Abstract
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) har en dårlig prognose og er assosiert med høye nivåer av psykiske plager. Vi har vist at beta-adrenerge reseptorer (β-ARS), som aktiveres av spennings neurotransmittere, regulere PDAC celler via cyklisk AMP (cAMP) -avhengig signalering in vitro, at sosialt stress fremmer PDAC progresjon i mus xenotransplantater og at γ-aminobutyric syre (GABA) hemmer disse responser in vitro og in vivo. Den målrettede hemming av stressutløst regulatoriske trasé kan avskaffe den potensielt negative effekten av psykologisk stress på kliniske resultater. Vår nåværende data viser at kronisk eksponering av PDAC cellelinjer Panc-1 (aktivepunktmutasjoner i K-ras) og BXPC-3 (ingen mutasjoner i K-ras) in vitro til stress nevrotransmitter adrenalin på konsentrasjon (15 nM) tidligere målt i serum hos mus eksponert for sosialt stress betydelig øket proliferasjon og migrasjon. Disse svarene ble hemmet på en konsentrasjonsavhengig måte av celekoksib. Virkningene av celecoxib alene og i kombinasjon med γ-aminosmørsyre (GABA) på progresjon av subkutane mus xenografter fra cellelinjen (BXPC-3) mest mottakelig for adrenalin ble deretter undersøkt i nærvær og fravær av sosial stress. Kreft-stimulerende faktorer (VEGF prostaglandin E
2 [PGE
2]) og nivåer av cAMP ble målt ved immunologiske analyser i blod og xenograft vev. Fosforylering av signaliseringsproteiner ERK, CREB, Src, og AKT ble bestemt ved ELISA-analyser og Western blotting. Ekspresjon av COX-2, 5-lipoksygenase, og p-5-LOX ble bestemt ved semi-kvantitativ Western blotting. Celecoxib alene betydelig hemmet xenograft progresjon og redusert systemisk og tumor VEGF, PGE2, og cAMP samt fosforylerte signalanlegg proteiner i stress-eksponert og stress-fri mus. Disse svarene ble betydelig forbedret ved samtidig behandling med GABA. Den celecoxib-indusert nedregulering av COX-2-protein og p-5-LOX var også betydelig forbedret ved GABA under begge eksperimentelle betingelser. Våre funn identifisere målrettede hemming av stressutløst trasé som et lovende område for mer effektiv kreft intervensjon i bukspyttkjertelkreft
Citation. Al-Wadei HAN, Al-Wadei MH, Ullah MF, Schuller HM (2012) Celecoxib og GABA samarbeide hindre progresjon av kreft i bukspyttkjertelen in vitro og i xenograft modeller av Stress-Free og Stress-Exposed Mus. PLoS ONE 7 (8): e43376. doi: 10,1371 /journal.pone.0043376
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 12 mars 2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 16 august 2012
Copyright: © Al-Wadei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble finansielt støttet med tilskudd RC1CA144640 og RO1CA042829 med National Cancer Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Kreft er ansvarlig for omtrent 13% av dødsfall på verdensbasis og er fortsatt den nest største dødsårsaken i USA, står for nesten én av fire dødsfall [1]. Statistisk sett er kreft i bukspyttkjertelen den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i utviklede land og har en 5-års overlevelse under 5% [2], [3]. Det er en av de mest dødelige neoplastiske sykdommer, som det vanligvis er asymptomatisk før det har nådd et avansert stadium når effektive behandlinger er unavailing. På tidspunktet for diagnose, er de fleste bukspyttkjertel kreft derfor ubrukelige og har spredning til fjerntliggende organer. I tillegg er denne malignitet vanligvis svarer til konvensjonelle radio-og kjemoterapi, noe som resulterer i en dødelighet nær 100% i løpet av 6 måneder etter diagnose [3]. Nye strategier for forbedring av kreft i bukspyttkjertelen intervensjon er derfor stort behov
