Abstract
Genetisk omorganisering av
ROS1
reseptortyrosinkinasehemming ble nylig identifisert som en distinkt molekylær signatur for human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). Imidlertid gjen direkte bevis på lunge kreft indusert av
ROS1
fusjonsgener som skal verifiseres. Denne studien viser at
Esr-ROS1
spiller en avgjørende rolle i onkogenese av NSCLC huse fusjonsgenet.
Esr-ROS1
ble identifisert i fire kvinnelige pasienter på lunge adenokarsinom. Tre av dem var aldri røykere. Interstitiell sletting av 6q22-Q25 resulterte i genet fusjon. Ekspresjon av fusjons kinase i NIH3T3-celler induserte forankringsuavhengig vekst
in vitro
, og subkutane tumorer i nakne mus. Denne trans evne tilskrives sin kinase aktivitet. ALK /MET /ROS1 kinase inhibitor, crizotinib, undertrykt fusion-indusert forankringsuavhengig vekst av NIH3T3 celler. Viktigst, etablerte transgene mus linjer spesifikt uttrykker Esr-ROS1 i lunge alveolære epitelceller utviklet flere adenokarsinom knuter i begge lungene i tidlig alder. Disse dataene antyder at
Esr-ROS1
er en sentral onkogen i menneskelig NSCLC, og at denne dyremodell kan være verdifulle for å utforske terapeutiske midler mot
ROS1
-rearranged lungekreft.
Citation: Arai Y, Totoki Y, Takahashi H, Nakamura H, Hama N, Kohno T, et al. (2013) Mus Modell for ROS1-omorganisert lungekreft. PLoS ONE 8 (2): e56010. doi: 10,1371 /journal.pone.0056010
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 03.10.2012; Godkjent: 04.01.2013; Publisert: 13. februar 2013
Copyright: © 2013 Arai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Program for fremme av grunnleggende studier i helsefag fra National Institute of Biomedical Innovation, National Cancer Center Research and Development Funds (23-A-7 og 23-B-28), stipend til prinsessen Takamatsu kreftforskning Fond og Grants-in-Aid fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds for tredje sikt Omfattende 10-års strategi for Cancer Control. National Cancer Center Biobank er støttet av National Cancer Center Research and Development Fund, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall i verden [1]. Lung adenokarsinom (LADC), den vanligste formen for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), består av flere ulike genomiske undergrupper definert av unike onkogene endringer, og en betydelig andel av LADC tilfeller havnen driver endringer i
EGFR, KRAS Hotell og
ALK
gener ved gjensidig utelukkende måte med få unntak [2] – [5]. Forstå det molekylære grunnlaget for kreft gjør at vi kan utvikle terapeutiske midler som er rettet mot genetiske druggable avvik identifisert i kreft genomer. Tyrosinkinasehemmere (TKI) som er rettet mot EGFR og ALK proteiner er spesielt effektiv i behandling av LADC frakte
EGFR
mutasjoner og
ALK
fusjoner, henholdsvis [2] – [6]. Men utviklingen av en effektiv TKI krever eksperimentell validering av de genetiske avvik som handlekraftige og druggable. Transgene musemodeller som bærer
EGFR
mutasjoner eller
EML4-ALK
genfusjoner har demonstrert den onkogene potensialet i de forandringer og effektiviteten av behandlingen TKI [7], [8]. Genetisk omorganisering av
ROS1
ble nylig identifisert som en distinkt molekylær signatur for menneskelig LADC [9] – [16]. I denne studien har vi etablert en musemodell for
ROS1
fusjon, og viste at
Esr-ROS1
som en viktig driver onkogen i lunge kreftutvikling.
