥ 2 og Expression Analysis Systematisk Explorer (ENKEL) 0,1. Over-representert molekylære funksjoner, biologiske prosesser og cellulære komponenter i de betydelige beriket GO form av oppregulert proteiner ble analysert. Den mest høyt rangert molekylære funksjon var nøytral aminosyre trans transporter aktivitet (2 proteiner). De høyest rangert biologiske prosessene var celle aminosyrederivat metabolske prosess (4-proteiner), ribonucleoprotein kompleks biogenese (4-proteiner), respons på ekstracellulære stimuli (4-proteiner), og nitrogenforbindelsen biosyntetiske prosess (4-proteiner). De høyest rangert cellulære komponenter ble intracellulær uten membran-avgrenset organeller (14 proteiner) og ikke-membran-avgrenset organeller (14 proteiner).
Deretter over representert molekylær funksjoner, biologiske prosesser, og cellulære komponenter i de betydelige beriket GO gjelder downregulated proteiner ble analysert. De mest høyt rangert molekylære funksjoner var kalsium ion binding (16 proteiner), strukturell molekyl aktivitet (11 proteiner), og identiske proteinbinding (10 proteiner). De høyest rangert biologiske prosessene var celleadhesjon (14 proteiner), biologisk adhesjon (14 proteiner), som reaksjon på såret (13 proteiner), og immunresponsen (13 proteiner). De mest høyt rangert cellulære komponentene var plasmamembran (40 proteiner), plasmamembran del (30 proteiner), og uten membran-bundet organeller (24 proteiner) (S2 tabell).
Proteiner ble videre analysert, og metabolske og kanoniske trasé og sammenhengende proteinene ble generert ved hjelp Oppfinnsomhet Pathways Analysis (IngenuityH Systems, www.ingenuity.com). Den øverste nettverksfunksjoner identifisert som oppregulert proteiner i BC celler ble involvert i DNA-replikasjon, aminosyre metabolisme, molekylære transport (52 proteiner, fig 5a), genekspresjon og arvelige lidelser (33 proteiner), cellevekst og spredning (20 proteiner, fig 5B), og post-translasjonell modifikasjon og kreft (4-proteiner). Den øverste nettverksfunksjoner identifisert som downregulated proteiner i BC celler var cellulær bevegelse og immuncelletrafikken (97 proteiner; figur 5C), lipid metabolisme (31 proteiner; figur 5D), cellulær utvikling, vekst og spredning, og celledød og overlevelse (6 proteiner). Disse funnene tyder på at BC celle proteom ble kontinuerlig skiftende avhengig av stadium av cellemetastaser.
(A og B) Topp nettverksfunksjoner av DNA replikasjon, molekylær transport, cellevekst og celledeling for oppregulert proteiner. (C og D) Top nettverksfunksjoner av cellulær bevegelse, immuncelletrafikken, og lipidmetabolismen. Heltrukne linjer: direkte kjente interaksjoner. Stiplede linjer: mistenkt eller indirekte vekselvirkninger. Hvite: proteiner som er kjent for å være i nettverket, men ikke identifisert i vår undersøkelse
Bekreftelse av MS resultater ved western-blotting
Variasjoner av differensial proteinene beskrevet ovenfor ble bekreftet ved western-blotting. . THY1, MAGEA4, IGF2BP1 og SFN ble oppdaget på et høyere nivå i BC KK47 og YTS1 celler enn i normale blære epitelceller HCV29 celler, mens VIM, CTNNB1, FN1 og CD70 ble påvist på lavere nivåer i KK47 og YTS1 enn i HCV29 (fig 6B og 6C). Generelt, de vestlige blotting resultatene var konsistente med variabler fra MS-analyse (figur 6A, S1 Bord og S1 Fig)
(A) SILAC L:. M: H gjennomsnittlig forholdstall for seks utvalgte proteiner. (B) Western blot-analyse av utvalgte proteiner. Proteiner ble overført til en PVDF-membran, probet med de primære antistoffer, og inkubert med HRP-konjugert kanin anti-mus eller geite-anti-kanin sekundære antistoffer. (C) Densitometrisk kvantitering av proteinnivåer. Proteinet ble normalisert ved tublin, og deretter sammenlignet med HCV29, som ble vilkårlig satt til 1,0. (D) Gene uttrykk for proteinene ble analysert ved QRT-PCR. Relativ uttrykk i forhold til kontrollprøver ble analysert av 2
-ΔΔCt metode og representert som Logg
2. Uttrykket av gener over Log
2 (2) eller under Log
2 (1/2) var signifikant oppregulert eller nedregulert, henholdsvis.