Psykologisk stress som en mulig modulator av kreft progresjon har nylig dukket opp som en ny og viktig område for kreftforskning [4] -. [6]. Det har således vist seg at veksten og utviklingen av de mest vanlige humane kreftformer, inkludert adenokarsinom i magen [7], tykktarm [8], prostata [9], brystkjertel [10], [11], eggstokk [12] , lunge [13], [14] og bukspyttkjertel [15], [16], er betydelig stimulert av beta-adrenerg reseptor (β-AR) signalering initiert av stress nevrotransmitterne noradrenalin og adrenalin. Det er også blitt vist at epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR) veien aktiveres i kreft i bukspyttkjertelen celler av beta-adrenerge, PKA-avhengig transaktivering av EGFR [17]. I tillegg, p-ARS regulere produksjonen av arachidonsyre (AA) i kreft i bukspyttkjertelen celler [15], noe som resulterer i dannelse av kreftfrem stimulerende AA metabolitter. Nyere undersøkelser med kreft i bukspyttkjertel xenotransplantater fra cellelinjer BxPC-3 og PANC-1 i mus eksponert for sosialt stress er videre avslørt betydelig stress-fremkalt vekststimulering av xenotransplantater i forbindelse med aktivering av flere signaliseringsproteiner, inkludert ERK, CREB, Src, og AKT [18], hvorav de fleste er overuttrykt i bukspyttkjertelkreft [19] – [21]. Disse funnene tyder på at psykologisk stress kan redusere effekten av kreft intervensjonsstrategier. Den målrettede hemming av stressutløst signalkaskader kan derfor lindre den negative effekten av stress på kliniske resultater og også redusere forekomsten av kreft i bukspyttkjertelen utvikling hos personer med risiko på grunn av allerede eksisterende diabetes, pankreatitt, eller kronisk røyking [22].
den selektive cyklooksygenase 2 (COX-2) inhibitor Celecoxib blokkerer dannelsen av COX-2-medierte, kreft-stimulerende AA metabolitter og har vist lovende preklinisk og klinisk anti-tumor-aktivitet i en rekke humane tumorer, inkludert pankreatisk kreft [23] – [25]. Celecoxib inhiberer selektivt COX-2-aktivitet, noe som i sin tur regulerer flere baner i bukspyttkjertelkreft [26]. Sterke bevis tyder på at i tillegg COX-2 spiller også en viktig rolle i utvikling og progresjon av mange tumorer som ikke er pankreatiske [27]. COX-2 er sterkt uttrykt i en rekke humane kreftformer og kreft cellelinjer, inkludert tykktarms [28], mage [29], plateepitel karsinom i hode og nakke [30], cervical [31], ikke-småcellet [ ,,,0],32], bryst [33], prostata [34], og kreft i bukspyttkjertelen [35]. På den annen side, gamma-aminosmørsyre (GABA) virker som en fysiologisk inhibitor for β-adrenerge kaskade, en effekt transduseres intracellulært i kreft i bukspyttkjertelen celler ved Gα
i-koplet serpentin GABA-B-reseptoren som reduserer dannelsen av syklisk AMP (cAMP) ved å hemme adenylylcyklase aktivering [18], [36].
i denne studien har vi undersøkt effekten av kronisk eksponering for stress neurotransmitter adrenalin i en konsentrasjon (15 nM ) tidligere målt ved oss i serum hos mus eksponert for sosialt stress [18] på proliferasjonen og migreringen av PDAC cellelinjer Panc-1 og BXPC-3 in vitro og utforsket potensielle hemmende virkninger av celecoksib på disse responser. Vi så brukt en etablert metode for eksperimentell induksjon av kronisk sosialt stress er den dominerende form av psykologisk stress hos mennesker [37], i mus som bærer xenografter fra cellelinjen (BXPC-3) som var mest mottakelig for adrenalin in vitro, for å undersøke de potensielle hemmende effektene av celecoxib og GABA alene og i kombinasjon med xenograft progresjon i stress-fri og stress-eksponerte dyr. Celecoxib alene viste sterke krefthemmende virkninger under begge disse eksperimentelle forhold, mens kombinasjonsbehandling med GABA betydelig forbedret alle undersøkte forebyggende utfall. Denne studien har implikasjoner for kreft progresjon og forebygging i populasjoner henhold kronisk psykiske plager som følge av samfunnsøkonomiske og personlige utfordringer, som acerbated ytterligere når en person er diagnostisert med en livstruende sykdom som kreft i bukspyttkjertelen.