Resultater
Identifikasjon av Esr-ROS1 Fusion Gene i LADC av Never-røykere
Hele transkriptomet high-throughput sekvensering av vevsprøver er en av de mest effektive metoder for å identifisere fusion onkogener [17]. Analyse av fem LADC tilfeller av aldri-røykere uten
EGFR /KRAS /ALK
endringer ved hjelp transkriptomet sekvense identifisert 56 leser overstyrer i ramme
Esr-ROS1
genet fusjon punkt kobler
Esr
ekson 10 til
ROS1
ekson 34 i en svulst. RT-PCR-analyse av passet ikke-cancervev bekreftet tumorspesifikk ekspresjon av fusjons transkripsjon (figur 1A). I tillegg transkriptomet sekvense tydelig demonstrert en bestemt økning i uttrykket av det fusjonerte 3-del av
ROS1 plakater (eksoner 34 til 43) etter stoppunkt, noe som tyder på at
Esr-ROS1
fusjon avskrift forårsaker avvik overekspresjon av
ROS1
tyrosin kinase domene sammen med 5 «delen av
Esr plakater (figur 1B). SNP matrisesammen genomisk hybridisering (matrise CGH) data viste at dette fusjonsgenet ble generert av en stor mellomliggende delesjon som spenner over ~41.5 Mb på kromosom 6q22-Q25 (figur 1C). Genomisk PCR og sekvensering analyse avslørte også sletting av 41,5 Mb forårsaker somatiske fusjoner av
Esr
intron 10 på 6q25 med
ROS1
intron 33 på 6q22 (figur S1).
(A) Junction leser representerer
Esr-ROS1
fusion transkripsjoner i LCY66T prøven (til venstre). Sanger-sekvensering av RT-PCR-produktet validert tumor-spesifikke i-ramme fusjon transkripsjon (til høyre). m: molekylær markør. (B) Expression profiler av
Esr Hotell og
ROS1
i LCY66T. Aktiv uttrykk for
ROS1
genet ble observert etter smeltepunkt. (C) SNP rekke CGH analyse av LCY66T. Kopitall i hele kromosom 6 er plottet som den log2 forholdet.
RT-PCR og Sanger-sekvensering analyse av 569 LADC prøver fra japansk individer, inkludert de ovennevnte tilfeller (343 tilfeller med tidlig stadium og patologisk 226 tilfeller med avansert stadium), identifisert fire tilfeller skjuler denne fusjon transkripsjon (Figur S2). Alle fire
Esr-ROS1
fusion-positive tilfeller var kvinner, og næret verken
EGFR Twitter /
KRAS /HER2
mutasjoner eller
EML4-ALK /KIF5B-RET
fusjoner. Tre tilfeller var dårlig differensierte adenokarsinomer av som aldri har røykt, og den andre var en moderat differensiert adenokarsinom i en røyker.
Transforming Aktivitet av Esr-ROS1
Esr-ROS1
cDNA isolert fra tumorprøven kodet for et protein på 858 aminosyrer (figur 2A; GenBank /DDBJ aksesjonsnummer AB698667). Proteinet forbinder FERM domenet [18] til ezrin (Esr) med transmembran og kinase-domener av ROS1, men mangler det meste av kveil-spiral domene av Esr.
(A) Skjematisk representasjon av Esr, ROS1 , Esr-ROS1, og slettinger /mutasjoner av Esr-ROS1 gener. Domenet organisasjon vises. C-C: coiled-spole domene; TM: transmembrane; C-ERMAD: C-terminal ERM tilknyttet domene. (B) ROS1 fosforylering i villtype og mutant Esr-ROS1 (E /R) -expressing NIH3T3 kloner. Cellelysater fra hver klon ble immunoblottet med anti-V5-tag (øverst) og anti-fosforylert ROS1 (Tyr-2274, nederst) antistoffer. (C) Undertrykkelse av ROS en kinase aktivitet Esr-ROS1 av crizotinib hemmer STAT3 aktivering. NIH3T3 celler transfektert med en: tom vektor, 2: villtype Esr-ROS1, 3: KD 4: DL1, 5: DL3 ble serum utsultet og behandlet for to timer med DMSO eller 1fiM av crizotinib, og immunoblottet med de relevante antistoffer . β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. E /R: Esr-ROS1, p-E /R: fosforylert Esr-ROS1 oppdaget med en anti-fosfotyrosin-2274 antistoff av ROS1. (D) Myk agar-kolonidannelse av villtype og mutant Esr-ROS1 uttrykkende NIH3T3-kloner. Et representativt bilde av kolonidannelse for hver klon er plottet på toppen (skala bar, 100 mikrometer). Antallet kolonier som oppnås for hver klon er plottet på bunnen. * P 0,05. (E) Crizotinib-indusert undertrykkelse av forankringsuavhengig vekst av NIH3T3 celler som uttrykker Esr-ROS1. Stolpediagram som viser prosentdelen av NIH3T3 kolonier som induseres av
Esr-ROS1
eller
CCDC6-RET
etter behandling med 200 nM av crizotinib eller vandetanib i forhold til de som dannes ved DMSO-behandlede celler. EZ-ROS: Esr-ROS1, C6-RET: CCDC6-RET. * P 0,05. (F) Representative bilder av mus subkutant transplantert med NIH3T3 celler som uttrykker vill-type, kinase domene-mutert, eller amino-terminal-slettet Esr-ROS1. En EML4-ALK-uttrykkende NIH3T3-klonen ble anvendt som en positiv kontroll. Antallet svulster per injeksjon i hvert transfektant er vist under bildene.