Bekreftelse av SILAC resultatene etter QRT-PCR
ekspresjon av seks responderende gener på det transkripsjonelle nivå ble evaluert ved QRT-PCR. I BC KK47 og YTS1 celler, uttrykk for
MAGEA4
,
THY1
, og
IGF2BP1
ble betydelig økt, mens det av
VIM
,
CTNNB1
, og
FN1
ble sterkt redusert (fig 6D). Disse funnene er i tråd med SILAC resultater.
Bekreftelse på SILAC og vestlige blotting resultatene etter cellefarging med antistoffer
antistoffer som gjenkjenner MAGEA4, THY1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, og fn1 proteiner, hvis uttrykk signifikant forskjellig i BC celler vs HCV29 celler, ble brukt til å bekrefte resultatene av tidligere analyser og vurdere protein distribusjoner. Fluorescens signal intensitet i de to BC cellelinjer var signifikant høyere for MAGEA4, THY1, og IGF2BP1 og betydelig lavere for VIM, CTNNB1, og FN1, i samråd med SILAC, western blotting, og RT-PCR resultater. Fortrinnsrett lokalisering ble observert for MAGEA4 sentralt i cytoplasma (inkludert mitokondrier og sentrosomen) og den kjernefysiske området, for THY1 og VIM i cytoplasmamembranen og cytoplasma, for IGF2BP1 i atom regionen og cytoplasma, og for CTNNB1 og FN1 i cytoplasmamembranen (Fig 7 )
HCV29, KK47, og YTS1 celler ble dyrket og farget med seks antistoffer rettet mot identifiserte proteiner (MAGEA4, THY1, IGF2BP1, VIM, CTNNB1, FN1) merket med Cy3 som beskrevet i M . M. Bildene vises i flette bilder av Cy3-konjugerte antistoffer og DAPI farging av atomkjerner (objektivforstørrelsen 60 ×). Skala barer: 70 mikrometer
Diskusjoner
urothelial carcinoma av blæren er unik blant epiteliale karsinom i sine divergerende veier av tumorigenesis.. På tidspunktet for diagnose for overgangsordning celle BC, ~ 80% av pasientene er i lavgradig (grad 1-2) ikke-muskel invasiv (CTA eller CT1) scenen. Hos pasienter med lav karakter Ta sykdom, er den 15 år progresjonsfri overlevelse 95% uten kreftspesifikk dødelighet [36]. Derfor er biomarkører som er nødvendig for å forutsi en risiko for progresjon scene fra ikke-invasiv til invasiv eller ikke-metastatisk til metastatisk og forutsi responsen til systemisk behandling. Den menneskelige cellelinjer HCV29 (normal blære epitel), KK47 (lav karakter nonmuscle invasiv blærekreft), og YTS1 (metastatisk blærekreft) har vært mye brukt i studier av molekylære mekanismer og cellesignalisering i løpet av progresjon av blærekreft til muskel eller metastatisk stater [37]. Imidlertid har vært lite fokus på global kvantitativ proteom analyse av disse tre cellelinjer.
Kvantitativ analyse av proteiner på ulike stadier av BC progresjon er en utfordrende, men viktig oppgave for forståelse av sykdomsmekanismer. SILAC, en differensial isotop merking strategi som innebærer metabolsk merking av proteiner
in vivo
, har blitt mye brukt i cellebiologi og studier av modellorganismer som gjær, bakterier, nematoder, planter og mus [38, 39 ]. I SILAC, naturlige «lette» isotoper av karbon, nitrogen og hydrogen i aminosyrer inkorporert i løpet av proteintranslasjon substituert med «tunge» isotoper som for eksempel
13C,
15N, og
2H. Ingen studier hittil har kvantifisert forskjeller i protein overflod på ulike stadier av BC. Tidligere studier har fokusert på komparative protein nivåer i BC pasienter vs. kontrollpersoner, men ikke på endringer av protein nivåer under BC progresjon [8,9].
Identifisering og karakterisering av proteinnivåer på ulike trinn på differensiering er viktig for vår forståelse av normalt vev utvikling og malign transformasjon. I denne studien, søkte vi SILAC metode til analyse av HCV29, KK47, og YTS1. Denne strategien gitt protein informasjon for alle tre cellelinjer i løpet av en MS eksperiment. Etter normalisering av z-poeng metoden ble differensial regulering observert for 110 proteiner i KK47 vs. HCV29 og for 87 proteiner i YTS1 vs. HCV29. Disse ulikt regulert proteiner, som kan spille viktige roller i BC utvikling, inkluderer SFN (14-3-3 protein sigma), SELENBP1 (selen bindende protein 1), COL6A3 (kollagen α3 (VI) kjede), og CD70.