materialer og metoder
Culture of cancer Cell Lines
De godkjente (RADIL, Columbia, MO), menneskelige kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer BXPC-3 (witout ras mutasjoner) og Panc-1 (uttrykker aktive punktmutasjoner i K-ras) opprinnelig kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) ble dyrket i RPMI-1640 med 10% føtalt bovint serum uten antibiotika.
in Vitro Undersøkelser
A) Bestemmelse av celleproliferering ved MTT-assay.
kolorimetriske 3- (4, 5-dimethyle tiazol-2-yl) -2, 5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse (Sigma) ble anvendt som tidligere beskrevet [38] for å vurdere vekststimulerende effekten av kronisk adrenalin eksponering og potensielle hemmende effekt av celekoksib på denne responsen i Panc-1 og BXPC-3 celler in vitro. Kort sagt ble Panc-1 og BxPC-3-celler sådd ut i 6-brønns plater (50.000 celler per brønn). Cellene ble deretter forbehandlet med 15 nM adrenalin i 7 dager (medium som inneholder adrenalin ble erstattet hver 24. time) eller dyrket i 7 dager uten adrenalin. Celecoxib (1 nM til 100 uM) ble deretter tilsatt til cellene fra begge behandlingsgruppene. Etter en 72 timers inkubasjonstid, ble alle cellene høstet.
B) Vurdering av celle migrasjon av kolo analysen.
Cell migrasjon analysene ble utført som tidligere beskrevet [36], bruker 6-brønn plater med filterinnsatser levert av kolo celle migrasjon analysesett (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA). PANC-1 og BxPC-3-celler ble forbehandlet med 15 nM epinefrin i 7 dager (medium inneholdende epinefrin ble erstattet hver 24 timer) i vevsdyrkingskolber eller dyrket uten epinefrin i 7 dager. Celler fra begge behandlingsgruppene ble deretter sådd ut innsatsene og behandlet med celekoksib (1 nM til 100 uM) i 24 timer. Den vandrende evnen til cellene ble deretter vurdert ved leverandørens anvisninger.
C) Statistisk evaluering av in vitro data.
Data (n = 5) i kolonne grafer (Fig. 1) fra celleproliferasjon og cellemigreringsforsøk i nærvær og fravær av epinefrin kronisk behandling ble vurdert ved enveis analyse av varians, etterfulgt av Dunn multiple sammenligningstest. Data (n = 5) fra dose-respons-eksperimenter (fig. 2) med celecoxib ble tilpasset til sigmoidale dose-respons-kurver og EC
50-verdier for celecoxib ble beregnet ved ikke-lineær regresjonsanalyse ved å bruke Prism GraphPad programvare.
MTT-analyser (A) i Panc-1 (med aktivering av punktmutasjoner i K-ras) og BXPC-3 (uten ras-mutasjoner) celler in vitro. Eksponering i 7 dager til adrenalin (15 nM) signifikant (
p
0,001) økte antallet av levedyktige celler i begge cellelinjer. Cox-2-hemmer celecoxib (1 mm) fullstendig blokkert dette svaret til adrenalin (
p
0,001), mens i tillegg redusere (
p
0,001) antall levedyktige celler i celler ikke forbehandlet med adrenalin. Effektene av identiske behandlinger på cellemigrering er vist i fig. B. I begge cellelinjene migrering ble betydelig mer stimulert av kronisk epinefrin enn celleproliferasjon. Celecoxib signifikant (
p
0,001) redusert adrenalin-indusert migrering, men ikke fullstendig blokkere dette svaret. BCPC-3-celler var litt mer mottakelig for adrenalin i begge analysene, men forskjellene mellom de to cellelinjene var ikke signifikant. Kolonnene er middelverdier og standardavvik av 5 prøver pr behandlingsgruppe.
doserespons-kurver for celecoxib i Panc-1 og BXPC-3-celler in vitro i nærvær og fravær av forbehandling i 7 dager med adrenalin (15 nM). Tall A og B viser celleproliferasjonsprosesser responser i MTT-analyser mens tall C og D viser celle migrasjon svar. Mens både mobilsvar like blant de to cellelinjer, EC
50 verdier for celekoksib i fig. B, C og D var signifikant (
p
0,001) lavere i cellene forbehandlet for 7 dager med adrenalin. Datapunkter er middelverdier og standardavvik (n = 5). EF
50 verdier og kurve ble etablert av lineær regresjonsanalyse for sigmoidal dose-respons.