For å undersøke onkogene aktiviteten til
Esr-ROS1
fusjon
in vitro
, vi etablert en stabil NIH3T3-kloner som uttrykker villtype Esr-ROS1 og kinase-død mutant Esr-ROS1 (KD), hvor det ATP-bindende lysinrest ble mutert til metionin (K491M), så vel som mutanter med serielt slettet amino-terminale Ferm domener (DL1, DL2 og dl3, figur 2A). Autofosforylering av spesifikke tyrosinrester er en viktig hendelse i aktivering av forskjellige signaloverføringsveier, og Tyr-2274 til ROS1 er en spesifikk autofosforylering område nødvendig for å indusere kinase-aktivitet for transformasjon [19]. I transformasjon analyser, fosforylering av Tyr-2274 (tilsvarende Tyr-785 i villtype Esr-ROS1 fusion) ble observert i en villtype Esr-ROS1-uttrykke klone, men ble ikke oppdaget i kinase-dead (KD) og slettet (DL) mutanter; Dette innebærer at den amino-terminale del av FERM (1-88 aminosyrer) er nødvendig for ROS1 kinase aktivering (figur 2B). Villtype
Esr-ROS1
men ikke kd /DL-mutanter spesifikt indusert aktivering av STAT3 for nedstrøms signalering, og produserte signifikant forankrings-uavhengig vekst (figur 2C, D). Forankringsuavhengig vekst indusert av
Esr-ROS1
ble undertrykt ved behandling med crizotinib, en TKI mot ALK /MET /ROS1, mens veksten indusert av en annen onkogen av lunge,
CCDC6-RET
[11] ble ikke (figur 2E). Tvert imot, vandetanib, en TKI mot RET /EGFR /VEGFR var effektiv i å inhibere kolonidannelse av CCDC6-RET uttrykkende celler, men ikke i de Esr-ROS1 uttrykkende celler. Som vist i figur 2C, crizotinib behandling trykkes fosforylering av Esr-ROS1, og inhiberer aktiveringen av STAT3.
Neste, NIH3T3-celler ble subkutant injisert inn i mus svekket immunforsvar. Villtype Esr-ROS1-uttrykke kloner alltid produsert tumorer (6/6), mens ingen av KD og DL mutanter-uttrykke kloner produserte svulster (figur 2f), som bekrefter at
in vivo
tumorigent aktivitet
Esr-ROS1
krever ROS1 kinase aktivitet.
Utvikling av LADC i Esr-ROS1 transgene mus
for ytterligere å vurdere rollen til
Esr-ROS1
i lunge carcinogenesis, genererte vi transgene mus som uttrykker fusjonsgenet under kontroll av en type 2 alveolær epitel-spesifikk overflateaktivt middel C-gen-promotoren [20] (figur 3A). Vi har oppnådd fire uavhengige linjer (TGA, B, C og D) med forskjellig kopiantallet av transgenet (fig S3) og detekteres lunge adenokarsinom knuter i alle linjene som ble undersøkt, bortsett fra TGD. Analyse av fusjonsprotein uttrykk nivået blant dem viste ingen uttrykk i TGD (figur S4). Den fødselsrate på transgene-positiv progenies var lav i TgC (Transgene-positive F1 avkom Nummer: total F1 nummer, 01:03), og vi klarte å holde oppe en TgC linje, så vi hovedsakelig analysert en linje (TGA), som havner omtrent fire eksemplarer av transgenet. RT-PCR og immunoblot analyse bekreftet lungespesifikke
Esr-ROS1
mRNA og protein uttrykk, og indikerte fosforylering av Esr-ROS1 fusjonsprotein (figur 3B). Selv om endogen
ezrin
ble allestedsnærværende uttrykt i mange vev, endogen
Ros1
-transcript ble oppdaget bare i magen, nyre og lunge. Protein expression nivåer av endogen ROS1 var meget svak i forhold til nivåene av fusjonsgenet i transgene mus (figur S4). Selv på de fire uker gamle, multiple lesjoner enn 1 mm i diameter ble påvist i de transgene mus, og tumorer, varte i over 40% av snittflaten av lunge (figur 3C og fig S5). Computertomografi undersøkelse oppdaget flere knuter i begge lungene, og musene viste redusert overlevelse (figur 3D, E). Histologisk undersøkelse av lungesvulster i transgene mus linjer generelt demonstrert adenokarsinomer med papillær /lepidic vekstmønster (figur 3C). Disse lesjonene ble vist å være invasive adenokarsinomer med moderat mitotisk aktivitet som avslørt av positive Ki-67 farging (figur S6a). Imidlertid, i noen tilfeller av TGB linjer, observerte vi akkumulering av cytoplasmisk mucin i tumorceller (figur S6b).