In vivo undersøkelser
A) Animal eksperiment.
seks uker gamle hann atymiske nakne mus ble kjøpt fra Harlan Sprague Dawley. Dyret forskning protokollen ble godkjent av University of Tennessee Institutional Animal Care og bruk komité. Musene ble akklimatisert for en uke og holdes i våre forsøksdyravdeling i overensstemmelse med retningslinjer i American Association of Laboratory Animal Care under standard laboratorieforhold som temperatur, fuktighet og lys styres, og hadde fri tilgang til autoklaveres Purina Rodent Chow mat og autoklaveres vann. Ved å følge en-ukes akklimatisering, ble ørene til musene merket for å lette overvåkning av hvert dyr, som deretter ble tilfeldig inndelt i seks behandlingsgrupper (
n
= 20), med 5 mus per bur. Før tumorcelle inokulering, ble musene i de tre psykologisk stress gruppene utsettes for sosialt stress i 4 uker i henhold til den publiserte fremgangsmåten [37] ved å endre gruppen sammensetningen av hvert bur to ganger i uken. BXPC-3-celler som hadde nådd 75% konfluens i kultur ble så inokulert subkutant i flanken området (3 x 10
6 i 0,2 ml PBS, levedyktighet 95%) av dyr fra hver av disse gruppene. Sosialt stress ble videreført i disse tre gruppene i ytterligere 30 dager. Tre andre grupper av mus som ikke var utsatt for sosialt stress ble også inokulert med identiske numre for kreft i bukspyttkjertelen BXPC-3 celler. En gruppe hver fra sosialt stress og ikke-sosialt stress populasjoner ble behandlet ved intraperitoneal injeksjon av celecoxib (Celebrex, Pfizer, 25 mg /kg kroppsvekt, 5 dager /uke i 30 dager). I tillegg en gruppe hver fra sosialt stress og ikke-sosialt stress populasjoner ble samtidig behandlet av innledende intraperitoneale injeksjoner av celekoksib (25 mg /kg kroppsvekt, 5 dager /uke i 30 dager), og deretter GABA (Sigma, 10 mg /kg kroppsvekt , 5 dager /uke i 30 dager) umiddelbart deretter på musens motsatt side. Alle dyrene ble observert i 30 dager etter inokulering med kreftceller. Tumor størrelser ble bedømt ukentlig av digitale skyvelære, og to vinkelrette diametere (lengde og bredde) av hver xenograft ble målt ved hjelp av følgende formel: Tumor volum = (lengde /2) x (bredde
2). Vekten av dyrene ble fulgt gjennom hele forsøket for å overvåke deres generelle helse tilstand og for GABA og celekoksib behandlingseffekter. Ved slutten av den 30-dagers observasjonsperioden ble dyrene avlivet ved CO
2 innånding. Blodprøver ble oppsamlet for bestemmelse av nevrotransmittere, vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), og prostaglandin E
2 (PGE
2) i serumet og av cAMP i den cellulære fraksjon av blod. Tumorene ble skåret ut, hurtigfrosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C for videre analyser.
B) immunologiske analyser for kvantitativ analyse av den andre budbringer cAMP, VEGF, PGE2, og fosforylerte signaleringsproteiner .