(A) Skjematisk presentasjon av
SP-C /Esr-ROS1 /polyA
transgen. (B) Uttrykk for den eksogene
Esr-ROS1
genet i transgene mus. RT-PCR (øverst) og immunoblotanalyse (bunnen) av musevev avslørte at Esr-ROS1 ble spesifikt uttrykt i lungene av to transgene mus (TgA21 og TgA25). HT: hjerte, LV: lever, ST: mage, SP: milt, KD: nyre, LG: lunge (C) Representant histologisk analyse av lungelesjoner i transgene mus. Hematoxylin-eosin farging viser utbredte lesjoner i både 4-ukers gamle og 15 uker gamle fusion-positive mus. Tg: fusion-positiv, CR: smelte negativ. Scale bar, 100 mikrometer. (D) Computertomografi (til venstre) av lungene i TgA04 mus i uke 19. Forbedret lesjoner i begge lungene ble oppdaget. Multiple nodulær lesjoner (til høyre) ble observert på overflaten av pleural lungen i TgC01 mus ved obduksjon. (E) overlevelseskurver for transgene og kontrollmus generert ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden.
Til tross for tilstedeværelsen av flere tumorer i lungene av de transgene mus, har vi klart å detektere fjernmetastaser ved obduksjon i TGA, B og C mus. Dermed er det sannsynlig at uttrykket av
Esr-ROS1
alene er ikke tilstrekkelig til å gjøre kreftcellene metastatisk.
Diskusjoner
Denne studien identifisert
EZR- ROS1
som en sentral driver onkogen i lunge kreftutvikling. Ezrin er ubikvitært uttrykt i mange vev. I
Esr-ROS1
fusjon oppdaget av RNA sekvensering av LADC tilfeller, 5 «del av
Esr
forårsaker avvik overekspresjon av kinase domene
ROS1
. Ingen tydelig effekt til transkripsjonsnivåer av 3-del av
Esr
ble observert. Dette kan være skyldes overflødig uttrykk for villtype
Esr
over fusjonsgenet. Vi har også vist at ROS1 kinase-aktivering i denne fusjon krever det N-terminale domenet av FERM Esr. Ferm forbinder med mange forskjellige proteiner inkludert fosfolipider, stillasproteiner EBP50 og E3KARP og andre membranassosierte proteiner som kan regulerer dimerisering eller oligomerisering av ezrin [21]. Mange fusjons kinase proteiner, inkludert ALK og RET, viser konstitutive tyrosinkinase-aktivitet som kan tilskrives dimerisering domener i den amino-terminale fusjonspartner [6], [22]. Men en annen ROS1 fusjonsprotein, FIG-ROS1, som er funnet i human glioblastom, kolangiokarsinom og lunge adenokarsinom, viste ingen dimerisering egenskaper, i stedet eksisterende som en monomer i fusjonsproteinet til tross for å beholde de kveil-spiral domener og et leucin zipper [19 ]. Derfor de molekylære mekanismene bak ROS1 aktivering av FERM domene fortsatt uklart.
Den transgene mus viste en fremvekst av flere adenokarsinom knuter på et tidlig tidspunkt, og den raske utviklingen av svulster. Disse funksjonene er stort sett lik den
EML4-ALK
mus modell [8]. Flere grupper rapporterte at mucinous cribriform mønster og signetring celle er karakteristiske histologiske trekk ved E
ML4-ALK
positiv menneskelig lungekreft [23] – [25]. Nylig undersøkte vi histopatologi av
ROS1
-FUSION positive menneskelige lunge kreft [16]. Selv om andre forskere rapporterte at signetring celle funksjonen var ikke vanlig i
ROS1
-rearranged lungekreft [10], fant vi at 53% av tilfellene næret mucinous cribriform eller signetring celle funksjoner som ligner på den
ALK
-rearranged lunge kreft, men at resten viste papillær /lepidic vekstmønster.