VEGF og PGE
2 i serum og tumor vevsprøver og cAMP i den cellulære brøkdel av blod og tumorvev prøvene ble analysert ved immunanalyser som anbefalt av produsenten (Enzo Life Sciences International). I korthet, den kit for måling av cAMP anvender et polyklonalt antistoff for å binde en konkurransedyktig måte cAMP i de standarder og prøver. Settet for måling av VEGF anvender monoklonalt antistoff mot humant VEGF immobilisert i en mikrotiterplate for å binde VEGF i standardene eller prøvene. PGE
2 kit benytter et monoklonalt antistoff mot PGE
2 til å binde i en konkurransedyktig måte PGE
2 i prøvene og standarder. Absorbansen ble avlest med en ELISA-leser ved 405 nm for cAMP, 450 nm for PGE
2, og ved 450 nm for VEGF (
n
= 5 per behandlingsgruppe). Deteksjon og kvantifisering av nivåer av p-ERK-1/2 på treonin 202 og tyrosin 204, p-CREB ved serin i 133, og p-Akt ved serinrest 473 (Invitrogen); og kinaseaktivitet av det rekombinante katalytiske domenet av p-Src (MBL International) ble utført fra tumor vevsprøver (
n
= 5 per behandlingsgruppe) ble homogenisert i RIPA-buffer og proteaseinhibitorer som anbefalt av produsentene. Absorbansen ble lest med en ELISA-leser ved 450 nm. Serum og tumor nivåer av stress nevrotransmitterne noradrenalin og adrenalin, så vel som GABA ble bestemt ved ELISA-analyser som beskrevet tidligere [14], [18] for å overvåke vellykket induksjon av psykisk stress (data ikke vist).
C) Semi-kvantitativ analyse av COX-2, 5-lipoksygenase (5-LOX) og p-5-LOX, og ikke-kvantitative visualisering av aliserte proteiner ved Western blotting.
Tre uavhengige Western blots ble utført for hvert antistoff for semi-kvantitativ vurdering av protein uttrykk ved densitometri for AA-enzymer COX-2 og p-5-LOX, ved hjelp av NIH Image J programvare. I tillegg analyser protein ekspresjon av de signalmolekyler kvantifisert ved hjelp av ELISA ovenfor ble visualisert ved ikke-kvantitative Western blot. I korthet tumorvev ble kort homogenisert i RIPA lysebuffer (Thermo Scientific), PMSF, Na
3VO
4, og 1 mg /ml aprotinin, leupeptin, pepstatin og. Etter varme denaturering ved 100 ° C i 5 minutter, ble like mengder av protein underkastet elektroforese ved anvendelse av 12% Novex SDS-polyakrylamidgeler (Invitrogen) og overført på nitrocellulosemembraner; Western blot ble deretter utført ved anvendelse av inkubering over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: total ERK1 /2, p-ERK1 /2, p-CREB, AKT p-AKT, Src, p-Src, COX-2, 5- LOX, og p-5-LOX (Cell Signaling). Total CREB og aktin ble kjøpt fra Millipore. Sekundære antistoffer ble inkubert i 1 time ved romtemperatur. Bånd ble visualisert ved ECL (Pierce, Thermo Scientific).
D) Statistisk analyse av in vivo data.