Esr-ROS1
-positive svulster virket mindre godt differensiert, og viste oftere histologiske trekk ved mucinous cribriform eller signetring celle. Vår musemodell for
Esr-ROS1
lungekreft generelt vist papillær /lepidic vekstmønster, men i enkelte tilfeller observerte vi akkumulering av cytoplasmisk mucin i tumorceller, noe som ganske ligner den karakteristiske histologi rapportert i
ROS1
-rearranged lungekreft. Foreløpig har vi ikke noe svar på hvorfor bare en del av mus næret svulster med mucin akkumulering.
Esr-ROS1
fusjonsgenet ble spesielt påvist i lungekreft eksemplarer av kvinnelige aldri-røykere uten
EGFR, KRAS, etter og
ALK
endringer. Det ble anslått at ca. 2% av pasientene i White og asiatiske lungekreft kohorter hadde
ROS1
-rearrangements, som oppstår ved betydelig høyere priser i yngre, røykfrie, kvinnelige individer [10], [11], [16]. Selv om hver endring er sjeldne,
ROS1
fusjoner med mange typer 5 «partner gener (
CCDC6, CD74, Esr, figur, KDELR2, LRIG3, SDC4, SLC34A2 og TPM3
) har blitt rapportert i lunge, hjerne, galleveier, og eggstokk-kreft [9] – [16], [26] – [28]. Disse
ROS1
-rearranged svulster kan være målrettet terapeutisk med bestemte kinase hemmere, inkludert crizotinib [10], [14], [27], [29]. To LADC pasientene hadde en bemerkelsesverdig klinisk respons på crizotinib [10], [14]. Dermed vår
Esr-ROS1
lungekreft dyremodell kan være verdifulle for å vurdere det terapeutiske potensialet i disse forbindelsene og nye medikamenter samt biologiske funksjonene i
ROS1
-rearranged lungekreft
in vivo
.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Vevsprøver fra lungekreftpasienter ble levert av National Cancer Center Biobank, Japan. Med høy molekylvekt genomisk DNA og RNA ble ekstrahert fra frisk frosne vevsprøver og ikke-kreft lungevev. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. Studien protokollen ble godkjent av etisk komité National Cancer Center, Tokyo, Japan.
Analyse av Whole-transkriptomet sekvensdata
Sett cDNA bibliotek (150-200 bp) ble fremstilt fra 2 mikrogram total RNA bruker mRNAseq Prøvepreparering Kit (Illumina). Bibliotekene ble utsatt for parvise slutten sekvensering av 50 bp på HiSeq2000 (Illumina), i henhold til produsentens instruksjoner. Parvise end leser ble kartlagt til kjente RNA-sekvenser i RefSeq, Ensembl, og LincRNA databaser med Bowtie programmet som beskrevet tidligere [30].
RT-PCR, Genomisk PCR og sekvense
Total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp Hevet III (Life Technologies). cDNA eller genomisk DNA ble utsatt for PCR forsterkning ved hjelp av Ex-Taq (Takara Bio) og primere Esr-e10-CF1 (GAAAAGGAGAGAAACCGTGGAG) og ROS1-E34-CR1 (TCAGTGGGATTGTAACAACCAG). PCR-produktene ble direkte sekvensert av Sanger-sekvensering ved hjelp av BigDye terminator kit (Life Technologies).
SNP Array CGH Analyse
kromosom kopiere nummer for svulstene ble bestemt ved hjelp av høy oppløsning SNP arrays ( Genechip Mapping 250K-Nsp array, Affymetrix). Genomisk DNA ble merket og hybridisert til SNP arrays i henhold til produsentens anvisninger, og kopiere tallene ble beregnet fra hybridisering signaler ved hjelp av CNAG programmet [31].
Vector Cloning, og Generering av sletting og Point Mutants
Den kodende regionen til
Esr-ROS1
cDNA ble oppnådd ved PCR forsterkning fra LCY66 tumor cDNA ved hjelp Phusion Taq polymerase (New England Biolabs) og primere Esr-H1F1 (CACCATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTT) og ROS1-H1R1 ( ATCAGACCCATCTCCATATCCACTGTG).
EML4-ALK
cDNA og
CCDC6-RET
cDNA ble forsterket av en
EML4-ALK
-positivt primær lungekreft prøve (E13, A20) og fra en
CCDC6-RET
-positivt primær lungekreft prøve (C1; R12), henholdsvis. PCR-produktene ble subklonet inn en pcDNA3.1D-V5-His plasmid (Life Technologies). Utskifting av lysin med metionin ved kodon 491 i
Esr-ROS1
genet ble utført ved hjelp av en primestar seterettet mutagenese kit (Takara Bio). N-terminale sletting mutanter av den FERM domenet til
Esr-ROS1
cDNA ble konstruert ved PCR hjelp av primere Esr-FERM-AF (CACCATGGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATC) og ROS1-H1R1 for DL1, Esr-FERM-BF (CACCATGATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAG) og ROS1-H1R1 for DL2, og Esr-FERM-CF (CACCATGACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGC) og ROS1-H1R1 for DL3. Plasmidene ble transfisert inn i NIH3T3-celler ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies), og stabile kloner ble isolert ved G418-seleksjon (0,7 mg /ml). For kolonidannelse analysen ble cellene innleiret og dyrket i 0,4% myk agar i triplikat og antall kolonier ble tellet etter 21 dager. Kvantifisering av forankringsuavhengig vekst under tilstanden med eller uten crizotinib (S1068, Selleck) og vandetanib (S1046, Selleck) etter 9 dager ble utført med CytoSelect-96 kit (Cell Biolabs). Forbindelsen ble tilsatt til det øverste laget av myk agar hver 3. dag.
immunoblotanalyse
Hele cellelysatene ble ekstrahert med CelLytic M-reagens (# C2978, Sigma), og underkastet SDS siders fulgt av blotting på en PVDF membran. Påvisning av Western blot ble utført med WesternBreeze Chemiluminescent immundeteksjon kit (Life Technologies) ved hjelp av primære antistoffer mot ROS1 (# 9202, Cell Signaling Technology), fosforylert-ROS1 (Tyr2274) (# 3078, Cell Signaling Technology), STAT3 (# 610189, BD), fosforylert-STAT3 (Tyr705) (# 9138, Cell Signaling Technology), P44 /42 MAPK (# 4695, Cell Signaling Technology), fosforylert-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 9106, Cell Signaling Technology) , ezrin (# 4135, Cell Signaling Technology), p53 (# 6243, Santa Cruz), og b-aktin (# A5441, Sigma).
Undertrykkelse av ROS en kinase aktivitet av Esr-ROS1 av Crizotinib
transfekterte NIH3T3-celler (tom vektor, villtype Esr-ROS1, KD /DL-mutanter) ble serum-sultet i 2 timer, deretter tilsatt i 2 timer med 1% DMSO eller 1 uM crizotinib, deretter kulturmediet var endret med standard 10% FBS medium i 10 min. Hele cellelysater ble utsatt for immunoblot analyse.
Subkutan Transplantasjon i svekket immunforsvar Mus
Det er totalt 1 × 10
6 celler ble injisert subkutant i hårløse mus (BALB /c- nu /nu, CLEA Japan). Mus ble overvåket daglig for tumordannelse. Alle dyr prosedyrer ble utført med godkjenning av dyreetiske komité for National Cancer Center.
Generation og Undersøkelse av
Esr-ROS1
transgene mus
FLAG-merket
Esr-ROS1
cDNA ble subklonet i en
SPC-iNOS
plasmid (gitt av Dr. Hagiwara), som inkluderte en
SPC
promoter og et polyadenyleringssignal, ved å erstatte
iNOS
fragment med cDNA. Uttrykket kassetten med
SPC
promoter ble fjernet fra konstruksjonen og injisert i pronuclear stadium embryoer fra C57BL /6J mus (Unitech Japan). Kopiantallet av transgenet ble bestemt ved Southern blot-analyse av DNA fra halene av dyr. Transgene linjer ble opprettholdt ved tilbakekryssing til C57BL /6 mus. Total RNA ble isolert fra de organer transgene mus og utsatt for RT-PCR-analyse for å påvise
Esr-ROS1
, endogen
Ros1
, endogen
ezrin Hotell og
GAPDH
mRNA. For å detektere Esr-ROS1 proteiner, endogene ROS1 og ezrin i vev ble lysert homogenater kastet immunoblotanalyse ved anvendelse av anti-ROS1, anti-ezrin og anti-β-aktin-antistoffer. Undersøkelse av lungesvulster i levende dyr ble utført med en X-ray CT apparat (Utforsk mikro-CT, GE Healthcare). Lunge vev ble fiksert i 10% formalin og parafin-embedded. Hematoxylin-Eosin farging og immunhistokjemi for Ki67 ble utført som tidligere beskrevet [32].