Statistisk analyse ble utført med GraphPad INSTAT programvare (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). For å teste om variasjonen mellom kolonne median av tumorvolum i de seks behandlingsgruppene (
n
= 20) var betydelig større enn forventet ved en tilfeldighet, parametriske Kruskal-Wallis ANOVA ble utført for data fra hver av de 4 ukene etter injeksjon av tumorceller. Forskjeller mellom utvalgte par av behandlingsgruppene ble i tillegg vurdert av parametriske Mann-Whitney test. Statistisk signifikans av forskjeller mellom grupper for nivåer av cAMP (
n =
5), PGE
2 (
n =
5), og VEGF (
n
= 5) i blod og vev xenograft og for p-ERK, p-CREB, p-Src, og p-AKT i tumorvevet (
n
= 5 per behandlingsgruppe) ble vurdert ved den ikke-parametriske Mann -Whitney test. Statistisk signifikans av forskjeller mellom fire densitometriske avlesninger per proteinbåndet fra tre uavhengige vestlige blotter for semi-kvantitativ vurdering av COX-2 og p-5-LOX forberedt fra tre tilfeldig valgte xenografter per behandlingsgruppe (
n
= 12) ble vurdert av den ikke-parametrisk Mann-Whitney test
Resultater
kronisk eksponering for Adrenalin øker, og Celecoxib hemmer celleproliferasjon og migrasjon
Kronisk eksponering av Panc. -1 og BxPC-3 celler til adrenalin signifikant (
p
0,0001) økt celleproliferasjon og migrasjon, med BXPC-3 celler blir mer mottakelig for adrenalin i begge analysene (fig. 1). Behandling av cellene med celecoxib (1 uM) fullstendig opphevet disse responser i begge cellelinjer (
p
0,001) (Fig. 1). Celecoxib (1 mm) også signifikant (
p
0,001) hemmet celleproliferasjon og migrasjon i unpretraeted celler fra begge cellelinjer (figur 1).. Som vist i dose-responskurvene (fig. 2), celecoxib hemmet celleproliferasjon og migrasjon i begge cellelinjene i nærvær og fravær av kronisk adrenalin pre0treatment på en konsentrasjonsavhengig måte. Antallet av levende og migrerte celler i epinefrin forbehandlede celler fra begge cellelinjene var signifikant (
p
0,001) større enn i unpretreated celler ved alle Celecoxib konsentrasjoner som ble testet, som illustrerer den sterke PDAC stimulerende effekter av adrenalin (Fig . 2). På samme tid, EC
50 Verdiene for celecoxib var signifikant (
p
0,001) lavere i epinefrin forbehandlede celler fra begge cellelinjene enn i unpretreated celler (figur 2)., Noe som tyder sterk avhengighet av adrenalin-indusert migrering på COX-2 mediert arachidonsyremetabolittene.
Modulation av xenograft Volumene av Celecoxib og GABA i stress-eksponert og ustresset Mus
Statistisk analyse av data fra alle seks behandlingsgrupper ved ikke-parametrisk ANOVA ga variasjoner blant kolonne betyr signifikant (
p
0,0001) som er større enn ventet ved en tilfeldighet i hver av de observerte 4 uker. Som tidligere rapportert [18], progresjon av xenograft vekst fra BxPC-3 bukspyttkjertelkreft cellelinje var signifikant (uke 1:
p
0,006; ukene 2-4:
p
0,0001 ved Mann-Whitney test) fremmet av psykisk stress i løpet av observasjonsperioden på 4 uker (fig 3).. Behandling av trykksvake dyr med celekoksib alene signifikant (
p
0,0001) redusert xenograft størrelser på alle tidsintervaller målt. I tillegg celecoxib alene reduserte xenograft størrelser i stress-eksponerte mus under nivåene av ubehandlede, stress-fri dyr (
p
0,001 i hver av de fire observerte uker). Behandling av trykklette mus med celekoksib i kombinasjon med GABA ytterligere forbedret veksthemmende effekter av celekoksib (uke 1:
p
0,0376, uker 2-4:
p
0,0001) . Tilsvarende samtidig behandling med GABA også økt krefthemmende effekter av celekoksib i stress-utsatt gruppe (
p
0,0001 i ukene 1-4).
Dyr ble utsatt for sosialt stress (SS), eller ikke eksponert for stress (NS) i nærvær og fravær av celecoxib (C) eller celecoxib og GABA (C + G) behandling. Den xenograft volumet betydelig høyere (
p
0,0001) av sosialt stress. Dette svaret ble betydelig hemmet av behandling med celekoksib alene (
p
0,001) eller med celecoxib og GABA (
p
0,0001). Totalt sett forskjellene i tumorvolum var statistisk signifikant (
p
0,001) mellom behandlede og ubehandlede grupper. Fotografier viser representative eksempler på transplantater for hver behandlingsgruppe.