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Påvisning av
Esr-ROS1
genomisk stoppunkt veikryss. Elektroferogrammet for Sanger-sekvensering av genomiske fragmenter som omfatter
Esr-ROS1
stoppunkt krysset LCY66 svulst. Genomisk PCR produktene forsterket av Esr-e10-CF1 og ROS1-e34-CR1 primere ble direkte sekvensert med Esr-e10-CF1 primer. Tall over elektroferogrammet indikere genomisk posisjon i kromosom 6 (human genome bygge 37.3). En genomisk fragment på 35 bp av
Esr
intron 10 ble snudd i intron før fusjon til
ROS1
intron 33.
doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s001
(PDF)
Figur S2.
Påvisning av fusion genet transkripsjoner i kliniske prøver ved RT-PCR. Representative RT-PCR resultater viser fusion-positive og fusion-negative tilfeller ved hjelp av primere Esr-e10-CF1 og ROS1-e34-CR1. M: molekylær markør, NC: negativ kontroll. RT-PCR for villtype
Esr
transkripsjon (primere Esr-e4-CF1 og Esr-E7-CR1) og for
GAPDH plakater (primere for GAPDH-F og GAPDH-R) er . også vist
doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s002 product: (PDF)
Figur S3.
Kopier nummer analyse av transgenet i transgene mus. Genomisk DNA ble isolert fra haler av transgene mus som genereres fra pronuclear-trinns C57BL /6J embryoer. Denne gDNA ble deretter utsatt for Southern blot-analyse med et PCR-amplifisert SPC promoter-fragment på 464 bp, ble generert ved anvendelse av primere SPC-pro-F og SPC-pro-R, som en probe. Kontrollprøver på høyre besto av mus genomisk DNA med de indikerte kopier av transgenet pr diploid genom. ID-numrene av mus positive for transgenet vises øverst
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056010.s003 product: (PDF)
Figur S4.
Gene uttrykk i transgene mus. Ekspresjon av genene som er angitt på venstre side ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR eller immunoblotanalyse. I RT-PCR for å amplifisere PCR-sykluser målgener ble vist ved høyre side. Ezrin viste allestedsnærværende endogen uttrykk, men endogent Ros1 uttrykk var lav. Ingen ekspresjon av Esr-ROS1 fusjonsprotein ble detektert i TGD linje mus (*). SW480 ble anvendt som en negativ kontroll for fusjon ekspresjon. HT: hjerte, LV: lever, ST: mage, SP: milt, KD: nyre, LG. Lunge
doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s004 product: (PDF)
Figur S5.
Lung svulst utvikling i transgene mus. Lunge vev av TGA mus var cross-seksjonert og histologisk karakterisert. Antall og størrelse av lesjonene ble kartlagt i fusjons-positive mus (Tg) og fusjons-negative mus (CR) ved 4 uker og 15 uker etter fødselen. (A) tumor-lesjoner ble klassifisert langs sin størrelse i diameter (mm), og talt. (B) Tumor belegg ble beregnet ut fra den utledede tumorområdet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056010.s005 product: (PDF)
Figur S6.
Histologisk karakterisering av lungesvulster i transgene mus. (A) Hematoxylin-eosin-farging av en mus lunge viser invasiv lungeadenokarsinom omgir en lunge fartøy (a1). Høyere forstørrelse av tumoren (a2). Positive Ki-67 farging i tumoren (a3). Scale bar, 100 mikrometer. (B) Hematoxylin-eosin farging av en mus lunge viser cytoplasma mucin i lunge adenokarcinomceller (b1). Høyere forstørrelse av tumoren (b2). Scale bar, 200 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0056010.s006 product: (PDF)
Takk
Vi takker Dr. K. Hagiwara (Saitama Medical University ) for å tilveiebringe den SPC-iNOS plasmid, Drs. Y. Nanya og S. Ogawa (University of Tokyo) for å gi CNAG programmet, og Ms N. Okada, H. Shimizu, A. Kokubu, T. Urushidate, S. Ohashi og W. Mukai for deres utmerkede teknisk assistanse.