Modulation av cAMP og PGE2 nivåer i serum og svulstvev av Celecoxib og GABA i stress-eksponert og ustresset Mus
Beta- adrenerge agonister aktiverer produksjon av AA i kreft i bukspyttkjertelen celler, som fører til COX-2-medierte dannelse av PGE2 [15]. Beta-adrenerge reseptorer [39] så vel som PGE2-reseptorer [40] er koplet til den stimulerende G-protein Gas som øker cAMP-nivåer via aktivering av adenylat cyclase. Vi målte således cAMP i den cellulære fraksjon av blod og tumorvevet og PGE2 i serum og tumorvev ved ELISA-analyser. Våre data viser at systemiske nivåer av cAMP i blodprøver og tumorvev var signifikant (
p
0,001) økt (2,8 ganger i blod og 2,5 ganger i tumorvev) i mus eksponert for stress . Denne stressrespons i blodceller og svulster var signifikant (
p
0,001) redusert ved behandling med celecoxib alene, en effekt som forsterkes ytterligere (
p
0,001) ved kombinasjon med GABA (fig. 4A). De observerte nivåene av PGE2 i serum og tumorvev fulgt et lignende mønster, med signifikant (
p
0,0001) øker i stressutsatte dyr, svarene signifikant (
p
0,001 ) redusert med celekoksib alene og ytterligere redusert ved celekoksib /GABA kombinasjon (fig. 4B). Kombinert celekoksib /GABA behandling i tillegg signifikant (
p
0,001). Redusert systemisk og tumor nivåer av cAMP og PGE2 i ustresset mus (Fig. 4A, 4B)
cAMP ble vurdert i cellulær fraksjon av blod og i vev xenograft (A) og nivåer av PGE
2 i serum og vev xenograft (B). Sosialt stress økte nivåer av begge faktorer signifikant (
p
0,001), svarene signifikant (
p
0,001) redusert med celekoksib. Kombinert celekoksib /GABA signifikant (
p
0,001) forbedret hemmende effektene av celecoxib (
p
0,001) på systemiske og kreft nivåer av cAMP og PGE2 i stress gratis og sosialt stress -exposed mus. Kolonner er gjennomsnittsverdier og SD av 5 tilfeldig utvalgte prøver per behandlingsgruppe.
nedregulering av fosforylert Melde Proteiner i tumorvev etter Celecoxib og GABA i stress-eksponert og ustresset Mus
det har tidligere vært vist at β-adrenerg signale fosforylerer flere signaleringsproteiner i humane kreft i bukspyttkjertelen celler in vitro, inkludert CREB, ERK, Akt, og Src [17], [38], og at de fosforylerte former av disse proteinene blir også indusert i kreft i bukspyttkjertelen xenografter av stressutsatte mus [18]. Vi visualisert derfor ekspresjon av de fosforylerte og ufosforylerte former av disse proteiner i tumorvev ved hjelp av Western blotting og fast kvantitative endringer i fosforylering nivåer ved ELISA-analyser. Stress-induserte (
p
0,0001) fosforylering av hver av disse ble undersøkt signaliseringsproteiner var signifikant (
p
0,0001) redusert ved behandling med celcoxib alene, en effekt signifikant (
p
0,0001) økes ved den ytterligere behandling med GABA (figur 5 A-D).. I tillegg er kombinert behandling med celecoxib og GABA signifikant (
p
0,0001). Redusert ekspresjon av de fosforylerte former av alle undersøkte aliserte proteiner i mus som ikke er utsatt for påkjenninger (Fig. 5 A-D)
Western blots (A og B) som illustrerer induksjon av p-ERK, p-CREB, p-AKT og p-Src etter sosial stress og inhibering av disse reaksjoner ved celcoxib alene eller celecoxib + GABA. Kvantitativ vurdering av disse forandringer på proteinnivået ble bestemt i ELISA-analyser er vist i Figur C og D. Induksjon av alle undersøkte fosforylerte proteiner ved sosialt stress (SS) var signifikant (
p
0,001). Inhibering av disse responser celcoxib alene eller en kombinasjon av celecoxib + GABA var signifikante (
p
0,001) for alle fosforylerte proteiner. Kolonner i grafene (C og D) er gjennomsnittsverdier og SD av kvantitative ELISA immunanalyser fra fem tilfeldig utvalgte xenografter per behandlingsgruppe.
Modulation av COX-2 og 5-LOX i tumorvev etter Celecoxib og GABA i stress-eksponert og ustresset Mus
enzymet COX-2 katalyserer dannelsen av prostaglandiner som PGE2 fra AA, mens 5-LOX formidler den metabolske konvertering av AA til leukotriener [41]. Begge enzymer er ofte overuttrykt i bukspyttkjertelkreft [42], og fosforyleringen av 5-LOX i Ser-271 fremmes ved AA, en prosess katalysert av flere kinaser, inkludert PKA [43]. Vi undersøkte derfor uttrykket nivåer av COX-2, 5-LOX, og p-5-LOX ved semikvantitativ Western-analyse i de seks behandlingsgrupper på vårt eksperiment. Våre data viser at stress signifikant (
p
0,0001) indusert ekspresjon av COX-2 og p-5-LOX (2,7 ganger og 2,9 ganger i henholdsvis Fig. 6A, 6B). Celekoksib alene signifikant (
p
0,001) redusert stress-indusert oppregulering av COX-2, en betydelig effekt (
p
0,001) forsterkes av den ekstra behandling med GABA (Fig . 6A, 6B). I tillegg er den kombinerte behandling med celecoxib og GABA signifikant (
p
0,0001) downregulated ekspresjon av COX-2 (0,4 ganger) og p-5-LOX (0,5 ganger) i mus som ikke er utsatt for påkjenninger .
Western blot (A) er representative for tre uavhengige blotter fremstilt av tre tilfeldig utvalgte xenografter per behandlingsgruppe. Semi-kvantitativ densitometry av bandene fra tre uavhengige vestlige blotter viste signifikant (
p
0,0001) øker i protein uttrykk av sosialt stress. Disse svarene i sin tur ble betydelig redusert ved celekoksib behandling alene (
p
0,001) eller med celecoxib og GABA (
p
0,0001). Kolonner i grafen (B) er gjennomsnittsverdier og SD av fire densitometriske avlesninger per bandet justert for aktin i uavhengige blotter fremstilt av tre tilfeldig utvalgte xenografter per behandlingsgruppe.
Modulation av VEGF i serum og svulstvev av Celecoxib og GABA i stress-eksponert og ustresset Mus
VEGF er den mest potente og spesifikke angiogen vekstfaktor [44]. Sosialt stress signifikant (
p
0,001) økte VEGF nivåer i både serum (1,8 ganger) og transplantater (1,7 ganger) av mus som bærer xenografter fra BxPC-tre cellelinje. Celekoksib alene signifikant (
p
0,001) redusert begge responser mens kombinasjonsbehandling med celekoksib /GABA fullstendig blokkert stress-indusert induksjon av VEGF i serum og svulstvev (Fig 7.). I tillegg celekoksib pluss GABA signifikant (
p
0,001) redusert VEGF under basisnivå (
p
0,001). I ustresset mus (Fig. 7)
Sosialt stresset signifikant (
p
0,001) økte VEGF nivåer i både serum og transplantater, en respons signifikant redusert med celecoxib (C,
p
0,001), mens celecoxib og GABA ( C + G) behandling fullstendig blokkert stress-indusert induksjon av VEGF i serum og tumorvev. I tillegg celekoksib pluss GABA betydelig redusert VEGF under basalnivået hos mus ikke utsettes for stress (
p
0,001). Kolonner er gjennomsnittsverdier og SD av fem tilfeldig utvalgte prøver per behandlingsgruppe.
Diskusjoner
Våre data generert in vitro og i xenograft musemodeller foreslår, for første gang, at kronisk eksponering for adrenalin av psykisk stress betydelig stimulere utviklingen av PDAC via mekanismer primært drevet av COX-2 avhengige arachidonsyremetabolittene. Videre vår in vitro identifisere begge, celleproliferasjon og migrasjon som mekanismene som er involvert i stress-indusert PDAC progresjon. Kollektivt, våre funn tyder på at den selektive COX-2-inhibitor celecoxib kan ha sterke hemmende effekter på stress-indusert progresjon av PDAC og at kombinasjonsbehandling av dette middel med det hemmende neurotransmitter GABA kan gi en vesentlig bedre kliniske resultater i fravær og nærvær av psykologisk understreke.
